基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H₂S合成调控拟南芥耐盐性

The Role of AtMST1 in Regulating Salt Tolerance via H₂S Synthesis in Arabidopsis Revealed by CRISPR/Cas9 Knockout

摘要

硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）是植物体内重要的气体信号分子，其生物合成依赖多种内源生成酶。3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MST）在动物系统中已被证实能够生成H₂S，而拟南芥（Arabidopsis thaliana）MST1也被报道具有类似的酶活性。为在植物体内进一步验证AtMST1蛋白的H₂S生成功能，并探究其在盐胁迫响应中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥AtMST1基因进行定向编辑。通过设计4个靶位点并构建基因编辑载体，经农杆菌（Agrobacterium）转化后，成功获得atmst1纯合突变体。基因型分析表明，突变体在靶位点插入单个T碱基，导致移码突变及蛋白质翻译提前终止。生理检测结果显示，与野生型相比，atmst1突变体的H₂S荧光探针信号强度、H₂S含量及产率均显著降低。在盐胁迫处理下，atmst1植株表现出明显的盐敏感表型，且幼苗根中积累更多的活性氧。综上，本研究成功构建了AtMST1蛋白功能缺失突变体，从遗传学层面证实AtMST1蛋白在植物内源H₂S合成中的关键作用，并揭示其通过调节H₂S水平正调控拟南芥耐盐性的生理功能。

Abstract

Hydrogen sulfide（H₂S） is an important gaseous signaling molecule in plants， and its biosynthesis relies on various endogenous enzymes. The enzyme 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（MST） has been established as an H₂S generator in animal systems， and a similar enzymatic activity has been reported for Arabidopsis MST1. To further validate the H₂S-producing function of AtMST1 in plants and explore its role in salt stress response， CRISPR/Cas9-mediated gene editing to target the AtMST1 gene was employed in Arabidopsis thaliana. By designing four target sites and constructing the gene editing vector， homozygous atmst1 mutants following Agrobacterium-mediated transformation were successfully obtained. Genotyping analysis revealed that the mutant carried a single T-nucleotide insertion at the target site， resulting in a frameshift mutation and premature termination of translation. Compared with the wild type， the atmst1 mutant showed a significant reduction in the intensity of H₂S-specific fluorescent signals， as well as in both H₂S content and production rate. Salt stress treatment resulted in a clear salt-sensitive phenotype and greater reactive oxygen species accumulation in the roots of atmst1 seedlings. In summary， this study successfully created an AtMST1 loss-of-function mutant， providing genetic evidence for its crucial role in endogenous H₂S synthesis in plants and revealing its physiological function in positively regulating salt tolerance in Arabidopsis by modulating H₂S levels.

Graphical abstract

关键词

AtMST1基因 / CRISPR/Cas9基因编辑技术 / 硫化氢 / 拟南芥 / 盐胁迫

Key words

AtMST1 gene / CRISPR/Cas9 gene-editing technology / hydrogen sulfide / Arabidopsis thaliana / salt stress

硫化氢（H₂S）是继一氧化氮、一氧化碳后被发现的第3种气体信号分子^［1］，在哺乳动物中，H₂S具有广泛的生理功能，如调控细胞凋亡、促进炎症修复、介导缺氧保护、参与神经调节、调节细胞增殖及发挥心脏保护作用等^［2-5］。在植物中，H₂S被证实参与调控多个生长发育过程，包括种子萌发、根伸长、开花、衰老、气孔运动和光合作用等^［6-10］。此外，H₂S在植物应答干旱、盐胁迫、镉胁迫等非生物逆境中也发挥重要的生物学作用^［11-13］。

内源H₂S主要通过酶催化反应和非酶促途径在体内产生，其中，酶催化反应是最主要的内源性来源。目前，在哺乳动物中已明确的H₂S合成酶包括胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）、胱硫醚β-合酶（cystathionine β-synthase，CBS）和巯基丙酮酸硫转移酶（mercaptopyruvate sulphurtransferase，MST）。在植物中，已鉴定出多种能够催化生成H₂S的酶类，如半胱氨酸脱巯基酶（cysteine desulphydrases，CDes）、半胱氨酸脱硫酶（cysteine desulfurases）、β-氰丙氨酸合酶（β-cyano-alanine synthase，CAS）、O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶（O-acetylserine（thiol）lyase，OASTL）和胱硫醚β-裂解酶（cystathionine β-lyase，CBL）^［14］。

