基于黄檗全基因组的苄基异喹啉生物碱生物合成相关O-甲基转移酶基因筛选及功能鉴定

Genome-wide Screening and Functional Verification of O-methyltransferase Genes Involved in Benzylisoquinoline Alkaloid Biosynthesis in Phellodendron amurense

摘要

黄檗（Phellodendron amurense）是一种传统的药用树种，其富含的苄基异喹啉生物碱（BIA）具有显著的药理活性。O-甲基转移酶（OMT）是植物次生代谢中催化酚羟基甲基化的关键酶类，对苄基异喹啉生物碱结构多样化与稳定性具有重要作用。为系统解析黄檗OMT基因家族特征并挖掘参与BIA合成的关键基因，该研究基于黄檗全基因组数据，系统鉴定82个OMT基因家族成员。系统发育分析表明：所有成员均属于ClassⅠ类群，进一步划分为ClassⅠa和ClassⅠb 2个亚族。保守基序分析显示，2个亚族在保留核心SAM结合域的同时，其N端与C端基序组成存在显著差异。染色体定位分析表明：PaOMT基因呈不均匀分布且存在明显串联复制现象。结合黄檗多组织转录组数据筛选及体外酶活验证发现，PaOMT30能够催化（S）-金黄紫堇碱C-2位羟基的O-甲基化，生成（S）-四氢巴马汀红碱。该研究首次系统解析黄檗OMT基因家族特征，并明确PaOMT30在黄檗BIA合成途径中的C-2位甲基化活性，为阐明黄檗药用成分生物合成网络及BIA药物开发奠定了基础。

Abstract

Phellodendron amurense is a traditional medicinal plant recognized for its abundant benzylisoquinoline alkaloids（BIAs）， showing substantial pharmacological properties. O-methyltransferases（OMTs）， pivotal enzymes in plant secondary metabolism， facilitate the methylation of phenolic hydroxyl groups and are crucial for the structural diversity and stability of BIAs. To comprehensively characterize the OMT gene family in P.amurense and identify key genes involved in BIA biosynthesis， this study performed a genome-wide analysis， identifying 82 OMT gene family members. Phylogenetic analysis indicated that all members belonged to the ClassⅠgroup， which can be further subdivided into two subgroups， ClassⅠa and ClassⅠb. Analysis of conserved motifs revealed that， while both subgroups maintained the core S-adenosylmethionine （SAM）-binding domain， they displayed notable differences in the composition of N- and C-terminal motifs. Chromosomal localization analysis illustrated the dispersed distribution of PaOMT genes. By integrating transcriptomic data from multiple tissues with in vitro enzymatic assays， PaOMT30 was identified to catalyze the O-methylation of the C-2 hydroxyl group of（S）-scoulerine， yielding（S）-tetrahydropalmatrubine. This study represented the first comprehensive analysis of the OMT gene family in P. amurense and successfully identified the C-2 methylation activity of PaOMT30 in BIA biosynthesis， establishing a foundation for elucidating the biosynthetic pathways of medicinal components in P.amurense and advancing BIA-based drug development.

Graphical abstract

关键词

黄檗 / 苄基异喹啉生物碱 / O-甲基转移酶 / 甲基化 / 功能表征

Key words

Phellodendron amurense / benzylisoquinoline alkaloids / O-methyltransferase / methylation / functional characterization

黄檗（Phellodendron amurense）为无患子目芸香科（Rutaceae）黄檗属（Phellodendron）植物，其干燥树皮作为传统中药材“关黄柏”使用，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等功效^［1］。现代药理学研究^［2-4］表明，黄檗的主要药用活性成分为原小檗碱类苄基异喹啉生物碱（benzylisoquinoline alkaloids，BIAs），如小檗碱、掌叶防己碱、药根碱等，具有抗菌、抗炎、降血糖、抗肿瘤等生物活性。BIAs的生物合成涉及多种酶类的协同催化，其中O-甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）是促成BIA结构多样性的关键酶类之一^［5］。OMT能够以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，特异性催化BIA前体物质酚羟基上的甲基化反应，生成一系列结构各异、活性不同的O-甲基化衍生物。

