大花红景天盐胁迫调控基因RcNAC22克隆及功能分析

Salt Stress-related RcNAC22 Gene Cloning and Function Analysis in Rhodiolacrenulata

摘要

本研究克隆大花红景天（Rhodiola crenulata）转录因子NAC家族成员之一RcNAC22基因，并对其进行生物信息学分析和功能验证。结果表明：RcNAC22基因全长为1 049 bp，含2个内含子、3个外显子，编码293个氨基酸。其蛋白质相对分子质量为33 625.02，属亲水蛋白，性质较稳定，不具有跨膜结构域和信号肽且亚细胞定位于细胞核，含有32个可磷酸化位点。RcNAC22基因包含1个NAM结构域（no apical meristem），第4结构域为转录抑制结构域NARD区，与狭叶红景天（R. kirilowii）亲缘关系最近。RcNAC22基因在6个器官（根、成熟茎、幼茎、叶、顶芽和花）中均有表达但主要存在于绿色器官（茎、叶、顶芽）中，同时受多种非生物胁迫和植物激素脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）的诱导表达。RcNAC22蛋白对酵母细胞没有毒性，其全长基因和截短C端均具有自激活活性。此外，以丹参（Salviamiltiorrhiza）为转基因受体研究RcNAC22基因过表达对植物生长的影响，结果显示：提高RcNAC22基因表达量不会影响丹参的生长发育过程，但降低其对盐胁迫的耐受性。本研究揭示了RcNAC22基因的生物学功能，为进一步开展大花红景天分子生物学研究提供理论基础。

Abstract

This study cloned the RcNAC22 gene of R. crenulata and conducted bioinformatics analysis and functional verification. The results showed that the full length of RcNAC22 gene was 1 049 bp， containing two introns and three exons， and encoding 293 amino acids. Its protein relative molecular weight was 33 625.02， belonging to a hydrophilic protein， with relatively stable properties， no transmembrane domain or signal peptide， and subcellular localization in the nucleus， containing 32 phosphorylation sites. RcNAC22 contains one NAM domain （no apical meristem）， and the fourth domain is the transcriptional repression domain NARD region， and it was most closely related to that of R.kirilowii. RcNAC22 gene was expressed in all six tested organs （root， mature stem， young stem， leaf， apical bud， flower） but mainly in green organs （stem， leaf， apical bud）， and its expression could be induced by various abiotic stresses and plant hormones ABA and SA. RcNAC22 gene had no cytotoxicity to yeast cells， and both the full-length gene and truncated C-terminal had self-activation activity. In addition， using Salvia miltiorrhiza as the transgenic receptor to study the RcNAC22 gene effect on plant growth， the results showed that overexpression of RcNAC22 gene did not affect the growth and development of Salviamiltiorrhiza， but reduced the tolerance to salt stress. This study revealed the biological function of the RcNAC gene， providing a theoretical basis for further molecular biological research on R. crenulata.

Graphical abstract

关键词

大花红景天 / 转录因子 / 基因克隆 / 盐胁迫

Key words

Rhodiolacrenulata / transcription factor / gene cloning / salt stress

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）转录因子是植物特有的一类蛋白家族，得名于矮牵牛（Petunia hybrida）NAM（no apical meristem）和拟南芥（Arabidopsisthaliana）ATAF1、ATAF2及CUC2（cup-shaped cotyledon）^［1］。NAC家族成员具有明显的结构特点，DNA序列常含3个外显子和2个内含子，蛋白质一级结构可分为保守性较高的N端序列（DNA结合结构域，约150个氨基酸），和变异度较大的C端（转录调控区）^［2］。NAC蛋白常以同源或异源二聚体的形式与下游基因启动子的特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达。在植物生长发育过程中，NAC与细胞分裂分化、种子萌发、器官发育、植物的成熟与衰老及生殖器官形态建成等方面密切相关^［3-5］。此外，NAC基因启动子含多种顺式作用元件，可受到外界各种胁迫如干旱、盐、冷、创伤、病原菌等和植物激素如脱落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯等诱导表达，靶向调控下游基因转录并指导次生代谢产物合成与积累，从而调控植物对外界环境变化的适应性^［6-10］。

