PtNF-Ys基因在油松花发育早期的表达与功能分析

Expression Characteristics and Functional Analysis of PtNF-Ys Gene during Early Flower Development in Pinus tabuliformis

摘要

为解析油松（Pinus tabuliformis）种子园童期长、产量低的成因并探索其调控机制，以山西吴城国家油松种子园成年油松为材料，对7—10月中旬的顶端分生组织进行转录组测序，研究花芽发育早期阶段开花相关基因的表达特征，解析核因子Y（NF-Y）家族成员的生物学功能。结果表明：PtNF-YB8等多个NF-Y家族基因在10月中旬表达量显著升高。启动子分析显示，PtNF-YB8基因含有赤霉素（GA）响应、光响应等顺式作用元件；对顶芽进行GA处理后PtNF-YB8基因表达量显著升高。在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）细胞中，PtNF-YB8蛋白定位于细胞质和细胞核中，其转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系呈现晚花表型。酵母双杂交结果证明，PtNF-YB8蛋白能够与PtNF-YC9和PtNF-YC10蛋白互作。综上，PtNF-YB8蛋白可能与PtNF-YC9/10等NF-Y家族成员结合并进行信号传递，发挥延迟花期的作用。研究结果为进一步解析针叶树开花调控网络及研发种子园丰产稳产技术提供依据。

Abstract

To elucidate the causes of the long juvenile phase and low seed yield in Pinus tabuliformis seed orchards and explore the underlying regulatory mechanisms， this study focused on the flowering-related genes during early stages of flower bud differentiation. The aim was to reveal the gene expression characteristics during this period and clarify the biological functions of the nuclear factor Y（NF-Y） family members. Transcriptome sequencing（RNA-seq） was performed on apical meristems collected from adult trees in the Wucheng National Seed Orchard of P. tabuliformis， Shanxi， China， from mid-July to mid-October. The results revealed that the expression levels of PtNF-YB8 and many other NF-Y genes increased significantly in mid-October. Multiple cis-elements， including gibberellin（GA）-responsive and light-responsive elements， were found within the PtNF-YB8 promoter. Furthermore， exogenous GA treatment of apical buds significantly up-regulated the expression level of PtNF-YB8. Subcellular localization assays in tobacco cells showed that the PtNF-YB8 protein was localized in both the cytoplasm and the nucleus. Heterologous overexpression of PtNF-YB8 in Arabidopsis resulted in a distinct delayed flowering phenotype. Yeast two-hybrid assays confirmed that PtNF-YB8 interacts with PtNF-YC9 and PtNF-YC10. In conclusion， PtNF-YB8 may function by forming complexes with NF-Y members， such as PtNF-YC9/10， to facilitate signal transduction and negatively regulate flowering time. These findings provide a theoretical basis for elucidating the flowering regulatory network in conifers and developing techniques for high and stable yields in seed orchards.

Graphical abstract

关键词

油松 / 花芽发育 / 核因子家族 / 赤霉素

Key words

Pinus tabuliformis / floral bud development / nuclear factor Y family / gibberellin

油松（Pinus tabuliformis）属于松科（Pinaceae）松属（Pinus），是我国重要的乡土针叶树种，在吉林、内蒙古、甘肃、宁夏、青海及四川等省区广泛分布^［1］。该树种适应性强，耐干旱和低温，可在土层深厚、排水良好的酸性、中性或钙质黄土中生长。作为我国干旱及半干旱地区的主要造林树种之一，油松在水源涵养、生态平衡维持、植被恢复、水土保持与防风固沙等方面发挥关键的生态功能，同时具有显著的经济价值^［2］。

开花是植物完成个体繁衍和推动物种进化的关键阶段。茎顶端分生组织受到外界环境及内在信号的综合调控时，由营养生长向生殖生长转变，从而启动开花过程^［3］。油松为雌雄同株、异花授粉植物，其雄、雌生殖器官分别形成雄球果与雌球果，着生于同一植株^［2］。油松的开花与生殖发育具有明显的时序特征，其自然花期集中在5月，雄球花呈簇生的“小玉米”状，着生于当年生新枝基部，成熟后释放花粉，散粉后逐渐枯萎；雌球花则单生或2~3个生于新枝顶端，鳞片呈螺旋状排列。其花芽发育进程漫长，雌球花授粉后并非立即受精，需经历约1 a的发育周期，直至次年夏季完成受精，球果于9—10月成熟，种鳞张开后释放种子^［2，4］。油松分布范围广、种源丰富、林分与个体间遗传变异显著，且无性繁殖效率较低，主要繁殖方式为种子繁殖^［4］，因此，其遗传改良策略与多数针叶树相似，主要依托种子园建设推进良种选育^［3］。

