薰衣草腺毛非特异性脂质转移蛋白nsLTP2介导挥发性有机物的细胞壁转运

Non-specific Lipid Transfer Protein nsLTP2 Mediates the Cell Wall Transport of Volatile Organic Compounds in Lavender Glandular Trichomes

摘要

薰衣草（Lavandula angustifolia）的香味主要来源于其体表密布的腺毛分泌的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）。疏水性VOCs从合成部位需穿越亲水性细胞壁，转运至腺毛分泌腔储存。然而，薰衣草疏水性VOCs穿越亲水性细胞壁的途径及其潜在机制尚不明确。该研究系统观察并分析了薰衣草花、叶片及萌发种子胚上表皮毛的类型与分布；克隆获得了1个非特异性脂质转移蛋白基因（nsLTP2），并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位研究；通过大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统纯化nsLTP2蛋白，并利用荧光探针评估其与芳樟醇的结合能力。结果表明：薰衣草除盾状腺毛外，还具有2~3种形态各异的头状腺毛，二者在结构与分布上存在显著差异。nsLTP2基因编码由115个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具有典型的nsLTP蛋白结构域及8个高度保守的半胱氨酸残基。基因表达分析显示，nsLTP2基因主要在花中表达，且在初花期表达量最高。亚细胞定位分析表明，nsLTP2蛋白定位于细胞壁；体外试验进一步证实其具有结合脂质体的活性。综上所述，该研究证实nsLTP2蛋白是薰衣草疏水性VOCs转运途径中的关键组分，可促进VOCs在细胞壁中的运输过程。

Abstract

The fragrance of lavender is primarily derived from volatile organic compounds（VOCs） secreted by the dense glandular trichomes on its surface. These hydrophobic VOCs must traverse the hydrophilic cell wall to be transported from their sites of synthesis to the secretory cavities of the trichomes for storage. However， the specific pathways and mechanisms enabling the efficient transport of hydrophobic VOCs across the hydrophilic cell wall in lavender remain poorly understood. In this study， we conducted a systematic analysis of the types and distribution of trichomes on the upper epidermis of flowers， leaves， and embryos of germinating lavender seeds. Additionally， a non-specific lipid transfer protein gene（nsLTP2） was cloned and subjected to bioinformatic and subcellular localization analyses. The nsLTP2 protein was expressed and purified using Escherichia coli， and its binding affinity for linalool， a major VOC component， was evaluated using a fluorescent probe. The findings revealed that， in addition to peltate glandular trichomes， lavender exhibited two to three morphologically distinct types of capitate glandular trichomes， which differred significantly in structure and distribution. The cloned nsLTP2 gene encoded a protein composed of 115 amino acids， featuring a typical nsLTP domain and eight highly conserved cysteine residues. Gene expression analysis demonstrated that the nsLTP2 gene was predominantly expressed in flowers， with peaked expression observed during the early flowering stage. Subcellular localization analysis indicated that nsLTP2 was localized to the cell wall， and in vitro assays confirmed its ability to bind liposomes. In summary， this study identified nsLTP2 as a critical component in the VOC transport pathway in lavender， facilitating the movement of VOCs through the cell wall.

Graphical abstract

关键词

薰衣草 / 腺毛 / 非特异性脂质转移蛋白 / 挥发性有机化合物 / 细胞壁

Key words

lavender / glandular trichomes / nsLTP / volatile organic compounds / cell wall

众多植物物种会将相当一部分通过光合作用固定的碳分配至挥发性有机化合物（VOCs）的生物合成途径^［1］。这些挥发性物质在植物与周围环境的通讯和相互作用中起到关键作用^［2］，并广泛参与多种重要的生理生态过程，例如吸引传粉者与种子传播者、抵御地上和地下食草动物、防御病原体、介导植物间与器官间的信号传递、发挥化感作用，以及响应非生物胁迫等^［3-4］。另一方面，当VOCs在植物细胞内积累到较高浓度时，可能引发细胞自我毒性^［5］。因此，植物进化出多种特化结构，如树脂道、油腺和腺毛等，用于储存并分泌这些化合物，从而保护细胞膜结构与功能的完整性^［6］。腺毛作为许多植物体表存在的附属结构，能够储存多种代谢产物（包括VOCs）。VOCs从生物合成部位至分泌腔的储存，需经历跨越细胞质、质膜及亲水性细胞壁的胞内转运过程。现有研究^［7］表明，主动运输机制在植物腺毛VOCs的外排中起着关键作用。其中，质膜上的亲脂性ABC转运体可将VOCs从胞质主动转运至质膜外^［8］，而胞吐作用也参与VOCs向胞外储存腔的分泌^［9］。此外，另一类非特异性脂质转移蛋白（nsLTPs）可能协助VOCs穿越亲水性的细胞壁，并防止其重新扩散至质膜，从而确保VOCs的有效区隔化储存^［10］。研究^［6］显示，不同类型的腺毛储存的化合物种类存在显著差异。通常，头状腺毛存储和分泌非挥发性化合物，如烟草（Nicotiana tabacum）头状腺毛中的二萜及烟草/番茄（Solanum lycopersicum）头状腺毛中的酰基糖等^［11-12］。而盾状腺毛多存储和分泌挥发性有机化合物，如辣薄荷（Mentha×piperita）、罗勒（Ocimum basilicum）、薰衣草属（Lavandula spp.）等物种中的盾状腺毛。