植物在生长过程中会受到来自外在和内在的压力，产生各种应激反应，其中NAC转录因子在植物应对环境胁迫的响应中具有重要的调控作用。已有研究^［11-12］表明，水稻（Oryza sativa）OsNAC5、OsNAC14、OsNAC6等基因的表达受低温、干旱、盐、机械创伤和微生物胁迫诱导，并与植物抗逆性呈正相关，提高其转录水平能够提高水稻对干旱、盐的耐受性。番茄（Solanum lycopersicum）SlNAC35基因同样可以提高转基因株系对干旱、盐、细菌病原体的抗性^［13］。玉米（Zea mays）ZmNAC20基因在植物激素ABA处理后快速上调表达，使得过表达植株在干旱条件下加速气孔关闭，降低蒸腾作用，其相对含水量和成活率高于野生型B104^［14］。此外，NAC转录因子还能够调控植物对重金属的耐受性，如丹参（Salviamiltiorrhiza）SmNAC11基因在锌胁迫应答中起重要作用，该基因过表达会增强转基因植物对高锌胁迫的抗性，并且通过结合SmTAT3和SmPAL3启动子序列的CATGTG/C位点，促进丹酚酸合成^［15-16］。另一方面，NAC也可作为负调控因子，如拟南芥AtNAP^［17］、AtNAC016^［18］、AtNAC089^［19］、AtNAC2基因^［20］，山丹（Lilium pumilum）LpNAC13基因^［21］，竹叶花椒（Zanthoxylumarmatum）ZaNAC93基因^［2］，小麦（Triticumaestivum）TaNAC1基因^［22］，红薯（Ipomoeabatatas）IbNAC43基因^［23］等。在烟草（Nicotianatabacum）中过表达LpNAC13基因显示出耐旱性降低，但耐盐性增强。LpNAC13基因过表达降低拟南芥种子对ABA的敏感性，使过表达植株在盐胁迫条件下抗氧化酶活性减弱、脯氨酸和叶绿素含量下降。拟南芥衰老相关的AtNAP基因在盐胁迫反应中起负调控作用。T-DNA插入失活突变体比野生型拟南芥（WT）更耐盐胁迫，而转基因植株（OXs）在种子萌发、幼苗发育和植株成熟阶段比WT对盐胁迫更敏感。AtNAP基因在正常和盐胁迫条件下均抑制ABA应答元件AREB1的启动子活性，使得ABA依赖途径中应激响应基因（如AREB1、RD20和RD29B）的转录水平在atnap突变体中升高，在过表达株系中降低。

大花红景天（Rhodiola crenulata）是多年生草本植物，主要分布于我国西藏、新疆、云南、四川等地，是《中华人民共和国药典（2000年版一部）》收录的红景天正品基原植物，因其根和根茎的浸出液具有抗氧化、抗疲劳、抗辐射、降血糖、抗高原反应等功效，在《本草纲目》《晶珠本草》等典籍中被记载为“祛邪恶气、补诸不足”的良药，也被称为高原人参、雪山仙草。大花红景天的生活环境非常特殊，对其采集和研究都十分困难。因此，目前鲜见关于大花红景天NAC基因克隆与功能分析的报道；本研究克隆大花红景天RcNAC22基因编码区，利用生物信息分析软件分析其基因结构、蛋白质理化性质、三级结构、跨膜结构域、磷酸化位点、亚细胞位置、系统进化树等特征，并解析其组织特异性和非生物胁迫、植物激素处理下的表达模式，验证其转录激活活性，以药用植物模式种丹参为受体利用过表达技术探究转基因株系与野生型丹参在盐胁迫下的表型变化，研究结果将进一步揭示大花红景天NAC基因生物学功能。

1 材料与方法

1.1　植物材料

大花红景天于2015年7月采自西藏自治区拉萨市墨竹工卡县和工布江达县米拉山，样品通过《中国植物志》进行比对鉴定；野生型丹参为南开大学生命科学学院宋文芹教授团队培育的三倍体。

1.2　仪器与试剂

主要仪器：超微量可见光分光光度计（海沛Aurora700，中国），紫外分光光度计（元析UV5900，中国），实时荧光定量PCR（伯乐iQ5，美国），过氧化氢检测试剂盒（凯基生物，中国）；主要试剂：高保真酶PrimerSTAR（宝生物，日本），限制性内切酶（NEB，美国），SYBRGreen Ⅰ（宝生物，日本），逆转录试剂购自日本宝生物，其他生物试剂购自北京庄盟国际有限公司，化学类试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3　大花红景天DNA和RNA提取

大花红景天叶片基因组总DNA提取依照赵为等^［24］建立的CTAB法略有改进；总RNA提取依照本实验室建立的CTAB-异丙醇法^［25］。逆转录PCR体系为40 μL，其中，总RNA为4 μg，逆转录酶2 μL，RNA酶抑制剂2 μL。