根据模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）成花诱导过程，将成花途径主要分为6种，即光周期途径（photoperiod pathway）、春化途径（vernalization pathway）、自主途径（autonomous pathway）、赤霉素途径（GA pathway）、温敏途径（ambient temperature pathway）和年龄途径（age pathway）^［5-6］。植物对光周期的响应由CONSTANS基因（CO）和CONSTANS样基因（COL）诱导^［7］，在拟南芥中AtCO可直接激活下游成花素基因FLOWERING LOCUS T （FT）的转录^［8］，进而激活开花整合因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 （SOC1）和花分生组织决定基因APETALA 1（AP1）的表达，从而促进花分生组织分化^［9］。约3亿年前，被子植物和裸子植物的共同祖先中的FT基因发生了遗传分化和功能演变^［6］，其结果是裸子植物的成花素类似基因TFL1-like基因FTL1和FTL2可能在生殖发育过程中发挥作用^［10］。与被子植物FT基因功能不同，油松中TFL1-like的同源基因PtTFL1是开花抑制基因，维持分生组织的不定状态并延缓花芽的形成^［11］。被子植物MADS-box基因家族的FLOWERING LOCUS C（FLC）基因是春化途径的核心基因^［12］，可直接抑制FT、FD和SOC1基因表达，进而抑制植物开花。裸子植物基因组中尚未鉴定到FLC-like的同源基因^［10］，但有研究^［13］在挪威云杉（Picea abies）中鉴定到可能参与春化途径并调控生殖生长的关键基因。部分植物在缺乏外界环境信号调控的情况下，仍可在生长达到一定阶段后直接开花，该过程被称为自主途径^［14］。自主途径与春化途径类似，也是通过抑制FLC基因表达促进开花^［10］。由于裸子植物基因组中缺乏FLC类同源基因，因此，鉴定承担类似FLC功能的基因是解析裸子植物自主途径的关键。除了自主途径外，还有一些植物体内存在只与生长发育进程相关的途径，即年龄途径^［15］。参与年龄途径的关键调控模块包括miR156-SPL和miR172-AP2，已在针叶树中得到验证。例如，火炬松（Pinus taeda）、白云杉（Picea glauca）等SBP-box基因中都含有高度保守的miR156靶位点^［16］。在油松中，miR156和miR172也能分别切割目标基因PtSPL和PtAP2L的mRNA。然而，与被子植物不同，miR156在裸子植物中的表达模式却没有年龄效应^［15］。

赤霉素（gibberellin，GAs）是一类四环二萜类植物激素，能够促进种子萌发、调控下胚轴快速伸长与木质部分化，并在花芽诱导、开花调控及抗逆响应等方面发挥重要作用^［17］。在GA信号转导过程中，已有多种关键蛋白被鉴定，其中赤霉素信号通路的负调控因子DELLA蛋白被认为是核心抑制因子。DELLA作为主要的生长抑制蛋白，可与赤霉素受体蛋白GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1（GID1）结合，并通过泛素-蛋白酶体途径被降解，从而解除对植物生长的抑制^［18］。在针叶树生产实践中，外源GA被用于调控开花与结实，并展现出一定效果。研究^［19］表明，GA₃多应用于杉科（Taxodiaceae）和柏科（Cupressaceae）的促花结实，而非极性的GA₄₊₇则在松科植物中具有更多的应用。GA₄₊₇能够促进日本落叶松（Larix leptolepis）、西部落叶松（Larix occidentalis）^［20］等的生殖生长，并已在至少12个松科物种中成功应用于促花增产^［16］。此外，GAs还在松树雌、雄球花早期性别转化中发挥关键作用，例如GA₄₊₇和GA₄₊₇+TDZ混合配方成功地将扭叶松（Pinus contorta）雄球花转化为雌球花，并得到发育正常的种子，完成育苗过程^［19］。然而，当前关于GAs在针叶树花果形成中的调控机制尚不清晰，进一步阐明其信号调控网络对于开展科学育种、促进种子园建设和提高遗传改良效率具有重要意义。