nsLTPs在腺毛中因其能够结合并转运多种疏水性分子^［13］，被认为是促进挥发性有机化合物跨细胞壁运输的潜在关键因子，因而受到广泛关注。已有研究^［14-15］证实，nsLTPs参与蜡质、倍半萜类及二萜类物质从质膜经由细胞壁向腺毛分泌腔的转运过程。该类蛋白在高等植物中广泛存在，通常由多基因家族编码^［16］。nsLTPs的相对分子质量一般介于6.5~10.5 kDa，其序列中包含1个由8个半胱氨酸残基构成的保守基序，该结构通过形成4对二硫键稳定蛋白空间构象，并与4个α螺旋共同构建出1个疏水性空腔，从而具备结合并转运不同亲脂性底物的能力^［17］。越来越多的研究证据^［18-19］表明，nsLTPs在植物的生长发育、生殖过程、信号传导、防御反应及逆境适应等多种生理途径中发挥重要作用。

薰衣草（Lavandula angustifolia）是世界范围内重要的芳香植物，以其醇厚且独特的香气被誉为“香草之后”。其特有的香气主要来源于VOCs，这些成分构成薰衣草精油的主要香韵。薰衣草具有多种表皮毛结构，其中具备分泌功能的主要为盾状腺毛和头状腺毛。这2种腺毛在植株表面的分布与形态结构均存在显著差异。尽管已有研究^［20］对薰衣草头状腺毛与盾状腺毛的发生、发育过程及相关调控机制进行了探讨，并利用亚细胞定位、组织特异性表达及尼罗红染色等方法分析了nsLTP基因在脂质转运中的潜在功能^［21］，但目前关于薰衣草不同组织中毛状体的系统分布特征，以及nsLTP蛋白在脂质体转运中的具体途径和作用机制仍认识不足。为此，本研究以伊犁地区主栽薰衣草品种‘新薰1号’为材料，综合运用体视显微镜、光学显微镜、扫描电镜及激光共聚焦显微镜，系统观察毛状体在薰衣草不同组织中的类型与分布，并分析nsLTP蛋白的亚细胞定位；同时，通过原核表达系统纯化获得nsLTP重组蛋白，并利用荧光竞争结合试验评估其与脂质的结合活性。本研究通过解析毛状体分布规律及nsLTP蛋白的脂质结合能力，旨在为高品质薰衣草种质选育及精油品质提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　薰衣草样品采集

植物材料源自新疆伊宁县天山花海旅游景区（43°70′0″N，81°98′23″E，海拔750 m），为处于盛花期（7月）的4年生‘新薰1号’薰衣草植株。每个样品均采集3份作为生物学重复，取样后用蒸馏水彻底冲洗，以去除表面附着物。

1.2　薰衣草表皮毛的光学显微镜观察

本研究选取新鲜薰衣草的叶片、胚芽、花冠及花萼为试验材料。样品经蒸馏水清洗后，首先在体视显微镜（Nikon SMZ18，日本）下进行整体形态观察。随后，分别从花冠不同区域（包括边缘等部位）切取约1 cm×1 cm的组织块；花萼经解剖刀切开后，沿表面切取宽度约1 mm、长度约1 cm的条状样本；叶片、胚芽及子叶部分同样切取1 cm×1 cm的小块。所有组织样本均制成临时水装片，置于光学显微镜（Nikon Eclipse E600w，日本）下观察腺毛的形态结构、类型及其分布特征，并采集图像。

