兰香草花挥发性成分鉴定及其对访花昆虫行为的影响

Identification of Floral Volatiles from Caryopteris incana and Their Regulatory Effects on Floral Visitors Behavior

摘要

为鉴定兰香草（Caryopteris incana）花挥发性成分，并探讨其对访花昆虫行为的影响，该研究采用英国皇家园艺学会标准比色卡（RHSCC）测定兰香草花色，利用吸附-溶剂洗脱法收集花气味，结合气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）鉴定花挥发性成分，通过人工观察统计兰香草的昆虫访花频次，并同步检测花粉活力与柱头可授性的动态变化。结果表明：（1）基于RHSCC的兰香草花色测定确定其色号为N88B深紫色。（2）兰香草花挥发性成分以萜类化合物为主，占77.25%，其次是酯类，占13.00%。相对含量最高的右旋-柠檬烯（36.80%）为兰香草主要特征性挥发物。（3）蜂类是兰香草最主要的访花类群，占比91%以上。其中，意大利蜜蜂（Apis melliferaligustica）是兰香草最主要的访花者，访花频次和其他访花昆虫相比存在极显著差异（P<0.001）。（4）兰香草花期约7 d，花粉在花开放后2 d和3 d具活性，柱头在花开放后5 d具可授性，显示出雌雄蕊异熟中雄蕊先熟的特性，有效减少自交传粉的发生。该研究为兰香草传粉生态学的深入研究提供重要参考。

Abstract

The aim of this study was to identify the floral volatiles of Caryopteris incana and to explore their influence on the behavior of floral visitors. Flower color was measured with the Royal Horticultural Society Colour Chart（RHSCC）， and floral volatiles were collected by adsorption-solvent desorption and identified by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. Concurrently， insect visitation frequency was recorded through manual observations， and temporal patterns of pollen viability and stigma receptivity were assessed using the TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride） method and the benzidine-hydrogen peroxide assay， respectively. The results indicated that： （1）The flower color of C. incana was identified as strong violet （RHSCC N88B）. （2）Terpenoids（77.25%） constituted the majority composition of floral volatiles in C. incana， followed by esters（13.00%）. D-Limonene（36.80%） was the most abundant characteristic volatile. （3）Bees were the dominant floral visitors to C. incana， accounting for over 91% of all visitors. Among them， Apis mellifera ligustica was the most frequent species， with a visitation frequency significantly higher than that of all other insects（P<0.001）. （4）The flowering period of C. incana lasted about 7 days. Pollen remained viable on the 2^nd day and 3^rd day and stigma had receptivity on the 5^th day， demonstrating a protandrous（male-first） dichogamy that effectively reduces the potential for self-pollination. This study contributes to a deeper understanding of the pollination ecology of C. incana.

Graphical abstract

关键词

兰香草 / 花挥发性成分 / 访花昆虫 / 花粉活力 / 柱头可授性

Key words

Caryopteris incana / floral volatiles / floral visitors / pollen viability / stigma receptivity

“植物-传粉者”关系是陆地生态系统中最重要的交互关系之一^［1］，开花植物常常与传粉者形成互利关系，传粉者为其传粉，植物提供花蜜或花粉等作为报酬^［2］。在长期进化过程中植物形成了以视觉信号（如花色、花型）与化学信号（如花气味）为核心的信号系统以吸引传粉者，花朵通过明亮的花色在远距离吸引传粉者的注意，如利用蜂类的蓝色与黄色偏好、蝶类的红色偏好吸引不同传粉者^［3-4］；通过释放的花气味如脂肪酸衍生物、苯环类化合物和萜类化合物等挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs），在近距离引导昆虫定位花部报酬，促进其完成传粉过程^［5］。