核转录因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）是一类高度保守且广泛存在于真核生物中的转录因子^［21］。典型的NF-Y复合物通常由NF-YA、NF-YB和NF-YC 3个亚基组成，可通过识别并结合下游基因启动子中的CCAAT-box基序调节基因表达^［22］。在酵母中，NF-YB和NF-YC首先在细胞质中形成异二聚体，随后转移到细胞核，再与NF-YA作用形成NF-Y异源三聚体^［23］。在植物中，NF-Y复合体不仅参与介导植物对多种环境信号和激素的响应^［24］，还在非生物胁迫适应及生长发育过程中发挥重要调控作用。已有研究^［25］表明，NF-Y在开花时间调控中发挥重要作用。NF-Y蛋白可结合FT基因启动子远端增强子区域内的CCAAT元件，从而降低FT基因启动子的活性；同时，CO蛋白可被NF-Y复合体募集至近端顺式作用元件（cis-acting elements）上，使植株由营养生长向生殖生长转变^［26］。水稻（Oryza sativa）OsNF-YC2和OsNF-YC4蛋白参与调节光周期开花途径，过表达植株在长日照条件下表现为开花抑制，而OsNF-YC6在长日照条件下促进水稻开花^［27］。油松中共鉴定到28个NF-Y基因，其中PtNF-YC1与PtNF-YC4可能参与雄球花发育和GA信号通路^［28］；PtNF-YC1蛋白还能与PtCOL5蛋白互作，在短日照下抑制拟南芥开花^［29］。CmNF-YB8基因被鉴定为菊花（Chrysanthemum morifolium）成花转变的负向调控因子；在短日照条件下，该基因主要通过年龄途径介导营养生长从幼年期向成年期转变^［30］。此外，顺式作用元件预测和转录组数据分析结果表明，PtNF-Ys响应脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、生长素（IAA）和水杨酸（SA）等多种激素信号，暗示其可能在油松的激素调控网络及生殖发育过程中发挥多层次的调控作用^［28］。上述结果表明，NF-Y复合体可通过年龄途径和光周期等途径共同参与开花调控。

尽管NF-Y复合体在植物开花及激素信号响应中发挥重要作用，但当前关于GA如何与NF-Y转录因子协同调控针叶树花芽早期分化的分子机制尚不清晰。本研究以油松顶端分生组织为材料，采用时序转录组测序（RNA-seq）技术探究花芽发育早期阶段关键基因的表达模式。在此基础上，重点筛选响应GA信号的NF-Y家族成员，并通过亚细胞定位、酵母双杂交、转基因等手段解析其生物学特性与功能。本研究旨在初步揭示NF-Y基因在油松花芽分化早期的表达特征与功能，为进一步阐明针叶树开花调控网络及研发种子园丰产稳产技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

试验材料取自山西省关帝山国有林管理局吴城国家油松良种基地（36°48′N，111°10′E），本研究选取的试验林面积为20 hm²，包含约17 000株油松，树龄36~43 a，株行距为5 m×5 m。

激素喷洒处理：试验对象为15株油松植株，每株选取6个大小相近且位于中下部的枝条作为处理材料，其中3个枝条设为GA₄₊₇处理组，3个枝条为溶剂对照组。GA₄₊₇的质量浓度为500 mg·L^-1，每月喷洒1次，喷洒时间为7月、8月和9月中旬。喷药量控制在每枝条20 mL左右，以叶面湿润、有药液滴落为准。对照组枝条仅喷洒溶剂（9.5%乙醇），不含激素。

拟南芥：哥伦比亚野生型（Col-0）种子为实验室保存。种子先用75%的乙醇浸泡2 min，之后用10%的次氯酸钠溶液浸泡15 min，再用ddH₂O冲洗3遍，最后均匀铺在1/2 MS固体培养基上。于4 ℃春化3 d后，置于光照培养箱（23 ℃，16 h光照/8 h黑暗）培养至长出2片真叶时，移栽至花盆中，每盆4株。以2∶1∶1的体积比将营养土、珍珠岩、蛭石混合均匀，作为培养基质。覆上保鲜膜后，放入培养箱中继续培养，保持基质湿润。

1.2　油松顶端分生组织在不同发育阶段的转录组测序

于7月中旬至10月中旬，每月取未经激素处理的油松顶芽，剥去鳞片，用于转录组测序。提取RNA后，首先利用Qubit荧光计（赛默飞，新加坡）对RNA浓度进行准确定量，并通过Qsep400生物分析仪（光鼎，中国）评估RNA完整性，确保其满足文库构建要求。随后采用Oligo（dT）磁珠富集真核样品中带有polyA尾的mRNA，经片段化处理后，以随机六碱基引物合成第一链cDNA，并进一步扩增形成双链cDNA。纯化后的双链cDNA依次进行末端修复、加A尾及接头连接，并通过磁珠进行片段大小选择，最终经PCR扩增获得用于测序的cDNA文库。文库构建完成后，使用Qubit荧光计对文库浓度进行初步评估，并检测插入片段大小，同时应用qPCR准确定量文库有效浓度，确保其达到上机测序标准。合格文库按目标数据量进行混样，最终在Illumina高通量测序平台完成双端测序，获取后续分析所需的转录组数据。利用FPKM值计算基因表达量，数据经过对数标准化（log₂ transformation）处理后，使用迈维云平台（https：//cloud.metware.cn）绘制高级聚类热图。