1.3　薰衣草表皮毛的扫描电镜观察

采集薰衣草的叶片、花冠及花萼等新鲜组织，并将其切割为约5 mm×5 mm的小块。随后将样本在4 ℃条件下使用2.5%戊二醛溶液（25%戊二醛溶于0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液，pH=7.2）固定过夜。固定完成后，以相同缓冲液清洗样品3次，每次15 min。随后，使用系列浓度梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）进行脱水处理，各浓度梯度浸泡15 min。经临界点干燥后，将样品黏附于金属样品台并置于离子溅射仪中进行铂金镀膜。然后，使用扫描电子显微镜（JSM-7500F，日本）在适宜加速电压下观察样品表面形态，并系统采集不同放大倍率的图像。

1.4　植物总RNA提取及cDNA合成

称取新鲜叶片0.2 g，按照RNA Prep Pure Plant Kit（天根）说明书流程提取总RNA，并通过核酸电泳检测其质量与完整性。随后，使用FastKing RT Kit（天根）将所提取的RNA反转录为cDNA，用于后续试验分析。

1.5　薰衣草 nsLTP2 基因克隆及生物信息学分析

根据薰衣草基因组数据（GenBank登录号：PRJNA642976），采用2×Hieff Canace Plus PCR高保真预混酶（上海翊圣生物科技有限公司）对nsLTP2基因的开放阅读框（ORF）序列进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段后，将其克隆至T载体中，将重组质粒送至武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序分析。为系统分析nsLTP2蛋白质特性，综合利用一系列生物信息学工具。首先，分别采用SignalP（http：//services.healthtech.dtu.dk/SignalP）、TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/TMHMM）和Plant-mPLoc（https：//www.expasy.org/Protscale）在线工具，对nsLTP2的信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位进行预测。随后，通过NCBI的BLASTP程序检索其保守结构域，并利用MultAlin在线工具将nsLTP2的氨基酸序列与鼠尾草（Salvia divinorum；KAL 1553608、KAL1556132）、牛耳朵（Primulina eburnea；XP_073066478、XP_073064151）、安哥拉芝麻（Sesamum angolense；KAK4406292、KAK440 6290）、莴苣（Lactuca sativa；XP_023742305、XP_023742292）及红花亚麻（Linum grandiflorum；CAN0846874、CAN0846870）中的同源序列进行多序列比对。最后，基于比对结果，运用MEGA 11软件采用邻接法构建系统进化树，并通过设置1 000次重复的Bootstrap检验评估各节点的置信度。

1.6　 nsLTP2 基因表达量分析

为分析nsLTP基因的表达模式，从薰衣草不同花期（初花期、盛花期、末花期）及不同组织（花、叶、茎）的样本中获取转录组数据（PRJNA1280772）。通过将高通量测序得到的干净读数比对至薰衣草参考基因组，并利用如StringTie等工具进行转录本组装与表达量估算，获得每个nsLTP基因的表达谱。基因的表达水平以FPKM值进行标准化量化，随后通过柱状图可视化方式呈现其在不同组织与发育时期的表达差异。

1.7　 nsLTP2蛋白的亚细胞定位

本研究通过农杆菌介导法在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达pBI121-35S-EGFP-nsLTP2融合蛋白，以分析其亚细胞定位。将构建于pBI121-35S-EGFP载体并经测序验证的nsLTP基因转化至农杆菌GV3101，在含抗生素的LB培养基中培养至对数后期。菌体经10 mL MES缓冲液（20 mmol·L^-1）洗涤和重悬，调整OD₆₀₀至约1.4，并加入乙酰丁香酮（150 μmol·L^-1）诱导1.0~1.5 h。将菌液注射渗透至生长良好的本氏烟草叶片，暗培养48 h后，取注射部位叶片，使用碘化丙啶（propidium iodide，PI）（15 μg·mL^-1）溶液染色约30 min。为进一步确认蛋白在细胞壁中的定位，对样品添加1 mol·L^-1甘露醇溶液处理约10 min诱导质壁分离，使用共聚焦显微镜观察定位情况。

1.8　 nsLTP2蛋白表达与纯化

将重组pET15d-nsLTP质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.4~0.6，加入0.25 mmol·L^-1 IPTG于16 ℃诱导表达14~16 h。菌体离心收集后经超声破碎，离心取上清，依次通过Ni-NTA亲和层析、Source Q10-100阴离子交换和Superdex 75分子筛层析进行纯化，所得蛋白浓缩后通过SDS-PAGE分析并用于酶活性测定。