1.4　 RcNAC22 基因克隆与验证

大花红景天RcNAC22基因参考序列为本实验室早期试验完成的转录组unigene数据库根据Nr注释筛选得到。利用Primer Premier 5设计引物。PCR扩增依照高保真酶说明书进行，总体积为25 μL，含100 ng DNA或10 ng cDNA，上下游引物各为0.8 μL，12.5 μL 2×PrimerSTAR mix。反应程序为98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，60 ℃复性5 s，72 ℃延伸10 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。RcNAC22基因序列验证依照TA克隆试剂盒进行，将电泳纯化产物与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α。选取3个阳性克隆送至北京生工生物公司，采用M13上下游引物双向测通。

1.5　生物信息学分析

将测序获得的ABI文件导入Contigs进行校准，经ContigExpress拼接，利用DNAstar的MegAlign和BioEdit对拼接序列进行比对和调整以剔除低质量序列和引物区，获取基因编码区。利用Photoshop7.0绘制DNA结构图，利用DANMAN分析同源基因相似度，MEGA 5.0对序列进行clustal W比对并基于比对结果构建N-J进化树。利用在线软件TMHMM sever 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）、Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、netPhos3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）等分析序列跨膜结构、保守结构域、蛋白质理化性质和磷酸化位点^［26］。

1.6　组织特异性表达模式分析与非生物胁迫诱导的材料处理

利用本实验室建立的大花红景天组织扩繁体系，以叶片为外植体获得无性系繁殖苗，并用于后续试验。器官特异性表达模式：选取根、成熟茎、幼茎、叶、顶芽和花6个器官（老茎呈红色、幼茎呈浅绿色）。选取3株生长状态一致的大花红景天无菌组培苗用于非生物胁迫，干旱（20% PEG4000）、低温（0 ℃）、紫外线（UV234 nm）、盐（100 mmol·L^-1）、淹水（低氧）、植物激素脱落酸ABA（50 μmol·L^-1）、水杨酸SA、重金属AgNO₃。将上述材料用无菌水清洗干净后液氮速冻，于超低温冰箱中-80 ℃保存^［27］。胁迫处理后，分别提取叶片和盐胁迫后根系总RNA，用于后续试验。

1.7　表达载体构建

酵母表达载体为pGBKT7，选用的限制性内切酶为EcoRⅠ和BamHⅠ；植物双元表达载体为pCAMBIA3301，选用限制性内切酶为NcoⅠ/BstEⅡ。将上述载体与对应的含目的基因的T载体分别酶切，产物回收后利用T4 DNA连接酶在16 ℃下过夜连接，采用冻融法转化大肠杆菌DH5α。分别挑选3个经菌液PCR验证正确的菌株送至北京生工生物公司进行测序验证。

1.8　酵母自激活验证

提取测序检测正确的阳性质粒，经PEG/TELi法转化酵母菌株Y2H Gold，在SD/-Trp培养基上筛选。为了分析基因的自激活活性和细胞毒性，以pGBKT7为阴性对照，pGBKT7-p53为阳性对照，RcNAC22完整开放阅读框序列、RcNAC22-N端和RcNAC22-C端同时扩大培养至OD₆₀₀为0.6，用无菌水分别稀释10倍、100倍、1 000倍，用移液器取6 μL液体分别滴于SD/-Trp和SD/-Trp-His固体培养基，30 ℃培养3 d后拍照。

1.9　转基因丹参的获取与筛选

提取测序检测正确的阳性质粒，经冻融法转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，在YEB+100 mg·L^-1 rif+100 mg·L^-1 kana培养基上筛选阳性菌株。挑选阳性菌株培养至OD₆₀₀为0.6，利用叶盘法转化丹参。诱导愈伤培养基MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 NAA+0.8 mg·L^-1 Basta+400 mg·L^-1 cef，分化培养基MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA+0.8 mg·L^-1 Basta+400 mg·L^-1 cef，诱导生根培养基MS+0.25 mg·L^-1 IBA+0.8 mg·L^-1 Basta+400 mg·L^-1 cef。30 d后，选择完全健硕的丹参，提取叶片RNA进行分子鉴定，同时对阳性苗进行扩繁。