在植物中，OMTs根据序列与功能可分为3大类：ClassⅠ类群主要催化植物的特定代谢途径，包括咖啡酸、苯类、酚类、类黄酮和生物碱的代谢途径；ClassⅡ类群主要参与花色苷等色素的甲基化修饰；ClassⅢ类群则参与咖啡酸前体7-甲基黄嘌呤及水杨酸和茉莉酸等激素代谢物的甲基化修饰^［6-8］。目前，在罂粟（Papaver somniferum）、黄连（Coptis chinensis）等模式BIA植物中已有多个OMTs的功能被成功解析^［9-12］，但针对黄檗OMTs基因家族的结构特征与催化功能仍缺乏系统性的研究。

黄檗基因组与转录组数据的完成^［13-14］，为本研究系统鉴定OMTs基因家族成员结构特征及功能提供数据支撑。本研究基于黄檗基因组数据^［13］，利用生物信息学分析，鉴定黄檗OMTs家族成员，解析其系统进化关系、保守基序、结构域等信息，结合OMTs基因在黄檗不同组织中的表达模式，筛选候选基因，并通过原核表达体系和体外酶活试验鉴定其催化功能。本研究旨在阐释黄檗BIAs生物合成中关键甲基转移酶的催化功能，为后续通过基因工程或代谢工程手段改良黄檗品质、提高目标活性成分产量奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

黄檗根采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校内林场。在前期研究^［14］中，本课题组已完成黄檗18个不同组织部位的转录组测序（PRJNA859281），包括根的韧皮部和木质部、须根，来自2~3年生枝条的6个不同发育阶段茎的韧皮部与木质部，以及树主干的韧皮部、叶柄和叶片。

1.2　 OMT 基因家族鉴定

基于黄檗基因组数据，以已报道功能的PaOMT蛋白序列为参考，通过BLASTP（E值>10^-10）从黄檗的基因组蛋白文库中鉴定OMTs同源基因。去除蛋白序列长度小于250 aa和大于600 aa的同源基因，最终从黄檗中获得82个OMTs蛋白序列用于后续分析。

1.3　 OMT 基因家族系统发育关系分析

从NCBI数据库下载来自不同物种具有多种甲基化活性的OMTs家族（ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ）基因序列（表1），并与黄檗中的OMTs同源基因共同进行系统进化分析。使用MAFFT^［15］进行多重序列比对，经trimAI修剪后，利用IQTree^［16］构建系统进化树，Bootstrap值设为1 000。

1.4　 OMT 基因的保守基序、基因注释及染色体定位分析

利用TBtools^［17］软件的Simple MEME Wrapper模块对PaOMT基因家族进行保守基序分析，保守基序数量设定为20。通过NCBI在线工具CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对PaOMT蛋白序列进行结构域注释。同时，使用TBtools将黄檗OMT基因定位至相应的染色体，并对分析结果进行可视化处理。

1.5　候选基因筛选

基于黄檗18个不同组织部位的转录组数据^［14］，提取并鉴定出PaOMT基因，利用R语言的Heatmap对其表达谱进行分析。筛选黄檗各组织中FPKM值大于50的PaOMT基因，作为后续功能研究的候选基因。

1.6　候选 PaOMT 基因在大肠杆菌中异源表达及功能验证

选取pET-28a（+）原核表达质粒的EcoRⅠ限制性内切酶识别位点作为线性化酶切位点，设计候选基因的引物序列（表2）。将PCR扩增获得的OMT编码序列通过ClonExpress®Ⅱ一步克隆试剂盒（诺唯赞，C112）分别构建至线性化pET-28a（+）载体中，获得重组表达质粒pET28a-OMTs，并将其转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞。选取阳性菌液接种于8 mL LB培养基（含50 μg∙mL^-1卡那霉素）中，在37 ℃、200 rpm条件下振荡培养过夜。取1 mL菌液转接至20 mL LB液体培养基（含50 μg∙mL^-1卡那霉素），在37 ℃、200 rpm条件下继续培养至OD₆₀₀达到0.6~0.8。随后加入终浓度为0.3 mmol∙L^-1的IPTG，于16 ℃、180 rpm条件下诱导表达12~16 h。诱导结束后，以5 000 rpm离心收集菌体，用50 mmol∙L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，含5 mmol∙L^-1β-巯基乙醇和10%甘油）重悬菌体沉淀，经超声破碎（功率60 W，工作5 s间歇5 s，总时长5 min）后，于4 ℃、12 000 rpm条件下离心15 min，收集上清液即得粗酶液。