1.3　 qRT-PCR荧光定量分析

于10月中旬分别取GA₄₊₇处理组和对照组油松的顶芽，剥去鳞片，提取RNA进行荧光定量PCR分析。使用植物RNA提取试剂盒提取总RNA并反转录成cDNA。使用Primer Premier 5软件设计特异性引物（表1），上、下游引物退火温度相近，产物长度在100~250 bp。利用QuantiNova SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（Qiagen，德国）和CFX96 qRT-PCR平台（BioRad，美国）进行qRT-PCR分析。测定各基因在不同样品中扩增的循环数（Ct），采用2^-ΔΔCt方法计算表达量，并求出与内参基因（Ptactin）的相对表达量。所有的扩增反应均在相同条件下重复3次。基因相对表达量以平均值±标准差（standard deviation，SD）表示。qPCR程序为二步法：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s，60 ℃、10 s（40个循环）。使用Origin 2021或GraphPad Prism 8.0绘制数据图。

1.4　 PtNF-YB8 基因启动子顺式作用元件预测

使用TBtools软件获取油松PtNF-YB8基因起始密码子上游2 000 bp序列作为基因启动子序列。使用在线分析网站（http：//bioinformat-ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析启动子顺式作用元件，使用TBtools可视化分析结果。

1.5　 PtNF-YB8蛋白亚细胞定位

为了分析PtNF-YB8蛋白在细胞内的定位特征，利用pCAMBIA1300载体构建35S：PtNF-YB8-GFP融合表达载体。以35S：GFP空载体作为对照，以mCherry-NLS作为核定位标志蛋白。采用农杆菌介导法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression）将构建载体转入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片进行瞬时表达。经48~72 h培养后，使用激光共聚焦显微镜SP8（Leica，德国）观察GFP荧光信号分布，确定PtNF-YB8蛋白的亚细胞定位。

1.6　油松 PtNF-YB8 基因克隆

取新鲜油松针叶（100~200 mg），在液氮中充分研磨后使用EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒（Aidlab，中国）提取总RNA，反转录，获得油松cDNA。以cDNA为模板，采用特异引物（表1）和TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix进行目的基因PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收并使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化。随后利用pTOPO-TA/Blunt Simple通用克隆试剂盒（Aidlab，中国）将纯化的PCR产物连接至T载体，转化DH5α感受态大肠杆菌（Escherichia coli），于37 ℃培养约16 h。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，将条带清晰且大小正确的克隆送样测序，获得含目标基因正确序列的阳性克隆。

1.7　拟南芥过表达株系的构建与鉴定

为验证PtNF-YB8基因功能，将其全长编码序列（CDS）克隆至pCAMBIA1300载体中，构建35S：PtNF-YB8过表达载体。通过农杆菌浸花法将该载体导入拟南芥哥伦比亚生态型Col-0中，经潮霉素筛选获得阳性植株，并通过qRT-PCR检测确认PtNF-YB8的表达水平，以筛选稳定过表达株系。随后在如1.1所述的生长条件下观察其开花时间、株高及花器官发育等表型特征。

1.8　酵母双杂

使用pGADT-7（Amp抗性）与pGBKT-7（Kan抗性）载体进行酵母双杂试验。首先，通过PCR获得含同源臂的目的基因片段，并对载体进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。将酶切后的载体与PCR产物分别回收后，使用2×OneStep Cloning Mix（Aidlab，中国）进行无缝克隆。50 ℃反应30 min后转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，经测序验证后提取重组质粒。随后将AD、BD载体分别转化至AH109酵母感受态细胞：取感受态细胞，依次加入carrier DNA、重组质粒和PEG/LiAC，混匀后于30 ℃水浴30 min、42 ℃热激15 min，洗涤后涂布于DDO培养基，于28 ℃培养48~96 h。阳性克隆经酵母菌落PCR鉴定后，于DDO液体培养基中28 ℃下振荡培养48 h。取培养液测定OD₆₀₀并统一菌体浓度，经离心洗涤后按10^-1、10^-2、10^-3梯度稀释，取3 μL菌液分别点接于DDO、TDO、QDO固体培养基，于28 ℃倒置培养36 h后观察生长情况以判断蛋白是否互作。

1.9　数据处理

所有试验数据均包含至少3次生物学重复，数据用平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS 26.0或GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双尾Student’s t检验判断不同处理组之间差异的显著性，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1　油松开花基因表达分析

通过对油松顶端分生组织在7月中旬至10月中旬不同发育阶段的转录组数据分析，检测到多种与开花调控密切相关的基因在时间序列上呈现出不同的表达谱，揭示了油松从营养生长向生殖生长过渡及花芽发育进程中的分子表达特征。