1.10　盐胁迫处理和生理指标测定

盐胁迫浓度为250 mmol·L^-1 NaCl，材料为生长30 d的野生型（WT）、pCAMBIA3301空载质粒转化空载阳性株（PC）、3株独立的RcNAC22基因过表达阳性丹参苗。用配置好的盐溶液浇灌材料，并继续培养15 d，在第0、5、7、9、11、13、15、19天拍照记录生长情况。在胁迫第13天时，测定单位鲜质量中光合色素（叶绿素、叶黄素）、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性相关参数。分别计算叶绿素a（C_a=13.95×OD₆₆₅-6.88×OD₆₄₉）、叶绿素b（C_b=24.96×OD₆₄₉-7.32×OD₆₆₅）、总叶绿素（C_（a+b）=C_a+C_b）、叶黄素（L=1 000×OD₄₇₀-2.05×C_a-114.8×C_b）和丙二醛［MDA=（6.45×（OD₅₃₂-OD₆₀₀）-0.56OD₄₅₀）/0.015m，μmol·g^-1］含量，以及超氧化物歧化酶活性［A_SOD=［（A_CK-A_E×V_t）］/（½A_CK×m×V_S），U·g^-1］。其中，A_CK为对照管的吸光度，V_S为测定时酶液用量，V_t为酶液总体积，m为样品鲜质量，A_E为样品管的吸光度；H₂O₂含量依照凯基生物试剂盒说明书计算^［28］。

1.11　实时荧光定量PCR

利用Bio-RAD公司的iQ5系统完成实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。反应体系为20 μL，包含10 ng cDNA、10 μL SYBRGreen Ⅰ、各0.8 μL上下游引物，大花红景天内参基因为RcGAPDH，丹参内参基因为SmActin。通过2^-ΔΔCt相对定量法分析基因表达水平。每种样品包含3个生物学重复^［29］。

1.12　数据处理

使用Excel单因素方差分析和t检验对数据进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为极显著差异。采用Photoshop 7.0作图。

2 结果与分析

2.1　大花红景天 RcNAC22 基因克隆与序列分析

测序结果显示，RcNAC22基因编码区序列长度为1 049 bp，DNA序列结构如图1所示，引物序列如表1所示。共包含3个外显子和2个内含子，外显子长度分别为166、288、428 bp。内含子长度为84、83 bp，分别位于167~251 bp和539~621 bp，均为典型的GT-AG内含子。开放阅读框长度为882 bp，可翻译成293个氨基酸，转录起始位点为ATG，终止位点为TGA。核苷酸含量分别为A（23.13%，204）、T（23.92%，211）、G（29.14%，257）和C（23.81%，210）。

2.2　大花红景天RcNAC22蛋白质理化性质分析与功能预测

将RcNAC22蛋白的氨基酸序列提交到NCBI网站进行保守结构域预测，发现其N端含有NAC家族成员典型的NAM保守结构域（图2A）。Expasy-ProtParam分析结果显示，RcNAC22蛋白的总原子数为4 695，化学方程式为C₁₅₀₃H₂₃₂₅N₄₀₃O₄₅₄S₁₀，相对分子质量为33 625.02 Da，等电点为5.21。酸性氨基酸（Asp和Glu）共有45个，碱性氨基酸（Arg和Lys）共有36个，不稳定指数为43.06，结构稳定性差。在氨基酸组成中，亮氨酸（Leu）含量最高（10.6%），半胱氨酸（Cys）含量最低（0.7%），未检测出吡咯赖氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）。蛋白质溶脂系数为76.14，性质较稳定；总平均亲水性为-0.527，具有一定亲水性。利用SWISS-MODEL在线分析软件获得蛋白质的三级结构模式图。研究结果显示，RcNAC22蛋白具有明显区分的N端和C端，二级结构共包含2个α-螺旋，16个β-折叠，以及多个不规则卷曲（图2B）。对其蛋白质的磷酸化位点进行预测，结果显示共32个磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）18个，苏氨酸（Thr）12个，酪氨酸（Tyr）2个，说明该蛋白可被磷酸化/去磷酸化调控（图2C）。RcNAC22蛋白不具有跨膜结构域和信号肽且亚细胞定位于细胞核（图2D、2E）。

2.3　大花红景天RcNAC22进化分析

在NCBI和plantTFDB公共数据库中搜索同源序列，发现RcNAC22与狭叶红景天（Rhodiolakirilowii）CAM8945276.1具有极高相似性，仅4个gap位点，其次为景天科（Crassulaceae）伽蓝菜属（Kalanchoe）疏花落地生根（Kalanchoelaxiflora）Kaladp0055s0183.1。DNAMAN分析序列间的相似度由高到低分别为狭叶红景天（CAM8945276.1）96.95%、疏花落地生根（Kaladp0055s0183.1）73.18%、棉花（Gossypiumhirsutum，NP_001313931.1）59.14%、胡桃（Juglansregia，XP 018849198.1）58.47%、欧洲板栗（Castaneasativa，XP_075673119.1）57.77%、日本毛山榉（Faguscrenata，GMY05302.1）57.72%、栎树（Quercuslobata，XP 030941395.1）57.33%、欧洲桤木（Alnusglutinosa，XP 062178085.1）56.25%、榴莲（Duriozibethinus，XP 022749220.1）55.33%、拟南芥（Arabidopsisthaliana，AT2G17040.1）45.08%。