1.9　 nsLTP2蛋白体外结合脂质的功能研究

采用基于荧光的结合试验，各样品浓度主要参照先前文献^［22］的方法。简要而言，利用F97 Pro荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司），将样品混合物（含有固定浓度的nsLTP（1 µmol·L^-1）与6-（P-甲苯胺）-2-萘磺酸纳盐（TNS，3 µmol·L^-1）或单独TNS，溶液体系为175 mmol·L^-1甘露醇、0.5 mmol·L^-1 K₂SO₄、0.5 mmol·L^-1 CaCl₂和5 mmol·L^-1 MES（pH=7.0））在320 nm波长激发，记录437 nm处荧光发射值，在25 ℃孵育5 min达到平衡后测定背景荧光值F0_mix和F0_TNS。随后，将其溶解于2 µL二甲基亚砜（DMSO）的待测配体，加入混合物及单独TNS溶液中，使其达到不同终浓度，孵育5 min平衡后记录荧光发射值。

1.10　数据处理

采用独立样本t检验（paired t-tests）检验薰衣草花、叶和茎中nsLTP2基因表达水平的差异显著性。统计检验的显著性水平设定为P<0.01。

2 结果与分析

2.1　薰衣草不同组织表皮毛种类及分布

对薰衣草表皮毛的观察发现，在薰衣草的花（不同位置）、叶片、萌发的种子胚上，均密集分布不同形态和结构的表皮毛（图1），包括4种非腺毛和4种腺毛。非腺毛可分为星状、线状、刺状和乳突状毛；腺毛有两类：盾状腺毛和头状腺毛，头状腺毛又分三型（图2）。盾状腺毛分布于薰衣草的叶片（正、反面）、花萼（外侧）、花筒（外侧）、花冠（内、外侧）部位，间生于密集的星状非腺毛下部，由1个硕大的球状头部和1个极短的柄组成，通常很难观察到柄结构。头状腺毛则分布于花筒和花冠（内侧）、子叶、下胚轴部位。其中，2种头部较大的长柄和短柄头状腺毛主要集中在花筒和花冠内成熟花药附近（Ⅰ型和Ⅱ型），头部较小的中柄头状腺毛（Ⅲ型）则分布在子叶和胚轴表面。花药附近的头状腺毛与目前文献^［23］报道的头状腺毛在形态结构上存在显著差异，其中，Ⅰ型头状腺毛具有1个显著伸长的柄部和1个球状头部，被1个长方形细胞连接，柄细胞表面密集分布着乳突状结构；Ⅱ型头状腺毛具短柄和球形头部；Ⅲ型头状腺毛头部扁圆形，短柄基部膨大。基于盾状腺毛和3种类型头状腺毛在薰衣草上的结构及分布位置的明显区别，推测它们分泌的精油成分及可能的生物学意义存在差异。研究^［24］显示，花药附近的腺毛在昆虫取食时会引起腺毛破裂，释放其中的次级代谢产物，可能以此吸引昆虫传粉并促进花粉的萌发。而子叶和胚轴上的头状腺毛可能有助于保护萌发的幼苗免受土壤有害细菌等的侵害^［25］。

2.2　薰衣草腺毛的扫描电镜观察

薰衣草叶片表面分布有多种形态各异的表皮毛。其中，盾状腺毛具有较大且呈圆盘状的头部，由多个分泌细胞组成，通常直接着生于表皮或具有极短的柄部，被认为是挥发性有机物合成与储存的主要场所。头状腺毛则具有明显伸长的柄部和较小的球形头部，整体形态较为细长。此外，叶片表面还普遍分布着呈细长锥形的非腺毛结构（图3）。从结构与功能的对应关系来看，盾状腺毛的大型头部结构与其高效的分泌能力相一致，推测其细胞内富含挥发性油类物质；头状腺毛的细长形态则表明其可能参与特定代谢物的阶段性或条件性分泌过程。非腺毛在叶片表面形成物理屏障，可能在抵御植食性生物及减少非气孔性水分蒸发方面发挥重要的生态功能。