如图1所示，光周期相关基因PtCOL3和赤霉素分解基因PtGA2ox10在7月中旬高表达，PtTFL1基因在7月和8月中旬的表达量较高，随后逐渐下降。其中，PtCOL3和PtGA2ox10基因的高表达与花芽分化早期需要维持营养生长相吻合。PtGA2ox10基因高表达暗示此时期植物体内GAs分解增加，以维持顶端分生组织的营养生长状态。PtTFL1基因在顶芽分化早期高表达，表明油松尚处于花芽诱导前的准备阶段，发育方向尚未完全转向生殖生长。8月中旬，PtDAL1和PtCUL3基因的表达量显著上升，暗示油松进入花芽分化的激活期；9月中旬，PtNEEDLY、PtTFL2和PtLEAFY基因的表达量明显升高，这些基因多与花器官形成及花芽形态建成有关。PtNF-YC1、PtNF-YC3、PtMADS11和PtCOL1基因的表达量在10月中旬达到高峰，这些基因主要参与花器官发育与花期调控。

为进一步探究油松花发育早期关键转录因子的作用，本研究基于转录组数据，分析不同发育阶段NF-Y家族基因的表达趋势。分析结果显示，在7月至10月中旬的油松顶端分生组织样本中，不同NF-Y家族成员的表达呈现出明显的阶段性差异（图2）。其中，PtNF-YC9和PtNF-YC14基因在顶芽分化早期高表达，PtNF-YC5、PtNF-YA4和PtNF-YB9基因在中期高表达；其余基因大多在顶芽分化后期高表达，与图1中PtNF-YC1及PtCOL1基因的表达模式高度一致。结合文献报道^［30］和实验室前期对于其他物种NF-YB8基因功能的研究结果，本研究重点关注在顶芽分化后期高表达的PtNF-YB8基因，它可能与表达谱相似的其他NF-Y基因在油松开花调控过程中协同发挥作用。

为了验证转录组测序数据的可靠性，并进一步明确顶芽分化过程中关键基因的时序表达特征，本研究选取PtNF-YB8基因及开花调控相关基因PtTFL2、PtCOL1和PtNF-YC1进行qRT-PCR荧光定量分析。结果显示，4个候选基因qRT-PCR相对表达量变化趋势与转录组测序获得的FPKM值变化趋势基本一致，证实了转录组数据的准确性（图3）。

2.2　 PtNF-YB8 基因启动子元件预测

为进一步探究PtNF-YB8基因的转录调控机制及其在油松开花过程中的潜在生物学功能，对其启动子序列顺式作用元件进行系统预测与分析。首先，从油松基因组中提取PtNF-YB8基因转录起始位点（TSS）上游2 000 bp的核苷酸序列，利用PlantTFDB数据库预测该区域启动子顺式作用元件（表2）。采用TBtools软件可视化分析该预测结果，随后，构建PtNF-YB8基因启动子元件的分布图，以直观展示各类调控元件在启动子区域中的位置与丰度特征。

结果显示，PtNF-YB8基因启动子区域富含多种与植物生长发育及开花调控密切相关的顺式作用元件。其中，检测到多种与光信号响应相关的元件，包括光照响应元件（light-responsive elements）及昼夜节律调控元件（circadian control elements），暗示该基因的转录可能受光周期信号调控，与油松的季节性开花行为相关。同时，启动子中还含有多个与植物激素信号转导有关的调控元件，如赤霉素响应元件（gibberellin-responsive elements，GARE）和脱落酸响应元件（abscisic acid responsiveness elements，ABRE）等（图4），表明PtNF-YB8基因表达可能受到赤霉素与脱落酸协同调控。

为了明确赤霉素在油松花芽分化早期调控PtNF-YB8基因表达，对油松进行3个月GA₄₊₇外源喷洒处理后，采集顶端分生组织样本进行转录组测序分析和荧光定量PCR验证。结果显示，PtNF-YB8基因在GA处理组中的表达水平较对照组显著上调（P<0.01）（图5），表明该基因能够响应赤霉素信号。

2.3　 PtNF-YB8蛋白亚细胞定位

以本氏烟草叶片为材料，采用农杆菌介导的瞬时表达系统研究PtNF-YB8蛋白的亚细胞定位特征。结果显示，由35S启动子驱动的空载体对照中，GFP荧光信号在细胞核和细胞质中均有弥散分布。与之类似，PtNF-YB8-GFP融合蛋白的荧光信号也主要分布于细胞核和细胞质，且GFP信号能够与mCherry-NLS在细胞核中重叠（图6）。这一结果表明，PtNF-YB8蛋白既可在细胞质中存在，也能进入细胞核中发挥功能。

2.4　 PtNF-YB8 基因拟南芥过表达株系表型分析

以模式植物拟南芥为试验材料，开展PtNF-YB8基因过表达及表型分析，结果表明，与野生型拟南芥相比，PtNF-YB8基因在转基因植株中的转录水平显著提高（P<0.01）（图7），表明外源基因已成功整合并在拟南芥中表达。