基于蛋白质氨基酸序列比对结果，不同来源的NAC蛋白N端具有较高保守性，可以分为5个亚结构域（A~E），第4结构域的氨基酸序列为典型的NARD序列（KKTLVFYTGRAPRGCKTDWVMHEYRLPD），C端的变异程度较大（图3）。采用Bootstrap抽样方法（迭代次数为1 000次）估计各分支支持度，构建N-J系统发育树。研究结果所示，RcNAC22与狭叶红景天NAC明显聚为一支，并与疏花落地生根相似，而与其他双子叶植物NAC分为2类，说明景天科植物基因在进化过程中出现具有较大分歧（图4A）。MEME保守结构域预测的RcNAC22可分为5个模块，包括N端的4个与C端1个模块，与景天科植物比较相似，而与拟南芥差距较大（图4B、4C）。

2.4　 RcNAC22 基因组织选择性表达模式分析

大花红景天RcNAC22基因在根、成熟茎、幼茎、叶片、顶芽和花中均有表达，且不同组织间的表达水平差异显著。以根为参考，该基因在绿色组织中如幼茎、叶片和顶芽中超量表达，可达10~12倍；但在非绿色组织如成熟茎、花中表达量较低，成熟茎和花的相对表达量分别为0.84和3.00（图5）。说明RcNAC22基因在大花红景天不同器官内均可发挥作用，但对地上部位营养生长的作用可能更为显著。

2.5　非生物胁迫下 RcNAC22 基因表达模式分析

RcNAC22基因响应非生物胁迫结果如图6，RcNAC22基因表达受盐、淹水（低氧）、紫外线和干旱胁迫的强烈诱导，受低温的显著抑制。盐胁迫处理12 h时，可引起RcNAC22基因的超量表达，分别为对照的22.00倍（叶片）、2.78倍（根），之后逐渐降低（图6A、6B）。低温显著抑制RcNAC22基因的表达（1 d时仅为0.09）（图6C）。淹水胁迫下，RcNAC22基因表达模式呈现先上升后下降的趋势，并在胁迫第2天时达到最高，相对表达量为4.21（图6D）。紫外线（图6E）和干旱胁迫（图6F）对于RcNAC22基因的影响差异较大，在胁迫初期（1 d）前者显著诱导（相对表达量为12.86），后者显著抑制（相对表达量为0.39）。ABA处理早期（6 h）RcNAC22基因相对表达量（0.51）降低，但在12 h时可恢复到初始水平（1.19），随后逐渐降低（图6G）。不同浓度SA处理下，RcNAC22基因相对表达量均升高，在20 μmol·L^-1时最高，为3.60（图6H）；Ag⁺为100 μmol·L^-1时该基因相对表达量最高，为2.79（图6I）。

2.6　 RcNAC22蛋白细胞毒性检测和自激活活性分析

为了初步研究RcNAC22蛋白的转录激活功能，本研究利用酵母自激活检测原理分析其对Y2H gold报告基因His表达能力和细胞毒性。根据氨基酸序列比对结果，将RcNAC22基因分为N端和C端（图7A），分别设计引物构建重组载体转化酵母菌株（引物序列如表1所示）。以pGBKT7为阴性对照，p53为阳性对照，滴板验证RcNAC22基因全长、N端和C端的激活活性。结果表明，pGBKT7-RcNAC22酵母菌株能够在SD/-Trp（图7B）和SD/-Trp-His培养基上正常生长，说明基因全长具有较强的转录活性且无细胞毒性，此外，截短的C端结构域即可行驶转录激活功能，独立N端不具有此活性（图7）。