访花昆虫作为所有传粉媒介中数量最多、作用最大的一个传粉类群，对开花植物的授粉和繁殖起着重要作用^［6］。许多传粉昆虫能够特异性识别植物花气味中的特定成分，这是植物与传粉者建立并维持传粉关系的关键^［7］。如采油蜂（oil-collecting bees）能特异性识别油料植物花气味中的甘油二乙酸酯并被吸引，从而为其传粉^［8］；中华蜜蜂对铁冬青（Ilex rotunda）访花频率的变化趋势与其花气味成分中β-石竹烯含量的变化规律一致^［9］；研究^［10］发现同域分布的几种舌唇兰属（Platanthera）植物虽花色、花型均一致，但埃及伊蚊（Aedes aegypti）只为钝叶舌唇兰（P. obtusata）传粉，是被其花气味中特定比例的壬醛和丁香醛所吸引。上述研究案例表明：花部化学信号（VOCs）在介导植物-昆虫相互作用中具有重要作用^［11］，植物通过花气味吸引和筛选特定的传粉者类群，对传粉者行为和访花频率产生影响^［12-13］。

因此，有关花气味的研究是传粉生物学研究中的热点领域^［14-15］。目前，花气味的量化手段主要是电子鼻型超速气相色谱仪（zNose high-speed gas chromatography）和气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），前者将超速气相色谱和高灵敏度的表面声波检测器联用，快速绘制嗅觉指纹图谱^［16］，后者是目前应用最广泛的气味定性定量分析技术^［17-18］。诸多有关花气味的研究关注于将花气味差异与访花者差异关联起来，一些研究在鉴定花气味之外，进一步用气相色谱-触角电位联用仪（gas chromatography-electroantennographic detection，GC-EAD）或Y型嗅觉仪行为学试验等验证花气味中关键成分吸引特定传粉昆虫的能力^［19-21］，或者结合花颜色研究，通过目测比色法、仪器测色法及数字化色彩分析等手段对花色进行测量^［22］，验证特定花色对目标访花者的吸引作用，从而共同探讨这些花部视觉与嗅觉信号在生态环境中的功能与应用潜能^［23-24］。

兰香草（Caryopteris incana）是一种具有独特观赏价值与悠久药用历史的野生芳香植物，在视觉上，其花朵呈现出对多数昆虫颇具吸引力的蓝紫色调^［25-26］；在嗅觉上，其花朵会释放出强烈的独特气味；在药用价值上，兰香草植株中含有可以预防或延缓动脉粥样硬化、癌症等疾病的苯丙糖苷类抗氧化剂^［27-28］，对Ⅱ型糖尿病有潜在治疗效果的环烯醚萜苷、枞烯型二萜苷和苯乙醇糖苷成分^［29］，以及可以诱导癌细胞凋亡的松香烷二萜类^［30］和二苯乙烯类^［31］化合物等多种优良活性成分。

近年来，国内外对兰香草的研究主要集中于植株蒸馏精油的化学成分提取与分析，已鉴定出蒎烯、1，8-桉叶素、芳樟醇等物质^［32-34］。然而，目前仍缺乏对于兰香草花挥发性成分（VOCs）的相关分析，其对访花昆虫行为的影响也尚未阐明。其同属植物蒙古莸（Caryopteris mongholica）的研究^［35］表明，其通过雌雄同熟但动态雌雄异位的花部设计，配合集中开花的策略，既降低了自花授粉的干扰，又保障了异交机会，从而保障繁殖成功率。类似地，兰香草可能也具有独特的花部时空策略以优化其繁殖系统。本研究拟通过对兰香草花颜色的比色测定、花挥发性成分量化分析、昆虫访花频次统计、花粉活力和柱头可授性动态变化的检测，解答以下问题：（1）兰香草花颜色和花挥发性成分如何吸引访花昆虫？（2）兰香草的主要访花昆虫类群有哪些？（3）有着众多访花昆虫的兰香草如何减少和避免自交发生？