将筛选获得的稳定过表达株系与野生型拟南芥置于相同生长条件下培养，观察并记录开花相关表型。结果显示，在种子吸胀后约40~60 d的生殖生长阶段，过表达株系（OE-PtNF-YB8）的抽薹及开花时间比野生型（WT）明显推迟（图8）。这表明PtNF-YB8基因在拟南芥中异源表达具有推迟开花启动、延长营养生长期的功能。推测该基因在植物开花调控网络中可能作为负调控因子发挥作用，参与光周期与激素信号的交互调节。

2.5　酵母双杂交筛选PtNF-YB8互作蛋白

将pGADT7-YB8（AD融合）与pGBKT7-YC/YA（BD融合）共转入酵母AH109，并在选择性培养基上进行点接（稀释倍数为10⁰、10¹、10²、10³），判断PtNF-YB8与NF-YC/YA亚基存在的蛋白相互作用。结果显示，所有共转化组合均能在双缺培养基（SD/-Trp/-Leu）上正常生长，表明质粒转化成功。在四缺选择性培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）上，BD-PtNF-YC9或BD-PtNF-YC10与AD-PtNF-YB8的共转化菌株生长旺盛，即便在高稀释倍数（10³）下仍有明显菌落；BD-PtNF-YA9也显示出与PtNF-YB8的互作信号，但强度较弱（图9）。单转pGADT7-YB8的阴性对照无法在选择性培养基上生长。综上，酵母双杂试验结果表明，PtNF-YB8能与NF-YC9/YC10发生强相互作用，可能与PtNF-YA9发生弱相互作用，暗示YB8可能作为NF-Y复合物的组成成分参与相关转录调控过程。

3 讨论

通过对油松顶芽分化早期进行时序转录组分析，本研究发现多种与开花相关的关键基因在不同发育阶段表现出显著的表达变化。其中，PtNF-YB8等NF-Y家族基因在顶芽分化后期表达量显著上升，其表达趋势与油松开花关键基因PtCOL1及PtNF-YC1高度一致（图1~3）。PtCOL1基因属于光周期调控途径中的核心因子，其上调通常与花期启动信号的传递密切相关。此外，启动子元件预测表明，PtNF-YB8基因启动子中富含光响应和赤霉素响应元件，且外源赤霉素处理显著诱导PtNF-YB8基因表达（表2，图4~5）。这些结果共同暗示，PtNF-YB8基因可能是一个整合GA与光周期信号、参与花芽发育后期调控的节点基因。

以往研究^［28］表明，NF-Y转录因子在被子植物的花期调控和激素响应中扮演重要角色，而在裸子植物中相关研究尚不充分。本研究中，异源过表达PtNF-YB8基因的拟南芥植株表现出显著的晚花表型（图7~8），表明PtNF-YB8基因可能作为花期的负调控因子发挥作用，这与NF-Y家族在多种植物中调节花期的结果一致。此外，油松PtCOL1和PtCOL3基因在拟南芥中过表达时也会延迟开花，暗示PtCOL与NF-Y转录因子可能协同调控裸子植物的花发育过程^［31］。引起晚花表型的基因可能通过延长营养生长期，为后期生殖发育储备必要的物质基础。这种机制在长寿木本植物中尤为重要，有助于避免在资源不足时过早开花，从而保证种子的质量^［32］。

PtNF-YB8在细胞质与细胞核中均有定位（图6），其在细胞质中可能参与蛋白复合物的组装或信号转导过程，而在细胞核内则可能以转录调控因子的形式参与下游基因的表达调控。结合在其他物种中的试验结果和蛋白序列的保守性，本研究初筛了几个PtNF-YC/YA候选蛋白，并检测了它们与PtNF-YB8之间是否存在相互作用。酵母双杂交试验结果显示，PtNF-YB8与PtNF-YC9/10具有较强的结合能力（图9），这与NF-YB/NF-YC二聚体在下游基因转录调控中充当核心组分的模式相符^［33］。后续还需要分析PtNF-YB8与PtNF-YC/YA在植物细胞内的互作关系，并结合花发育过程中相关基因的表达特征，进一步明确在体内发挥功能的PtNF-Y蛋白复合体及其作用机制。在模式植物拟南芥中，NF-YB/NF-YC二聚体可与光周期蛋白CO竞争结合，从而调节下游花期调控基因的转录^［33］；在针叶树中，NF-YC1/4蛋白已被证明能与DELLA蛋白（GA信号的负调控因子）相互作用，在ABA/GA信号整合中发挥作用^［28］。本研究发现，PtNF-YB8基因既与光周期基因表达相关，又对GA信号敏感，暗示裸子植物NF-Y蛋白复合物参与光周期和激素通路交叉调控的模式与被子植物相似，但也可能具有物种特异的调控网络。据此推测，在油松花发育早期，GA信号通过结合启动子响应元件上调PtNF-YB8基因表达。PtNF-YB8蛋白与PtNF-YC9/10等亚基形成转录复合物，可能通过调节靶基因的转录导致开花延迟。这一机制模型尚未得到证实，但它有助于解释油松漫长的童期，同时为理解裸子植物中激素与光周期共同影响花期提供了新视角，丰富了植物开花信号网络的理论框架。