2.7　 RcNAC22 基因过表达丹参筛选与表型分析

利用农杆菌介导的叶盘法转化丹参获得T0代RcNAC22基因过表达阳性株系（图8A），通过实时荧光定量PCR检测各株系的基因表达量，选择表达量较高的材料用于后续盐胁迫表型分析。结果显示：RcNAC22基因在12个株系中高表达说明候选材料均为阳性株系，并在Line4、Line7、Line9中表达量最高（图8B）。选择Line7为材料分别提取丹参不同发育时期器官的RNA，分析RcNAC22基因是否存在差异表达。由于35S组成型启动子，7个待测器官中RcNAC22基因的表达量无显著差别（图8C）。此外，通过观察正常条件下丹参的形态特征，野生型、空载质粒和RcNAC22转基因株系在形态上无差异（图8D），说明RcNAC22过量表达不会影响丹参的生长发育过程。

2.8　盐胁迫下转基因丹参表型分析

为了进一步分析盐胁迫下RcNAC22基因过表达对丹参生长的影响，利用组织培养技术扩繁5个株系T0代材料（野生型、空载质粒和3种RcNAC22转基因丹参）。将处于同样生长状态的丹参在人工气候室中培养30 d，用蒸馏水配置250 mmol·L^-1 NaCl溶液以底部浇灌的形式对材料进行胁迫处理。研究结果显示：在胁迫早期（0~5 d）转基因株系和对照组的生长表现未见差别；胁迫第7天时，转基因株系叶片边缘出现黄化和坏死。第11天时，转基因株系生长受到抑制，而野生型与空载株系的表型受抑制程度明显较轻。胁迫第13天时，对照组叶片开始出现较大损伤。第15~19天时，持续的盐胁迫引发植株死亡（图9）。上述结果表明，RcNAC22基因过表达不利于丹参对盐胁迫的抗逆性。

2.9　盐胁迫下 RcNAC22 基因过表达丹参株系叶片生理指标分析

盐胁迫前，丹参叶片SOD活性、H₂O₂、MDA和Chl含量在不同材料间无显著差异；胁迫下，与对照相比，RcNAC22基因过表达株系H₂O₂和MDA含量显著增加，分别为对照组的1.5倍、1.7倍（图10A、10C），SOD活性降低，为对照组的0.8倍（图10B），光合色素含量降低约30%（图10D~10F）。

3 讨论

由于大花红景天种子采集十分困难、萌发率低、植株生长缓慢，因此无法大规模人工种植，使得当前主要以野生材料满足市场需求，从而引起了野生资源严重枯竭^［30］。2015年7月，课题组对西藏拉萨市附近药用红景天进行调查时发现，大花红景天的生境已经受到了人类活动的巨大破坏，因此，亟需采取有效措施保护其种质资源，努力实现大花红景天野生资源可持续利用。为了深入了解大花红景天与其高原生境的适应性机制，本研究对RcNAC22基因的结构与功能进行了分析，研究结果一方面能够丰富对药用植物NAC转录因子家族的认识，另一方面为其人工驯化技术的突破和大规模标准化种植体系的实现提供理论依据。

植物转录因子NAC基因编码区多包含2个内含子、3个外显子，本研究中RcNAC22基因的DNA结构与其类似，同时基于氨基酸序列比对结果发现，RcNAC22基因编码蛋白与不同来源的NAC成员均具有相似的氨基酸序列与保守结构域，且亚细胞定位分析显示其主要存在于细胞核中，推测其在体内主要扮演转录调控的功能。作为植物最大的转录因子家族，NAC转录因子家族成员之间必然存在功能上的冗余与差异^［31］。本研究利用组成型启动子在丹参叶片中过表达RcNAC22基因并未引起转基因株系在正常生长环境下外观表型的差别，但RcNAC22基因的组织特异性表达模式及其在8种外界因素下的诱导表达结果表明，其能够广泛地参与植物的生长发育调控和非生物胁迫应答，并推测其在此过程中扮演特殊的角色。这种作用机制可能与其启动子中不同的顺式作用元件有关。此外，该基因编码的蛋白质可受到磷酸化/去磷酸化的调节，从而能够影响下游基因的转录与目标蛋白质的稳定性，使其在大花红景天的生长周期中承担一定的功能。

RcNAC22基因表达受盐胁迫（NaCl）诱导并在根与叶片中呈现相似的表达模式，然而，过表达该基因的丹参株系对盐胁迫的耐受性显著下降。这种特殊调控机制对于NAC家族成员已有报道，如山丹LpNAC13基因表达量受干旱胁迫诱导，但其过表达却降低植株对干旱的耐受性^［21］；小麦TaNAC1基因在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）处理后上调表达，但转TaNAC1基因拟南芥对菌株的耐受性下降^［22］，说明NAC作为负调控因子在植物应答非生物与生物胁迫中的角色呈现多样性。本研究中，最初认为RcNAC22的作用机制可能与其蛋白N端转录抑制结构域NARD的功能有关，但利用酵母表达系统研究发现，RcNAC22基因的完整开放阅读框与截短C端均具有显著的转录激活功能，说明NARD无法抑制该基因的转录激活功能。据此推测，RcNAC22基因可以下调与盐胁迫耐受性正相关的基因表达，使得过表达丹参在盐胁迫下表现出SOD酶活性降低，MDA、H₂O₂含量升高；同时，RcNAC22基因可能上调其他负调控因子的表达，提高植株对盐胁迫的敏感性。