硫转移酶家族（sulfurtransferase，STR）广泛分布于原核生物和真核生物中^［15］，在真核细胞中，该家族成员主要定位于细胞质和线粒体，其共同特征是含有1个保守的硫氰酸酶（RHOD）结构域^［16-17］。根据序列与功能差异，该家族可划分为3个主要亚群：第1亚群包含动、植物中的3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）；第2亚群包括所有来自高等真核生物的硫代硫酸盐硫转移酶；第3亚群包括来自酵母和蓝藻等若干细菌来源的硫转移酶^［18］。其中，3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）作为硫转移酶家族第1亚群的核心成员，在多种硫代谢通路中发挥关键作用。MST不仅具备该家族共有的RHOD结构域，更在催化3-巯基丙酮酸的硫转移过程中起中心作用，是连接半胱氨酸代谢与活性硫物种生成的重要桥梁^［19］。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中包含2个MST基因，分别命名为AtMST1和AtMST2。亚细胞定位分析^［20］表明：AtMST1主要定位于线粒体，AtMST2主要位于细胞质，两者均表现出对硫供体底物3-巯基丙酮酸（3-MP）的催化偏好。研究^［21］发现，MST的表达不受光照条件调控，其在线粒体中的酶活性约为叶绿体中的2.5倍，且在根和花组织中活性最高。此外，MST基因的转录水平及其编码蛋白的酶活性均随植株发育进程逐渐升高，与植株年龄呈现正相关关系^［18］。这一规律在水稻（Oryza sativa）中同样得到印证，OsSTR2基因mRNA表达量在成熟期达到峰值^［22］。尽管多项证据暗示MST在植物硫代谢中具有重要作用，且其催化生成H₂S的潜力在动物系统中已被认知，然而，MST1是否在植物体内直接承担H₂S生成功能，长期以来缺乏直接的遗传证据。本团队新近发表的研究^［23］通过试验证实，拟南芥AtMST1在体内具备这一生理功能。该研究通过体外原核表达发现AtMST1的H₂S合成酶活性，并进一步利用在拟南芥中构建的过表达及RNA干扰株系，从正反两方面证实AtMST1表达水平可直接调控植株内源H₂S含量，且其与干旱胁迫耐受性呈显著正相关。这些发现为MST1参与植物H₂S信号传导及胁迫响应提供关键的遗传学证据。

为从遗传层面验证AtMST1的H₂S生成功能并探究其在盐胁迫响应中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建AtMST1功能缺失突变体。通过比较突变体与野生型植株的H₂S水平，以及它们在盐胁迫下的表型、根长指标与活性氧（ROS）积累，旨在阐明AtMST1通过H₂S调控植物耐盐性的功能。本研究为解析AtMST1在植物应答非生物胁迫中的分子机制提供关键的遗传材料与理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

以哥伦比亚生态型（Columbia-0，Col-0）拟南芥为试验材料，在本实验室长期保存。质粒pKI1.1R由南方科技大学翟继先教授惠赠。大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）感受态细胞GV3101由本实验室制备并保存。

1.2　方法

1.2.1　拟南芥培养

选取健康饱满的野生型拟南芥种子，于1 mL 75%乙醇中消毒30 s后，置于6% NaClO溶液消毒6 min，无菌水清洗5次，每次5 min，期间持续摇晃。将消毒后的种子播种于pH 5.8的1/2 MS固体培养基上，在组培室中垂直光照培养。培养条件统一设置为温度23 ℃、相对湿度60%、光照强度160 µmol·m^-2·s^-1、光周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2.2　 AtMST1基因靶点引物设计

本研究针对拟南芥AtMST1基因（登录号：At1g79230）设计CRISPR编辑靶点。从TAIR网站（https：//www.arabidopsis.org/）获取该基因CDS序列，利用CRISPR Direct在线工具（http：//crispr.dbcls.jp/）进行gRNA设计，同时采用RNA structure网站（https：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/ Servers/Predict1/Predict1.html）对候选靶点进行二级结构预测，筛选4个最优靶点，用于后续基因编辑载体的构建。