2.3　 nsLTP2 基因克隆及序列分析

在薰衣草中成功克隆获得nsLTP2基因，其开放阅读框（ORF）全长为348 bp，编码115个氨基酸，预测蛋白质的相对分子质量为12.2 kDa。多序列比对结果显示，该基因具有完整的ORF，nsLTP2蛋白序列中含有8个保守的半胱氨酸残基，可形成4对二硫键，从而赋予其稳定的三维结构（图4）。生物信息学分析显示，nsLTP2蛋白定位于细胞壁，其N端含有一段由26个氨基酸组成的信号肽，属于亲水性碱性蛋白，无跨膜结构域，该蛋白被进一步归类为Ⅱ型非特异性脂质转移蛋白。系统进化树分析表明，薰衣草及其他5个物种的非特异性脂质转移蛋白分布于2个不同的进化支中。其中，薰衣草LansLTP2（La17G01519）与KAK4406292、KAK4406290、CAN0846874、CAN0846870及XP_073064151聚类于同一分支，其余nsLTP蛋白家族成员则聚集于另一分支，表明nsLTP2蛋白在进化上具有独特性。进一步比对显示，薰衣草LansLTP2与红花亚麻LinsLTP2蛋白的相似性最高（图5A）。基于薰衣草不同花期及组织部位的转录组数据，nsLTP2基因表达水平呈现显著的组织特异性与时序性差异（图5B）。该基因主要在花器官中表达，而在叶片与茎中表达水平极低或检测不到。在花期进程中，nsLTP2基因的相对表达量在初花期达到峰值，盛花期次之，至末花期则显著降低。

2.4　 nsLTP2蛋白亚细胞定位分析

为解析nsLTP2蛋白的亚细胞定位，本研究构建了nsLTP2-EGFP融合表达载体，并以pBI121-35S-EGFP作为对照组，在烟草叶片中进行瞬时表达。随后，采用红色荧光染料碘化丙啶（PI）对细胞进行染色。共聚焦显微镜观察结果显示，nsLTP2-EGFP信号主要定位于细胞膜与细胞壁区域。进一步通过甘露醇处理烟草叶片诱导质壁分离后，仍可清晰观察到nsLTP2-EGFP定位于细胞壁结构（图6）。上述结果表明，nsLTP2蛋白在腺毛中主要定位于细胞壁，提示其可能在疏水性挥发性物质穿越亲水性细胞壁的运输过程中发挥重要作用。

2.5　 nsLTP2蛋白异源表达与纯化

为获得高纯度的nsLTP2蛋白用于功能研究，在去除其信号肽后，利用大肠杆菌（Escherichia coli）系统进行异源表达。重组蛋白首先通过镍亲和层析进行纯化，随后依次经阴离子交换层析（Source Q）和分子筛层析（Superdex 75）进一步精纯。SDS-PAGE验证结果（图7）显示，最终制备的蛋白样品纯度较高且性质稳定，满足后续体外脂质体结合活性分析的技术要求。

2.6　 nsLTP2蛋白结合芳樟醇的活性分析

为验证nsLTP2蛋白与挥发性有机化合物的结合能力，本研究采用了基于荧光探针TNS（6-（对甲苯氨基）-2-萘磺酸盐）的体外竞争性结合试验。TNS在水相环境中荧光较弱，但当其结合到蛋白质的疏水区域时，荧光强度显著增强。试验结果表明，与缓冲液对照组及热变性nsLTP2蛋白对照组相比，活性nsLTP2蛋白显著增强了TNS的荧光信号（图8）。进一步加入外源芳樟醇后，TNS的荧光强度明显降低，这表明芳樟醇能够竞争性地置换出与nsLTP2疏水腔结合的TNS分子，使其重新进入水相环境，从而导致荧光淬灭。上述结果证实，nsLTP2蛋白在体外具备结合挥发性有机化合物的能力。

3 讨论

3.1　薰衣草不同组织表皮毛类型

表皮毛是植物体表的重要附属结构，根据其结构和功能可分为腺毛和非腺毛。目前，非腺毛的研究多以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为模式植物，而腺毛的研究则主要集中于茄科（Solanaceae）和唇形科（Lamiaceae）植物。典型的腺毛为多细胞结构，通常包括1个分泌代谢物的头部、1个连接头部和基部的柄，以及1个位于表皮层的基细胞^［26］。根据形态和结构的差异，腺毛可分为盾状腺毛和头状腺毛两类。盾状腺毛通常由极短的柄和1个较大的头部组成，而头状腺毛则由或长或短的柄及较小的头部构成^［27］。不同植物物种间，腺毛在形态、细胞组成及分泌产物种类方面表现出高度的多样性。