4 结论

本研究克隆了大花红景天NAC转录因子家族的1个成员RcNAC22，该基因全长为1 049 bp，具有2个典型的GT-AG内含子，蛋白质一级与三级结构都可见明显区分的N端与C端。RcNAC22基因在大花红景天的根、茎、叶、花等多个器官中表达，同时该基因表达受干旱、低温、盐、紫外线、淹水、重金属及脱落酸等诱导。RcNAC22蛋白具有转录激活功能，并可通过上调活性氧和丙二醛等成分的积累，降低转基因丹参对盐胁迫的耐受性。综上，RcNAC22基因可广泛参与大花红景天生长发育过程及其逆境响应，研究结果为进一步了解植物NAC转录因子的生物学功能提供参考。

参考文献

[1] SOUER E， VAN HOUWELINGEN A， KLOOS D，et al.The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries［J］.Cell，1996，85（2）：159-170.

[2] TANG N， WU P Y， CAO Z Y，et al.A NAC transcription factor ZaNAC93 confers floral initiation，fruit development，and prickle formation in Zanthoxylum armatum ［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2023，201：107813.

[3] PEREIRA-SANTANA A， ALCARAZ L D， CASTAÑO E，et al.Comparative genomics of NAC transcriptional factors in angiosperms：implications for the adaptation and diversification of flowering plants［J］.PLoS One，2015，10（11）：e0141866.

[4] ZAFAR Z， FATIMA S， BHATTI M F.Comprehensive analyses of NAC transcription factor family in almond （Prunus dulcis） and their differential gene expression during fruit development［J］.Plants，2021，10（10）：2200.

[5] WANG W Q， WANG J， WU Y Y，et al.Genome-wide analysis of coding and non-coding RNA reveals a conserved miR164-NAC regulatory pathway for fruit ripening［J］.New Phytologist，2020，225（4）：1618-1634.

[6] LIU W J， MEI Z X， YU L，et al.The ABA-induced NAC transcription factor MdNAC1 interacts with a bZIP-type transcription factor to promote anthocyanin synthesis in red-fleshed apples［J］.Horticulture Research，2023，10（5）：uhad049.

[7] QIN Y X， ZHANG B， WANG Y N，et al.Characterization of SEC14 family in wheat and the function of TaSEC14-7B in salt stress tolerance［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2023，202：107926.

[8] ZHANG X M， YU H J， SUN C，et al.Genome-wide characterization and expression profiling of the NAC genes under abiotic stresses in Cucumis sativus ［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2017，113：98-109.

[9] CHEN Y H， HUANG Q H， HUA X，et al.A homolog of AtCBFs，SmDREB A1-4，positively regulates salt stress tolerance in Arabidopsis thaliana and Salix matsudana ［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2023，202：107963.

[10] XI Y， LING Q Q， ZHOU Y，et al.ZmNAC074，a maize stress-responsive NAC transcription factor，confers heat stress tolerance in transgenic Arabidopsis ［J］.Frontiers in Plant Science，2022，13：986628.

[11] SINGH S， KOYAMA H， BHATI K K，et al.Correction to：the biotechnological importance of the plant-specific NAC transcription factor family in crop improvement［J］.Journal of Plant Research，2021，134（3）：643.

[12] LEE D K， CHUNG P J， JEONG J S，et al.The rice OsNAC6 transcription factor orchestrates multiple molecular mechanisms involving root structural adaptions and nicotianamine biosynthesis for drought tolerance［J］.Plant Biotechnology Journal，2017，15（6）：754-764.

[13] WANG G D， ZHANG S， MA X C，et al.A stress-associated NAC transcription factor （SlNAC35） from tomato plays a positive role in biotic and abiotic stresses［J］.Physiologia Plantarum，2016，158（1）：45-64.

[14] LIU H， SONG S B， LIU M Y，et al.Transcription factor ZmNAC20 improves drought resistance by promoting stomatal closure and activating expression of stress-responsive genes in maize［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（5）：4712.