1 材料与方法

1.1　试验地概况

本试验于中国科学院植物研究所植物园（40°0´21´´N，116°11´38´´E）进行，该区域属典型的北温带半湿润大陆性季风气候。

1.2　试验材料

试验地兰香草每年9月处于盛花期，供试植株共4丛，呈分散孤立布局，未形成连续的种植斑块。每丛包含3~5株生长健康的成熟个体，均为地栽，且定植时间均超过5 a。兰香草具轮伞花序，花萼杯状，花冠5裂，二唇形，雄蕊4枚，柱头2裂^［36］。

1.3　试验方法

1.3.1　兰香草花色测定

在兰香草盛花期和室内自然光条件下，使用英国皇家园艺学会标准比色卡（royal horticultural society colour chart，RHSCC）对兰香草花颜色进行比色测定，选取3个单株，每个单株选取3片花冠裂片，由两位研究者独立判读并交叉核对，遇有歧义时由第三人复核或取共识值，经重复比较后选择最为接近的RHSCC色号作为最终测定结果。

1.3.2　兰香草花气味收集

采用吸附-溶剂洗脱法收集兰香草的花气味。于兰香草盛花期，在访花昆虫活跃的时间段（13：30—16：00）用聚酯惰性微波炉袋（Top-its，德国）对其进行采样。采样袋一端朝外侧开口处连接活性炭管以过滤流通的空气，另一端通过吸附管（CLSA，1.5 mg，Granicher and Quartero，德国）连接QC-1S型大气采样仪（北京劳动保护科学研究所，中国）^［16］，每次采集都设置一个未包裹花朵的空白对照。采集150 min后用HPLC级二氯甲烷（Sigma-Aldrich，货号439223）作为萃取溶剂对吸附管进行洗脱，洗脱液转移到装有250 μL锥形内插管（Agilent Technologies，美国）的微量进样瓶中，置于冰箱中-20 ℃保存备用。

1.3.3　兰香草花挥发性成分测定

兰香草花挥发性成分分析采用气相色谱-质谱联用法，利用气相色谱仪串联质谱仪（7890A-5975C，Agilent Technologies，美国），选取色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies，美国），设定柱温起始为40 ℃，保持2 min，然后以12 ℃·min^-1程序升温至300 ℃；柱流量1.0 mL·min^-1，进样温度280 ℃，进样量1 μL，载气为纯氦气。MS条件：EM电压1 447 V，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；扫描范围40~550。经气相色谱-质谱联用法分析的各组分通过美国国家标准与技术研究院NIST 17 Mass Spectral Library谱库检索确定化学成分，并用面积归一化法计算各成分的相对含量。

1.3.4　兰香草昆虫访花频次统计

于2020年9月25日至27日晴朗天气07：00—17：00访花昆虫活动时段，随机选取处于盛花期的兰香草植株，并随机选取植株上具有较多完全开放花朵的4个花序，以访花者落到花上为一次访问为标准，落到另一朵花上算作一次新的访问，进行持续15 min的观测统计，重复9次，记录访花者的种类和次数。

1.3.5　兰香草花粉活力变化测定

使用氯化三苯基四氮唑（TTC， Solarbio， CAS 298-96-4）染色法^［37］测定兰香草花粉活力变化。在兰香草花期第1~7天每天同一时间段（12：00—13：00）摘取3枚花朵作为3次重复，用刀片切下4枚雄蕊的花药转移至载玻片上，用解剖针剖开或碾压花药，使花粉散出，滴入1~2滴TTC染液混匀，黑暗静置15 min后在正置光学显微镜（Nikon ECLIPSE E200，日本）下观察花粉活力情况，并拍照统计。每朵花选取5个视野计算花粉活力平均值，每个视野的花粉活力计算公式为花粉活力=（染色花粉粒数/视野花粉粒总数）×100%。

1.3.6　兰香草柱头可授性变化测定

使用联苯胺-过氧化氢法^［38］测定上述采集的3枚花朵的柱头可授性。取柱头前段放入200 μL离心管中，加入50 μL联苯胺-过氧化氢混合溶液（V（1%联苯胺）∶V（3%过氧化氢）∶V（水）=4∶11∶22）。若柱头具可授性，呈现出过氧化物酶活性，则过氧化氢分解，联苯胺被氧化，柱头被染为蓝色，同时柱头周围的反应液有气泡产生^［39］。置于连续变倍体视显微镜（Motic SMZ168，中国）下观察。