研究^［28］表明，番茄及茄属（Solanum）相关物种的植株表面存在多达7种腺毛，包括4种分泌型腺毛（可归为盾状腺毛和头状腺毛两类）和3种非分泌型腺毛。不同植物物种间，腺毛在形态、细胞组成及分泌产物种类方面表现出显著的多样性。例如，黄花蒿（Artemisia annua）具有1种分泌型盾状腺毛和1种非分泌型腺毛，其分泌型腺毛能够合成抗疟疾药物青蒿素^［29］；黄瓜（Cucumis sativus）果实上的分泌型腺毛包括盾状腺毛（Ⅰ型）和头状腺毛（Ⅵ型）^［30］。烟草中存在2种头状腺毛，其中长型头状腺毛可分泌萜类化合物和草酸钙晶体，而短型头状腺毛可能分泌与防御相关的蛋白质^［31］。罗勒、紫苏（Perilla frutescens）和薄荷（Mentha canadensis）等唇形科植物的叶片表面也分布着大量腺毛，其中薄荷叶表面交叉分布着盾状腺毛和头状腺毛，并合成和分泌芳香精油。

薰衣草的特殊芳香来源于其体表大量分布的腺毛结构。目前，关于腺毛形态、分泌物及其分泌机制的研究已在薄荷等芳香植物及番茄等园艺作物中取得一定进展，但针对薰衣草腺毛的研究仍较为零散，尤其在腺毛类型与系统分布方面的认识尚不充分。本研究发现，薰衣草体表存在8种形态各异的表皮毛，其中包括2类腺毛——盾状腺毛与头状腺毛。它们在外部形态、结构特征及分布位置上均存在显著差异，初步推测这2类腺毛在合成化合物种类及其生物学功能方面可能具有明显区分。

3.2　薰衣草腺毛nsLTP蛋白功能

VOCs在其储存及释放组织中主要通过从头合成途径产生。在花卉中，VOCs的生物合成几乎完全发生于表皮细胞。VOCs储存在腺毛的分泌腔之前，必须依次穿越细胞溶质、亲脂性质膜及亲水性细胞壁，其中每一道细胞屏障均对整体排放速率构成关键阻力。以矮牵牛（Petunia hybrida）为例，VOCs跨质膜运输由PhABCG1（ATP binding cassette subfamily G member 1）转运蛋白介导^［5］，而跨细胞壁的运输则由PhnsLTP3蛋白完成。nsLTP蛋白除参与蜡质成分向角质层的输送过程外^［32-33］，还在单萜^［34］、倍半萜^［10］及二萜从腺毛头部分泌细胞向皮下分泌腔的转运中发挥关键作用。在青蒿（Artemisia caruifolia）腺毛中特异性表达的AnLTP3与AnLTP4蛋白被证实参与亲脂性倍半萜内酯类化合物的分泌过程^［35］。此外，在唇形科植物薄荷中异源表达烟草MensLTP1蛋白可增强挥发性单萜的转运能力^［34］。在薰衣草中，LansLTP2-2基因在花萼中高表达，同时转LansLTP2-2基因的烟草中该基因主要集中于腺毛的头部，推测LansLTP2-2可能在脂类和萜类化合物的合成和分泌中发挥作用^［21］。

薰衣草是唇形科的一种芳香植物，其精油富含挥发性化合物，因此VOCs在体内的合成、转运及分泌过程尤为关键。本研究从薰衣草中克隆得到1个nsLTP2基因，其编码蛋白含有8个高度保守的半胱氨酸残基，可形成4对二硫键。这些二硫键构成稳定的刚性骨架，支撑蛋白中心疏水空腔的结构完整性，而该疏水腔正是nsLTP2蛋白结合与携带脂质分子的关键功能区。若无二硫键的稳定作用，疏水腔在生理条件下难以维持其构象。序列分析显示，该nsLTP2蛋白的N端包含一段由26个氨基酸构成的信号肽，提示其可能作为分泌蛋白参与细胞内物质转运。nsLTP2基因在不同花期的花中的表达量显著高于其他组织，薰衣草花作为VOCs积累的主要场所，nsLTP2基因可能在花中发挥功能。亚细胞定位试验进一步证实，nsLTP2蛋白主要分布于细胞壁，表明其功能主要在该部位实现。通过大肠杆菌系统成功表达并纯化去除信号肽的nsLTP2重组蛋白，体外竞争结合试验结果表明，该蛋白能够有效结合芳樟醇。疏水性芳樟醇分子可进入nsLTP2蛋白的疏水腔，借助疏水相互作用实现结合，从而在nsLTP蛋白的协助下穿越亲水性细胞壁。本研究结果表明， nsLTP2蛋白作为转运载体直接参与挥发性物质的跨细胞壁运输，并可能通过此类转运功能协助薰衣草应对外界环境胁迫。

4 结论

本研究系统揭示了薰衣草不同组织表皮毛的多样性及其分布规律，明确了头状腺毛与盾状腺毛作为挥发性物质合成与转运关键组织的结构特征，并深入探讨了nsLTP2蛋白在细胞壁中介导挥发性物质转运的生物学功能。结果表明，薰衣草中的nsLTP2蛋白在挥发性物质跨细胞壁运输的过程中具有重要作用。本研究为阐明薰衣草挥发性物质的合成与转运机制提供了理论依据，对高香气品质薰衣草种质的选育工作具有重要的学术价值与应用前景。

参考文献

[1] PEÑUELAS J， LLUSIÀ J.Plant VOC emissions：making use of the unavoidable［J］.Trends in Ecology & Evolution，2004，19（8）：402-404.