[15] YIN X J， FAN H， CHEN Y，et al.Integrative omic and transgenic analyses reveal the positive effect of ultraviolet-B irradiation on salvianolic acid biosynthesis through upregulation of SmNAC1 ［J］.The Plant Journal，2020，104（3）：781-799.

[16] ZHU B， HUO D A， HONG X X，et al.The Salvia miltiorrhiza NAC transcription factor SmNAC1 enhances zinc content in transgenic Arabidopsis ［J］.Gene，2019，688：54-61.

[17] SEOK H Y， WOO D H， NGUYEN L V，et al. Arabidopsis AtNAP functions as a negative regulator via repression of AREB1 in salt stress response［J］.Planta，2017，245（2）：329-341.

[18] SAKURABA Y， KIM Y S， HAN S H，et al.The Arabidopsis transcription factor NAC016 promotes drought stress responses by repressing AREB1 transcription through a trifurcate feed-forward regulatory loop involving NAP［J］.The Plant Cell，2015，27（6）：1771-1787.

[19] ALBERTOS P， TATEMATSU K， MATEOS I，et al.Redox feedback regulation of ANAC089 signaling alters seed germination and stress response［J］.Cell Reports，2021，35（11）：109263.

[20] LU P L， CHEN N Z， AN R，et al.A novel drought-inducible gene，ATAF1，encodes a NAC family protein that negatively regulates the expression of stress-responsive genes in Arabidopsis ［J］.Plant Molecular Biology，2007，63（2）：289-305.

[21] WANG Y， CAO S Y， GUAN C J，et al.Overexpressing the NAC transcription factor LpNAC13 from Lilium pumilum in tobacco negatively regulates the drought response and positively regulates the salt response［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2020，149：96-110.

[22] WANG F T， LIN R M， FENG J，et al.TaNAC1 acts as a negative regulator of stripe rust resistance in wheat，enhances susceptibility to Pseudomonas syringae，and promotes lateral root development in transgenic Arabidopsis thaliana ［J］.Frontiers in Plant Science，2015，6（1）：108.

[23] SUN S F， LI X， NIE N，et al.Sweet potato NAC transcription factor NAC43 negatively regulates plant growth by causing leaf curling and reducing photosynthetic efficiency［J］.Frontiers in Plant Science，2023，14：1095977.

[24] 赵为，邓科君，杨足君，等.景天科植物基因组DNA的高效提取方法［J］.安徽农业科学，2006，34（22）：5804-5805.

[25] ZHAO W， DENG K J， YANG Z J，et al.An effective method of DNA extraction from Crassulaceae plant［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2006，34（22）：5804-5805.

[26] 张力鹏，张银兴，宋文芹，等.红景天属植物叶片RNA高效提取的方法［J］.南开大学学报（自然科学版），2017，50（6）：48-53.

[27] ZHANG L P， ZHANG Y X， SONG W Q，et al.A highly efficient method of RNA extraction from Rhodiola Plant［J］.Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis，2017，50（6）：48-53.

[28] 王宏鹏，成璐路，滕彦娇，等.西藏大花红景天RcUDPGTs基因克隆与表达分析［J］.药学学报，2021，56（7）：2015-2024.

[29] WANG H P， CHENG L L， TENG Y J，et al.Cloning and expression analysis of RcUDPGTs genes in Tibetan Rhodiola crenulata ［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2021， 56（7）：2015-2024.

[30] ZHANG L P， WU M， YU D S，et al.Identification of glutathione peroxidase （GPX） gene family in Rhodiola crenulata and gene expression analysis under stress conditions［J］.International Journal of Molecular Sciences，2018，19（11）：3329.

[31] ZHANG L P， WU M， TENG Y J，et al.Overexpression of the glutathione peroxidase 5 （RcGPX5） gene from Rhodiola crenulata increases drought tolerance in Salvia miltiorrhiza ［J］.Frontiers in Plant Science，2019，9：1950.

[32] 滕彦娇，王宏鹏，王菁，等.大花红景天内参基因筛选与POD基因表达分析［J］.中药材，2021，44（6）：1343-1349.

[33] TENG Y J， WANG H P， WANG J，et al.Study on the screen of reference genes in Rhodiola crenulata and the analysis of POD gene expression［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2021，44（6）：1343-1349.

[34] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2020：8.

[35] Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China：Volume I［M］.Beijing：China Medical Science Press，2020：8.

[36] SUN H， HU M L， LI J Y，et al.Comprehensive analysis of NAC transcription factors uncovers their roles during fiber development and stress response in cotton［J］.BMC Plant Biology，2018，18（1）：150.