1.2.3　pKI1.1R-AtMST1基因编辑载体构建

本研究针对选定的4个靶点，分别构建4个独立的单靶点CRISPR/Cas9编辑载体。选取各靶点对应的上、下游引物各10 µL混匀，经100 ℃加热5 min后，缓慢冷却至室温完成退火，所得产物于-20 ℃保存备用。随后，利用AarⅠ酶对pKI1.1 R空载体进行单酶切线性化，将线性载体和退火产物按适当比例混合，在T4 DNA连接酶催化下进行重组连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含壮观霉素的LB平板上过夜培养。以pKI1.1R-F和sgRNA反向引物进行菌液PCR鉴定，将扩增条带大小正确的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序确认。

1.2.4　基因编辑纯合植株筛选与鉴定

将成功构建的载体转入农杆菌GV3101中，采用花序浸染法转化拟南芥，收集T1代种子，将收获的T1代种子与野生型种子共同播种于含潮霉素（25 mg·L^-1）的1/2MS筛选培养基，选取生长健壮、具抗性的幼苗移栽至营养土中培养。提取植物基因组DNA，分别使用Cas9-F/Cas9-R与pKI1.1R-F/AtMST1-CRISPR（CR）-R这2对引物进行PCR扩增，初步鉴定得到T1代阳性植株。进一步设计包含靶位点的特异性引物，扩增目标序列，经凝胶回收纯化后送测序，将测序结果与野生型拟南芥基因组序列比对，以确定具体的突变类型。为精确定量阳性植株的编辑效率，将上述靶点PCR回收产物连接至pCE2 TA/Blunt-Zero克隆载体，转化后随机挑取单克隆进行测序，计算编辑效率（编辑效率=（突变克隆数量/总测序克隆数量）×100%）。筛选出目标突变株系AtMST1-CR3-2，通过连续自交与对T2、T3代植株进行潮霉素抗性筛选及靶位点PCR基因型鉴定，获得遗传稳定的株系。为确认T3代突变体的纯合性，随机选取多个单株，对其靶位点PCR产物进行直接测序，所有被测单株均显示完全相同的纯合突变序列，无野生型峰图重叠。

1.2.5　H₂S含量测定

将2周龄拟南芥幼苗用0.05 mol·L^-1 PBS（内含0.2 mol·L^-1 AsA，0.1 mol·L^-1 EDTA，pH 7.0）充分研磨，得到样品匀浆，然后匀浆被转移到40 mL三角瓶中，含500 μL醋酸锌的1.5 mL Ep管放入三角瓶中，作为吸收液，用于吸收反应释放的H₂S。1 mol·L^-1 HCl被加入启动反应，室温反应30 min。将Ep管从三角瓶中取出，加入0.1 mL DPD和0.1 mL FeCl₃终止反应，黑暗条件下反应15 min。于670 nm下测定样品吸光度。

将10 d的拟南芥幼苗浸泡于含10 μmol·L^-1 H₂S探针（7-azido-4-methylcoumarin，AzMC）的缓冲液中（含20 mmol·L^-1 HEPES-NaOH，pH 7.5），室温避光孵育20 min，用20 mmol·L^-1 HEPES缓冲液清洗3次，每次20 min。将根尖固定于载玻片上，置于荧光显微镜下观察，采用Image J软件进行荧光强度分析^［13］。

1.2.6　H₂S产率测定

提取2周龄拟南芥植株总蛋白，加入底物150 μmol·L^-1巯基丙酮酸钠，0.05 mol·L^-1 PBS缓冲液（pH 7.0），0.5 mol·L^-1 DTT。在1.5 mL离心管中装于500 μL 1%的醋酸锌溶液作为吸收液，用于吸收反应释放的H₂S，将1.5 mL Ep管转移到含反应混合液的40 mL带盖锥形瓶中，37 ℃摇床中起始反应。充分反应15 min后，添加100 μL N，N-dimethylphenylendiamine sulfate（DPD，20 mmol·L^-1；7.2 mol·L^-1 HCl）和FeCl₃（30 mmol·L^-1；1.2 mol·L^-1 HCl）终止反应，并在黑暗条件下反应15 min，在670 nm下测定吸光度，计算H₂S产率（nmol·mg^-1·min^-1，H₂S产率=H₂S浓度×1 000×（0.5+0.1+0.1）×0.001/蛋白浓度×0.1×15）。