1.4　数据处理

使用SPSS 29.0软件进行数据分析。各类访花昆虫对兰香草的访花频次组间差异通过单因素方差分析（One-way ANOVA）进行比较，使用OriginPro 24软件制图。

2 结果与分析

2.1　基于RHSCC的兰香草花色测定结果

使用RHSCC对兰香草花色（图1A）进行目测比色测定，确定其对应色组（color group）为紫色组（violet group），颜色为深紫色（strong violet），色号为N88B（图1B）。

2.2　兰香草花挥发性成分组成及其相对含量

结合NIST 17 Mass Spectral Library，利用MassHunter进行解卷积分析，鉴定出相对含量大于0.5%的兰香草花气味组成成分27种（表1）。兰香草花挥发性成分组成中，萜类化合物相对含量最高，为77.25%，其中右旋-柠檬烯相对含量最高，占36.80%；酯类化合物次之，占13.00%。

2.3　各类访花昆虫对兰香草的访花频次差异

观察发现，兰香草的访花昆虫包括意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）、中华蜜蜂（Apis cerana cerana），以及其他膜翅目（Hymenoptera）和双翅目（Diptera）的昆虫。所有不同种类的访花昆虫在观察期间对兰香草共进行了461次访问，选择访问次数前5的昆虫种类作比较，其中意大利蜜蜂共贡献353次访问，占76.6%，其次是中华蜜蜂（10.8%），偶见细黄胡蜂（Vespa velutina nigrithorax）、短腹管蚜蝇（Eristalis arbustorum）、白毛长腹土蜂（Campsomeriella annulata）（图2）。在9个统计时段内，意大利蜜蜂对兰香草4个花序平均访问频次约为39次，中华蜜蜂的平均访问频次约为6次，细黄胡蜂的平均访问频次约为1次（图3）。单因素方差分析结果显示，意大利蜜蜂对兰香草的访花频次和其他访花昆虫相比存在极显著差异（P<0.001）。

2.4　兰香草花粉活力和柱头可授性动态变化情况

TTC法测定兰香草花粉活力结果显示，花开放过程中花粉活力呈先上升后下降的趋势（图4），兰香草4枚雄蕊的花粉在花开放1 d时无活性，视野内可见花粉未被染色（图5A-2），在花开放2 d时升至10.40%，花开放3 d达到最高，为16.03%，视野内可见花粉被染色为红色（图5B-2、5C-2）。此后花粉活力降低，观察到此时的雄蕊花粉囊已完全打开，花粉已散布，载玻片上未捕获花粉。联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性结果显示，兰香草柱头在1 d（图5A-3）到4 d（图5D-3）未观察到柱头变色和气泡产生，在5 d时柱头呈现深蓝色（图5E-3），即具有可授性。此后在花开放6 d和7 d可见兰香草花朵枯萎，花粉无活力，柱头无可授性（图5F、5G）。

3 讨论

3.1　兰香草花颜色对访花昆虫的吸引作用

不同昆虫对花颜色具有不同偏好性^［40］，研究^［41］发现大多数传粉者类群都表现出对蓝紫色花的显著偏好。作为兰香草主要访花者的意大利蜜蜂拥有三色视觉系统，对紫外光、蓝光和绿光高度敏感^［42］，其感知的“色彩世界”整体向光谱的短波方向偏移，而蓝紫色光的波长范围（约380~450 nm）恰好与蜜蜂复眼上蓝光感受器的敏感峰值（430 nm）高度吻合，因此意大利蜜蜂偏好蓝色或紫色花朵^［43］。对高山地区植物多星韭（Allium wallichii）的传粉生态学研究^［44］表明，在紫花与白花同时存在的情况下，作为其主要有效传粉者的中华蜜蜂对紫花有明显的优先访问偏好。基于RHSCC的兰香草花色测定确定其色号为N88B深紫色，符合蜂类的访花偏好。