[2] DUDAREVA N， KLEMPIEN A， MUHLEMANN J K，et al.Biosynthesis，function and metabolic engineering of plant volatile organic compounds［J］.New Phytologist，2013，198（1）：16-32.

[3] BROSSET A， BLANDE J D.Volatile-mediated plant-plant interactions：volatile organic compounds as modulators of receiver plant defence，growth，and reproduction［J］.Journal of Experimental Botany，2022，73（2）：511-528.

[4] WENG J K， LYNCH J H， MATOS J O，et al.Adaptive mechanisms of plant specialized metabolism connecting chemistry to function［J］.Nature Chemical Biology，2021，17（10）：1037-1045.

[5] ADEBESIN F， WIDHALM J R， BOACHON B，et al.Emission of volatile organic compounds from Petunia flowers is facilitated by an ABC transporter［J］.Science，2017，356（6345）：1386-1388.

[6] GLAS J J， SCHIMMEL B C J， ALBA J M，et al.Plant glandular trichomes as targets for breeding or engineering of resistance to herbivores［J］.International Journal of Molecular Sciences，2012，13（12）：17077-17103.

[7] ICHINO T， YAZAKI K.Modes of secretion of plant lipophilic metabolites via ABCG transporter-dependent transport and vesicle-mediated trafficking［J］.Current Opinion in Plant Biology，2022，66（1）：102184.

[8] LIAO P，RAY S， BOACHON B，et al.Cuticle thickness affects dynamics of volatile emission from Petunia flowers［J］.Nature Chemical Biology，2021，17（2）：138-145.

[9] BONIFACINO J S， GLICK B S.The mechanisms of vesicle budding and fusion［J］.Cell，2004，116（2）：153-166.

[10] LIAO P， MAOZ I， SHIH M L，et al.Emission of floral volatiles is facilitated by cell-wall non-specific lipid transfer proteins［J］.Nature Communications，2023，14（1）：330.

[11] SALLAUD C， GIACALONE C， TÖPFER R，et al.Characterization of two genes for the biosynthesis of the labdane diterpene Z-abienol in tobacco （Nicotiana tabacum） glandular trichomes［J］.The Plant Journal，2012，72（1）：1-17.

[12] KAUR S， KHANAL N， DEARTH R，et al.Morphological characterization of intraspecific variation for trichome traits in tomato（Solanum lycopersicum）［J］.Botanical Studies，2023，64（1）：7.

[13] MISSAOUI K， GONZALEZ-KLEIN Z， PAZOS-CASTRO D，et al.Plant non-specific lipid transfer proteins：an overview［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2022，171（6）：115-127.

[14] CHOI Y E，LIM S， KIM H J，et al.Tobacco NtLTP1，a glandular-specific lipid transfer protein，is required for lipid secretion from glandular trichomes［J］.The Plant Journal，2012，70（3）：480-491.

[15] WANG B， KASHKOOLI A B， SALLETS A，et al.Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A.annua ［J］.Metabolic Engineering，2016，38（7）：159-169.

[16] EDQVIST J， BLOMQVIST K， NIEUWLAND J，et al.Plant lipid transfer proteins：are we finally closing in on the roles of these enigmatic proteins？［J］.Journal of Lipid Research，2018，59（8）：1374-1382.

[17] EDSTAM M M， VIITANEN L， SALMINEN T A，et al.Evolutionary history of the non-specific lipid transfer proteins［J］.Molecular Plant，2011，4（6）：947-964.

[18] SALMINEN T A， BLOMQVIST K， EDQVIST J.Lipid transfer proteins：classification，nomenclature，structure，and function［J］.Planta，2016，244（5）：971-997.

[19] LIU F， ZHANG X B， LU C M，et al.Non-specific lipid transfer proteins in plants：presenting new advances and an integrated functional analysis［J］.Journal of Experimental Botany，2015，66（19）：5663-5681.