1.2.7　盐胁迫下植株表型分析

将野生型与atmst1突变体植株的种子消毒后，分别播种在正常1/2MS培养基和含100 mmol·L^-1 NaCl的胁迫培养基上垂直生长14 d后，进行整体表型拍照并测量植株根长，以评估不同基因型对盐胁迫的生长响应差异。

1.2.8　ROS荧光探针检测

为检测盐胁迫下幼苗根中ROS积累量，将幼苗与含10 μmol·L^-1 ROS荧光探针（DCFH-DA）的20 mmol·L^-1 HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.4）中室温避光孵育30 min。随后，使用20 mmol·L^-1 HEPES缓冲液（pH 7.4）洗涤组织3次，每次10 min，以去除未结合的探针。将样品置于载玻片上，于荧光显微镜下观察并拍照，并使用Image J软件对荧光强度进行定量，以分析ROS积累水平。

1.2.9　数据处理

所有数据来自3次独立重复试验，结果以平均值±标准差（mean±SD）表示。釆用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析进行统计学显著检验，P<0.05代表显著差异，P<0.01代表极显著差异。使用Origin 2022软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1　 AtMST1 基因CRISPR/Cas9-sgRNA载体构建

为利用CRISPR/Cas9系统敲除拟南芥AtMST1基因，本研究针对其编码区（CDS）进行设计。AtMST1基因全长为3 471 bp，CDS长度为1 140 bp，包含12个外显子和11个内含子。如图1A所示，选用pKI1.1R作为载体骨架进行编辑载体构建。经生物信息学分析，在AtMST1基因的第1、2、3、5外显子上分别选定4个特异性靶位点（图1B），并设计相应引物（表1）。针对这4个靶点，分别构建4个独立的单sgRNA编辑载体。将退火后的引物和pKI1.1R线性化载体进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR筛选阳性克隆，菌液PCR电泳结果显示，不同阳性克隆的扩增条带在预期大小附近，但存在轻微的条带大小差异（图2），这种差异可能是由电泳过程中的细微偏差所致，进一步提取阳性克隆质粒进行测序验证，结果显示 sgRNA插入序列与设计完全一致，表明载体构建成功。

2.2　 AtMST1 基因编辑突变体的创制与鉴定

将构建的基因编辑载体通过冻融法转入农杆菌GV3101，并采用蘸花法转化拟南芥。收集T1代种子后，将其与野生型种子共同播种于含潮霉素的培养基上。仅有部分T1代种子能萌发并生长为绿色幼苗，其余种子不能萌发或生长严重受抑制，能正常生长的幼苗被初步判定为转基因阳性株（图3）。为验证转基因的整合情况，提取阳性植株叶片基因组DNA进行PCR检测。使用引物对CAS9-F/CAS9-R检测Cas9基因，使用引物对pKI1.1R-F/AtMST1-R检测目的基因片段的插入情况。结果显示，相比野生型植株，阳性植株中均扩增出与预期大小一致的特异性条带，初步证实外源片段已成功整合至拟南芥基因组（图4）。

2.3　靶位点编辑效率评估

为进一步评估基因编辑效率，对初筛阳性植株的靶点侧翼序列进行PCR扩增与测序。结果表明，在多个独立转基因株系中，仅AtMST1-CR3-2株系在目标位点发生有效编辑，具体表现为在切割位点处插入1个单碱基T（图5A、5B），该移码突变致使蛋白质翻译提前终止，具体的氨基酸序列变化参见图5C。

为精确定量该株系的编辑效率，将上述PCR产物克隆至T载体，经菌液PCR初步验证（部分代表性结果见附图1），并随机挑取42个单克隆进行测序。结果显示，该植株为嵌合体，其编辑事件具有异质性：其中21个克隆携带上述T插入突变，8个克隆携带单碱基A插入，13个克隆为野生型序列。而该PCR产物的直接测序色谱图主要显示为T插入的单峰（图5B），这是由于T插入等位基因在群体中占主导地位。据此计算，AtMST1-CR3-2植株在该靶位点的编辑效率为69.0%（29/42）（表2）。