3.2　兰香草花气味成分对访花昆虫的吸引作用

兰香草所在的莸属（Caryopteris）约包括8个物种，目前对莸属植物气味研究的关注度较低，针对兰香草的花挥发性成分研究更为缺乏。有研究^［34］通过GC-MS技术对莸属3种植物兰香草、金叶莸（Caryopteris × clandonensis ‘Worcester Gold’）及蒙古莸（C. mongolica）的蒸馏精油进行成分分析，发现同属不同种植物间精油组分非常相近，仅含量略有不同。其中，它们共有的相对含量较高的几种物质为柠檬烯、1-Octen-3-ol、雪松醇、trans-p-2，8-Menthadien-1-ol、α-蒎烯、桃金娘烯醛、香芹酮、松香芹醇和石竹烯氧化物，本研究中兰香草花气味分析结果与上述这些精油主要组分基本一致。

兰香草花挥发性成分组成中，萜类化合物相对含量占比最大，为77.25%。花气味成分的种类和含量决定了访花昆虫的类型，以芳香性萜类挥发物为主要气味成分的花朵，其主要访花昆虫为蜂类^［45］，如马家柚（Citrus maxima cv. ‘Majiayou’）花朵挥发油主要由萜类化合物组成，对其访花昆虫种类进行观测和统计，最常见的是中华蜜蜂^［46］。在兰香草的挥发性萜类物质中，最值得关注的成分是占比最高的右旋-柠檬烯（36.80%），它是一种无色、具有柠檬香味的单萜类物质，是柑橘类果实精油的最主要成分^［47］。多项研究表明，右旋-柠檬烯对昆虫有很强烈的吸引作用，比如柑橘释放的右旋-柠檬烯能强烈吸引印巴黄蚜小蜂（Aphytis melinus）和Agathis bishopi等蜂^［48-50］以及龟纹瓢虫（Propylaea japonica）、异色瓢虫（Harmonia axyridis）等瓢虫^［51-52］。对5个不同商业品种的香瓜的研究^［53］发现，其雄花和雌雄同株花能释放大量的右旋-柠檬烯，对意大利蜜蜂有显著的吸引作用，本研究观测到的结果与之一致。欧洲葡萄蛾（Lobesia botrana）依靠气味对寄主进行非常严格的挑选，且被菊蒿（Tanacetum vulgare）强烈吸引，而利用气相色谱-质谱联用法研究发现欧洲葡萄蛾的触角对右旋-柠檬烯有电位反应，说明其极可能对该物质有强烈偏好^［54］。此外，兰香草气味中的石竹烯、香芹酮、α-蒎烯、正壬醛等也都被研究^［55-56］证明可引起蜜蜂不同程度的触角EAG（electroantennography）反应。

兰香草花挥发性成分相对含量排名第2的酯类成分（13.00%），同样也是植物花香挥发物中一个非常重要的家族，在吸引访花昆虫中起着不可或缺的作用。乙酸苄酯和其他酯类化合物都曾被报道能够引发蜂类的强烈触角反应^［57］。Y型嗅觉仪行为试验结果^［58］也证明，薰衣草（Lavandula angustifolia）盛花期的乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯这2种气味成分对传粉者意大利蜜蜂有着极显著的吸引作用。

植物对不同类型的访花昆虫的依赖与其花朵挥发性成分的组成和丰度有关，其中关键化合物具有吸引主要传粉者的作用^［59］。以右旋-柠檬烯为主要特征性挥发物，与多种萜类化合物、酯类物质等共同构成了兰香草的整体花气味轮廓，使其强烈吸引蜂类访问。