本研究采用时序转录组分析策略，对花芽诱导期（7—10月）的油松顶端分生组织进行月度采样，解析花芽发育关键阶段的基因表达动态。在此基础上，结合qRT-PCR验证、拟南芥异源过表达、外源激素处理及酵母双杂交等多种试验手段，分析PtNF-YB8的表达、亚细胞定位、功能和互作蛋白。然而，油松生命周期长且目前尚未建立高效的遗传转化体系，暂无法在本体中进行基因敲除或转基因操作；同时，种质间的遗传变异和环境因素使试验结果受干扰，长期效应的观察和分析存在困难。未来需要发展油松稳定转基因或基因编辑技术，以直接在本体内探究基因功能。尽管如此，本研究结果对油松育种和种子园管理具有实际意义。在种子园实践中，可考虑结合合理的激素处理方案，调控PtNF-Y转录因子或其他花发育关键基因的表达水平，调控雌球花分化、花期或花量，实现高产与稳产。在机制研究方面，未来可开展ChIP-seq等试验，鉴定PtNF-Y转录因子及其他关键转录因子直接结合的基因组位点，厘清上、下游信号通路，构建油松花芽分化的转录调控网络。这些研究将深化对针叶树开花调控的理解，也将为提高种子园生产能力提供更加坚实的理论和实践依据。

参考文献

[1] 樊军锋，杨培华，郭树杰，等.陕西油松遗传改良研究进展［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2006，34（1）：45-50.

[2] FAN J F， YANG P H， GUO S J，et al.Research progress of genetics and improvement on Pinus tabulaeformis Carriere of Shaanxi Province［J］.Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2006，34（1）：45-50.

[3] NIU S H， LI J， BO W H，et al.The Chinese pine genome and methylome unveil key features of conifer evolution［J］.Cell，2022，185（1）：204-217.e14.

[4] 窦春蕊，李玉英，张冬红.油松种子园建立与经营技术研究现状［J］.西北农业学报，2004，13（3）：162-168.

[5] DOU C R， LI Y Y， ZHANG D H.Summary on construction and management techniques of seed orchard of Pinus tabulaeformis ［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2004，13（3）：162-168.

[6] LI W， WANG X R， LI Y，et al.Stability in and correlation between factors influencing genetic quality of seed lots in seed orchard of Pinus tabuliformis Carr.over a 12-year span［J］.PLoS One，2011，6（8）：e23544.

[7] JARILLO J A， PIÑEIRO M.Timing is everything in plant development.The central role of floral repressors［J］.Plant Science，2011，181（4）：364-378.

[8] MICHAELS S D， AMASINO R M.Loss of FLOWERING LOCUS C activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization［J］.The Plant Cell，2001，13（4）：935-941.

[9] TOKUTSU R， FUJIMURA-KAMADA K， MATSUO T，et al.The CONSTANS flowering complex controls the protective response of photosynthesis in the green alga Chlamydomonas ［J］.Nature Communications，2019，10（1）：4099.

[10] HAYAMA R， SARID-KREBS L， RICHTER R，et al.PSEUDO RESPONSE REGULATORs stabilize CONSTANS protein to promote flowering in response to day length［J］.The EMBO Journal，2017，36（7）：904-918.

[11] LÜ X C， ZENG X L， HU H M，et al.Structural insights into the multivalent binding of the Arabidopsis FLOWERING LOCUS T promoter by the CO-NF-Y master transcription factor complex［J］.The Plant Cell，2021，33（4）：1182-1195.

[12] CHEN F， ZHANG X T， LIU X，et al.Evolutionary analysis of MIKC^c-type MADS-box genes in gymnosperms and angiosperms［J］.Frontiers in Plant Science，2017，8：895.

[13] 刘洋，李帮同，杜桂华，等.油松FT/TFL1-like基因表达模式与调控分析［J］.北京林业大学学报，2018，40（10）：60-66.

[14] LIU Y， LI B T， DU G H，et al.Expression profiles and regulation of FT/TFL1-like genes in Pinus tabuliformis ［J］.Journal of Beijing Forestry University，2018，40（10）：60-66.

[15] HELLIWELL C A， ROBERTSON M， FINNEGAN E J，et al.Vernalization-repression of Arabidopsis FLC requires promoter sequences but not antisense transcripts［J］.PLoS One，2011，6（6）：e21513.