为进一步获得遗传稳定的试验材料，将其连续自交，并在T2代群体中通过基因型鉴定筛选出靶位点为纯合T插入的单株。该单株自交后，对其T3代群体的测序分析显示，所有被测植株均携带相同的纯合突变（图5D），即在目标位点均纯合地携带相同的单碱基T插入，未检测到野生型序列信号。这证明已成功获得遗传稳定的AtMST1纯合功能缺失突变体，并将其命名为 atmst1，用于后续所有功能研究。

2.4　 AtMST1 基因编辑对植株内源H₂S合成的影响分析

为阐明AtMST1基因在植物内源H₂S生物合成中的作用，本研究分别采用荧光探针法和亚甲基蓝法，分析野生型与AtMST1基因编辑植株体内H₂S积累水平。荧光探针检测结果显示，与野生型相比，基因编辑植株中H₂S荧光信号强度显著减弱（图6A、6B），表明其体内H₂S积累水平降低。

进一步通过亚甲基蓝法定量测定植株中H₂S含量与生成速率。结果表明：AtMST1基因突变植株H₂S含量相比野生型降低约20%，且其H₂S生成速率仅为野生型的50%（图6C、6D）。以上结果表明，AtMST1基因编辑显著抑制植株内源H₂S的合成能力。综上，AtMST1基因在植物内源H₂S生物合成中发挥关键作用。

2.5　盐胁迫下 atmst1 突变体的生长表型与活性氧分析

为探究AtMST1蛋白是否参与盐胁迫响应，将WT和atmst1突变体的种子播种在含或不含100 mmol·L^-1 NaCl的培养基上生长14 d。结果显示，盐胁迫显著抑制atmst1突变体幼苗根系生长，其根长显著短于野生型（图7A、7B），表明该突变体对盐胁迫更为敏感。为进一步解析其生理机制，采用ROS荧光探针DCFH-DA对幼苗根尖进行染色。结果表明：在盐胁迫条件下，atmst1根尖的荧光信号强度明显高于野生型，积累更多的ROS（图7C、7D）。这些结果表明，AtMST1蛋白功能缺失会加剧盐胁迫引起的生长抑制，引起根中ROS过量积累，揭示AtMST1蛋白在调控拟南芥盐胁迫耐受性及氧化稳态中具有重要作用。

3 讨论

H₂S作为气体信号分子在植物生理调控中发挥重要作用，但其内源合成途径的关键酶及其调控机制尚待深入解析。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功获得拟南芥AtMST1基因编辑植株，发现其体内H₂S含量与生成速率均显著低于野生型。这一发现与本课题组最新研究^［23］的结论高度吻合。该研究^［23］已证实AtMST1蛋白在体外具备催化H₂S生成的酶活性，并利用过表达及敲除材料证明其能够调控植株体内H₂S水平，且正调控拟南芥的干旱耐受性。本研究在遗传材料上独立验证了上述结论，在基因编辑的遗传学层面证实AtMST1蛋白是拟南芥内源H₂S合成途径中的关键酶。值得注意的是，本研究不仅验证了其酶功能，还进一步揭示了AtMST1蛋白在盐胁迫响应中新的关键作用。盐胁迫试验表明，AtMST1蛋白功能缺失导致植株盐敏感性增加，并伴随根中ROS的过量积累（图7），这暗示AtMST1蛋白介导的H₂S信号在盐胁迫响应过程中发挥至关重要的作用。

哺乳动物中的H₂S生成酶CBS、CSE的表达具有明显的组织特异性。CBS主要定位在肝脏、大脑、肾脏和血管中^［24］，而CSE则在肾脏、肝脏、子宫及外周组织中起主要作用^［25］，两者均为胞质酶。与之不同的是，MST在各个组织中均广泛表达^［26］，并同时定位于细胞质和线粒体。研究显示，MST存在2个剪接转录本，且其在线粒体中的活性约为胞质中的2.5~3.0倍^［27］，提示其亚细胞定位与功能调控密切相关。与哺乳动物系统相比，植物中已鉴定出包括CDes、OASTL、CAS、CBL及MST1在内的多种H₂S合成酶类。这些酶在植物各组织中广泛表达，但在不同组织或细胞区室中表现出明显的表达偏好与亚细胞定位差异。例如，LCD主要定位于细胞核，DES1则分布于细胞质中，而且不同OASTL成员也分别定位在不同的亚细胞区域，这些特异性分布暗示它们在不同生理环境下可能具有功能分工^［28-30］。目前，关于各类酶在具体生理过程中如何协同或分工以精确调控H₂S合成，尚待系统解析。植物中H₂S合成系统的复杂性可能与其固着生长的生存策略密切相关。由于无法通过移动逃避逆境，植物进化出更为冗余和多样化的信号调控网络，以灵活应对多种非生物胁迫。因此，多样化的H₂S合成酶系统可能使其能够响应不同环境信号，并在不同组织或细胞器中精确调控H₂S合成，从而执行特异性的生理功能。