3.3　兰香草访花昆虫组成

于晴朗天气下兰香草盛花期阶段统计的461次访花记录中，访花次数排名前5的昆虫分别是意大利蜜蜂（76.6%）、中华蜜蜂（10.8%）、细黄胡蜂（2.6%）、短腹管蚜蝇（1.1%）和白毛长腹土蜂（1.1%）。可以看出蜂类是兰香草最主要的访花类群，占91%以上，这与兰香草花挥发性成分中鉴定出富含吸引蜂类的萜类及酯类化合物的结果相互印证。本研究仅关注了1 a盛花期的访花观察数据，在后续的研究中可通过多年度、多时段的持续观测，进一步系统揭示兰香草花挥发性成分对访花昆虫行为的影响。

本研究中意大利蜜蜂对兰香草的访问频率显著高于其他蜂类（P<0.001）。值得注意的是，意大利蜜蜂作为全球广泛养殖的最主要传粉昆虫^［60］，在受养殖活动影响的区域，其种群密度显著高于野生传粉者^［61］。在受农业活动影响的半自然生境（如青藏高原高寒草地）中，原本最丰富的传粉者为蝇类，但随着油菜种植引入的意大利蜜蜂在油菜花期会大量访问周边自然生境中的野生植物，导致当地传粉者格局发生转变，最丰富的传粉者从蝇类变成了意大利蜜蜂^［62］。本研究地点植物园为非完全自然生境，其周边区域可能存在人工饲养的意大利蜜蜂的干扰，后续应加强对试验区域蜂种类和数量的详细调查，为不同生境下兰香草传粉生态学的深入研究提供参考。

3.4　兰香草避免自交发生的生殖策略

野外观察结果表明，在兰香草盛花期间9个统计时段内，各类访花昆虫每个时段平均访问兰香草约51次，其中意大利蜜蜂作为主要访花者，平均访问频次约为39次。主要访花者频次较高、专一性相对较强会导致同株异花授粉的可能性较高^［63］。为避免自交传粉，植物通常具有相应的避免和降低自交发生的生殖策略^［64-65］。本研究发现兰香草的花粉活性集中在花开放2 d和3 d，而柱头在花开放5 d才表现出可授性，显示出雌雄蕊异熟（dichogamy）中雄蕊先熟（protandry）的特性。雌雄异熟策略能有效减少自交传粉，从而提高物种遗传多样性，避免物种近交衰退^［66］，具有重要生态意义。

兰香草的同科植物为了避免近交或自交衰退，除了采取上述的时间异位策略外，还有空间异位策略，即雌雄异位（herkogamy），如叉枝莸（Tripora divaricata）的花为雌雄异位，雌蕊的位置低于雄蕊，既减少了对花粉散发的干扰，也构成了物理隔离；而三花莸（Schnabelia terniflora）则采用了更为复杂的时空协同策略，其花雄蕊先熟且雌蕊在可授期会向下弯曲，使柱头从高于变为低于花药；同时，花序自下而上的开花顺序，配合传粉昆虫自下而上的访花行为，形成精准的异花花粉传递通道^［67］。与之类似，兰香草自下而上开放，当下部花朵进入可授的雌期时，上部花朵仍处于散粉的雄期，这可能有助于保障下部处于雌期的花能够接受来自异株的花粉。性别干扰理论认为，雌雄异熟和雌雄异位等花部性状是植物解决雌雄功能干扰，促进异花传粉，最终提升繁殖成功率的有效机制^［68］。

4 结论

综上所述，兰香草的花色测定为N88B深紫色，符合蜂类的访花偏好。右旋-柠檬烯作为兰香草花挥发性物质中的特征成分，结合多种萜类、酯类化合物，形成了对蜂类具有强烈吸引力的气味轮廓，同时昆虫访花统计结果也证实蜂类是兰香草最主要的访花类群。此外，兰香草采取雌雄异熟中雄蕊先熟为主的策略，有效避免和降低自交发生。本研究为兰香草花挥发性成分及其对访花昆虫行为的影响提供典型案例，为兰香草传粉生态学的深入研究提供重要参考。

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基金资助

中央高校基本科研业务费专项资金项目(BLX202317)

战略科学家科技创新项目(KG20241031)