[20] ZHANG Y N， WANG D， LI H，et al.Formation mechanism of glandular trichomes involved in the synthesis and storage of terpenoids in lavender［J］.BMC Plant Biology，2023，23：307.

[21] 张夏夏，陈凌娜，杨扬，等.薰衣草非特异性脂质转移蛋白基因nsLTP2-1和nsLTP2-2的克隆与功能分析［J］.植物遗传资源学报，2024，25（5）：834-843.

[22] ZHANG X X， CHEN L N， YANG Y，et al.Cloning and functional analysis of nonspecific lipid transfer protein genes nsLTP2-1 and nsLTP2-2 in lavender［J］.Journal of Plant Genetic Resources，2024，25（5）：834-843.

[23] SHENKAREV Z O， MELNIKOVA D N， FINKINA E I，et al.Ligand binding properties of the lentil lipid transfer protein：molecular insight into the possible mechanism of lipid uptake［J］.Biochemistry，2017，56（12）：1785-1796.

[24] GIULIANI C， BOTTONI M， ASCRIZZI R，et al. Lavandula dentata from Italy：analysis of trichomes and volatiles［J］.Chemistry & Biodiversity，2020，17（11）：e2000532.

[25] SHARMA S， SANGWAN N S， SANGWAN R S.Developmental process of essential oil glandular trichome collapsing in menthol mint［J］.Current Science，2003，84（4）：544-550.

[26] LUO S H， LUO Q， NIU X M，et al.Glandular trichomes of Leucosceptrum canum harbor defensive sesterterpenoids［J］.Angewandte Chemie，2010，49（26）：4471-4475.

[27] 王露，赵天祎，蔡明.植物腺毛中防御物质的合成与调控及转运研究进展［J］.西北植物学报，2021，41（2）：338-347.

[28] WANG L， ZHAO T Y， CAI M.Advances in synthesis，regulation and transportation of defensive substances produced in plant glandular trichomes［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2021，41（2）：338-347.

[29] 刘若菡，刘红燕，张永清.基于场发射扫描电镜的4种唇形科植物腺毛形态观察研究［J］.电子显微学报，2022，41（1）：72-79.

[30] LIU R H， LIU H Y， ZHANG Y Q.Observation on the morphology of glandular trichomes in four species of Lamiaceae based on field emission scanning electron microscope［J］.Journal of Chinese Electron Microscopy Society，2022，41（1）：72-79.

[31] BERGAU N， BENNEWITZ S， SYROWATKA F，et al.The development of type VI glandular trichomes in the cultivated tomato Solanum lycopersicum and a related wild species S.habrochaites ［J］.BMC Plant Biology，2015，15（1）：289.

[32] OLSSON M E， OLOFSSON L M， LINDAHL A L，et al.Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L.［J］.Phytochemistry，2009，70（9）：1123-1128.

[33] XUE S D， DONG M M， LIU X W，et al.Classification of fruit trichomes in cucumber and effects of plant hormones on type II fruit trichome development［J］.Planta，2019，249（2）：407-416.

[34] SHEPHERD R W， BASS W T， HOUTZ R L，et al.Phylloplanins of tobacco are defensive proteins deployed on aerial surfaces by short glandular trichomes［J］.The Plant Cell，2005，17（6）：1851-1861.

[35] CAMERON K D， TEECE M A， SMART L B.Increased accumulation of cuticular wax and expression of lipid transfer protein in response to periodic drying events in leaves of tree tobacco［J］.Plant Physiology，2006，140（1）：176-183.

[36] DEBONO A， YEATS T H， ROSE J K C，et al. Arabidopsis LTPG is a glycosylphosphatidylinositol-anchored lipid transfer protein required for export of lipids to the plant surface［J］.The Plant Cell，2009，21（4）：1230-1238.

[37] HWANG H S， ADHIKARI P B， JO H J，et al.Enhanced monoterpene emission in transgenic orange mint（Mentha×piperita f.citrata） overexpressing a tobacco lipid transfer protein （NtLTP1）［J］.Planta，2020，252（3）：44.

[38] ADHIKARI P B， HAN J Y， AHN C H，et al.Lipid transfer proteins （AaLTP3 and AaLTP4） are involved in sesquiterpene lactone secretion from glandular trichomes in Artemisia annua ［J］.Plant and Cell Physiology，2019，60（12）：2826-2836.

基金资助

第三批新疆维吾尔自治区“2+5”重点人才计划“天池英才”青年博士项目(2025QNBS003)

伊犁师范大学高层次人才引进启动基金项目(2023RCYG14)

伊犁师范大学科技项目(2024YSZD007)