植物体内多种H₂S合成酶并非简单的功能冗余，而是构成一个精细调控网络。研究^［31］表明，不同合成酶基因的启动子元件含有不同的顺式作用元件，能够分别响应冷、热、干旱、重金属等不同胁迫信号。例如，部分CDes基因受干旱条件特异性诱导，而某些OASTL家族成员则特异性响应镉胁迫^［32-33］。这种转录水平的调控差异，正是其功能分工的重要分子基础。因此，不同的H₂S合成酶可能分别参与基础生长发育过程中H₂S稳态的维持，以及在逆境胁迫下介导H₂S的快速积累，从而在种子萌发、根系建成、气孔运动及抗逆反应等生理过程中扮演不同角色。

在评估酶的生理功能时，其体外生化活性与其在生物体内真实贡献可能存在巨大差距。例如，某些半胱氨酸脱巯基酶（如DCD）在体外能高效催化半胱氨酸分解产生H₂S，但在体内由于其底物可用性低或存在竞争性代谢途径，其实际生理贡献较为有限^［34］。相比之下，AtMST1蛋白的底物3-巯基丙酮酸（3-MP）作为半胱氨酸代谢的核心中间产物，处于动态生成和消耗的代谢平衡节点^［18］。尽管目前尚缺乏植物体内3-MP浓度的直接系统测定数据，但本研究结果显示，AtMST1蛋白功能缺失导致植株整体H₂S生成速率下降的幅度较H₂S含量的下降更为显著。这表明，AtMST1蛋白是调控H₂S生成通路的关键酶，其功能缺失会直接限制H₂S合成能力，而H₂S含量的相对稳定，则揭示体内存在其他补偿机制。

本研究结果显示，尽管AtMST1基因编辑显著降低植株内源H₂S水平，但并未引起根系性状的显著变化（附图2），这一现象提示，植物体内可能通过其他H₂S合成酶（如LCD、OASTL等）的功能补偿来维持根系发育所需要的H₂S基本稳态。同时也凸显一个亟待解答的关键问题：不同H₂S合成酶对植物体内总H₂S库的相对贡献比例是多少？目前尚缺乏对各酶合成能力的精确定量评估。基于此，未来的研究应着重于构建atmst1/atlcd等多基因突变体，系统解析不同H₂S合成途径的功能冗余与协同关系；结合H₂S体内实时成像技术与组织特异性表达分析，在时空维度上动态评估不同酶类在特定组织或细胞区室中的贡献；利用已验证的AtMST1基因过表达及敲除材料，深入揭示其在抗旱及耐盐等非生物胁迫应答中的下游分子机制。特别是，本研究发现的盐胁迫下ROS积累表型，提示氧化还原调控可能是AtMST1-H₂S信号模块增强耐盐性的核心下游途径之一，这为后续解析其作用机制提供明确线索。

本研究发现，AtMST1-CR3-2 T1代植株的靶位点存在多种编辑类型（如T插入、A插入）。值得注意的是，对混合PCR产物的直接测序仅能检测到主要的编辑类型（T插入），而TA克隆测序则揭示被掩盖的编辑异质性和真实的编辑效率。这表明在评估CRISPR/Cas9编辑结果时，采用单克隆测序等能够解析单分子水平变异的方法对于准确鉴定初期转化体基因型至关重要。

综上所述，本研究不仅证实了AtMST1在植物内源H₂S合成中的关键作用，也为深入解析植物H₂S信号网络的复杂性及其在环境适应中的调控机制提供材料与理论支撑。

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基金资助

山西省基础研究计划资助项目(202403021212063)

山西省基础研究计划资助项目(202503021211222)

山西大学杏花村学院开放基金项目(XCSXU-KF-202401)