[16] ASANTE D K A， YAKOVLEV I A， FOSSDAL C G，et al.Effect of bud burst forcing on transcript expression of selected genes in needles of Norway spruce during autumn［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2009，47（8）：681-689.

[17] DENNIS L， PEACOCK J.Genes directing flower development in Arabidopsis ［J］.The Plant Cell，2019，31（6）：1192-1193.

[18] SONG Y T， LIU S W， MA J J，et al.The MADS-box transcription factor DAL1 links age to reproductive development through regulation of LEAFY homologs in conifer［J］.Plant Physiology，2025，198（4）：kiaf139.

[19] NIU S H， LI Z X， YUAN H W，et al.Transcriptome characterisation of Pinus tabuliformis and evolution of genes in the Pinus phylogeny［J］.BMC Genomics，2013，14：263.

[20] 石鹏，王永，张大鹏.赤霉素调控林木生长发育的研究进展［J］.江西农业学报，2021，33（2）：33-41.

[21] SHI P， WANG Y， ZHANG D P.Advances in gibberellins regulating growth and development of tree［J］.Acta Agriculturae Jiangxi，2021，33（2）：33-41.

[22] ZHANG S W， ZHANG D， FAN S，et al.Effect of exogenous GA₃ and its inhibitor paclobutrazol on floral formation，endogenous hormones，and flowering-associated genes in ‘Fuji’ apple（Malus domestica Borkh.）［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2016，107：178-186.

[23] KONG L S， VON ADERKAS P， ZAHARIA I，et al.Analysis of phytohormone profiles during male and female cone initiation and early differentiation in long-shoot buds of lodgepole pine［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2012，31（4）：478-489.

[24] ROSENBERG O， ALMQVIST C， WESLIEN J，et al.Systemic insecticide and gibberellin reduced cone damage and increased flowering in a spruce seed orchard［J］.Journal of Economic Entomology，2012，105（3）：916-922.

[25] MANTOVANI R.The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y［J］.Gene，1999，239（1）：15-27.

[26] LALOUM T， DE MITA S， GAMAS P，et al.CCAAT-box binding transcription factors in plants：Y so many？［J］.Trends in Plant Science，2013，18（3）：157-166.

[27] ROMIER C， COCCHIARELLA F， MANTOVANI R，et al.The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y［J］.Journal of Biological Chemistry，2003，278（2）：1336-1345.

[28] YU T F， LIU Y， FU J D，et al.The NF-Y-PYR module integrates the abscisic acid signal pathway to regulate plant stress tolerance［J］.Plant Biotechnology Journal，2021，19（12）：2589-2605.

[29] GNESUTTA N， MANTOVANI R， FORNARA F.Plant flowering：imposing DNA specificity on histone-fold subunits［J］.Trends in Plant Science，2018，23（4）：293-301.

[30] CAO S H， KUMIMOTO R W， GNESUTTA N，et al.A distal CCAAT/NUCLEAR FACTOR Y complex promotes chromatin looping at the FLOWERING LOCUS T promoter and regulates the timing of flowering in Arabidopsis ［J］.The Plant Cell，2014，26（3）：1009-1017.

[31] KIM S K， PARK H Y， JANG Y H，et al.OsNF-YC2 and OsNF-YC4 proteins inhibit flowering under long-day conditions in rice［J］.Planta，2016，243（3）：563-576.

[32] GUO Y T， NIU S H， EL-KASSABY Y A，et al.Transcriptome-wide isolation and expression of NF-Y gene family in male cone development and hormonal treatment of Pinus tabuliformis ［J］.Physiologia Plantarum，2021，171（1）：34-47.

[33] 刘红梅，郑永涛，郭盈添，等.油松PtNF-YC1基因鉴定及其调控球花发育的作用机制研究［J］.北京林业大学学报，2023，45（9）：1-8.

[34] LIU H M， ZHENG Y T， GUO Y T，et al.Identification of PtNF-YC1 of Pinus tabuliformis and its molecular mechanism involved in regulation of cone development［J］.Journal of Beijing Forestry University，2023，45（9）：1-8.

[35] WEI Q， MA C， XU Y J，et al.Control of chrysanthemum flowering through integration with an aging pathway［J］.Nature Communications，2017，8（1）：829.

[36] YANG W B， ZHOU C C， GUO Y T，et al.Genome-wide identification of the Pinus tabuliformis CONSTANS-like gene family and their potential roles in reproductive cone development［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2024，254：127621.

[37] OBESO J R.The costs of reproduction in plants［J］.New Phytologist，2002，155（3）：321-348.

[38] ZHANG B Q， FENG M H， ZHANG J，et al.Involvement of CONSTANS-like proteins in plant flowering and abiotic stress response［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（23）：16585.

基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD2200605)

北京林业大学“5⋅5工程”科研创新团队项目(BLRC2023C06)