为检测OMT候选蛋白的催化活性，本试验选取（S）-金黄紫堇碱作为底物，选择CcSMT、PaOMT1和PaOMT9作为阳性对照，空载体作为阴性对照。体外酶促反应体系包含60 μL粗酶液、2 mmol∙L^-1S-腺苷甲硫氨酸和底物50 μg∙mL^-1（S）-金黄紫堇碱，用Gly-NaOH缓冲液（pH 9.0）补足至100 μL，并在37 ℃、200 rpm条件下反应过夜。随后加入体积分数50%甲醇终止反应。

粗酶反应样品通过岛津LC-2050C 3D高效液相色谱（HPLC）检测。色谱柱为Hypersil GOLDTM C18 25005-254630（5 μm，4.6 mm×250 mm），检测波长λ=282 nm，柱温35 ℃；进样量10 μL，流速0.5 mL∙min^-1。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和色谱甲醇（B）组成，线性梯度洗脱程序如下：5% B，0~1 min；5%~30% B，1~3 min；30%~60% B，3~15 min；60%~100% B，15~20 min；100%~5% B，20~25 min；5% B，25~30 min。使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）系统（SCIEX TripleTOF 6600+）检测具有催化活性的反应样品，色谱柱为Kinetex C18 100A分析柱（4.6 mm×150 mm，2.6 µm），柱温30 ℃；进样量1 μL，流速0.4 mL∙min^-1。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，线性梯度洗脱程序如下：10% B，0~1.00 min；10%~95% B，1.00~11.00 min；95% B，11.00~12.50 min；95%~10% B，12.50~12.51 min；10% B，12.51~13.00 min。质谱仪参数设置为正离子模式下电喷雾电离（ESI）模式；喷雾电压为3.5 kV；GAS1为40 psi；GAS2为60 psi，碰撞能量为25~50 eV。

2 结果与分析

2.1　甲基转移酶基因家族系统发育和保守基序分析

通过BLASTP同源比对鉴定黄檗中OMT同源基因，经筛选（去除长度小于250 aa或大于600 aa的序列）后获得82个成员，命名为PaOMT1~ PaOMT82（表3）。将这些基因与来自不同物种的ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ OMT共同构建系统进化树，并对其保守结构域与基序组成进行系统分析（图1）。系统发育分析表明，所有黄檗OMT均归属于ClassⅠ类群，且该类群根据拓扑结构可进一步划分为ClassⅠa与ClassⅠb 2个亚族。保守基序分析结果进一步支持这一亚族划分，揭示2个亚族在基序组成上存在显著差异。

对保守基序的深入分析表明，ClassⅠa与ClassⅠb亚族虽均主要包含15个保守基序，显示出它们作为同一类群的整体相似性，但其N-端或C-端的特定基序组成存在显著差异，这可能是导致其功能分化的关键结构基础。具体而言，ClassⅠb亚族成员包含motif11、motif8、motif10、motif6、motif9、motif7、motif3、motif5、motif14、motif2、motif18、motif1、motif12、motif4和motif15，而ClassⅠa亚族则由motif16、motif8、motif20、motif6、motif9、motif17、motif19、motif3、motif5、motif2、motif18、motif1、motif13、motif4和motif14构成。其中，ClassⅠb特有的motif7、motif11和motif12，以及ClassⅠa特有的motif13、motif16、motif17、motif19和motif20，构成了区分这2个亚族的特异性基序。这些特有基序可能决定了各自底物结合口袋微环境或蛋白质相互作用特异性，从而赋予其催化不同底物进行甲基化修饰的潜能。此外，所有类群成员均完整保留由motif1、motif2、motif3、motif5等构成的S-腺苷甲硫氨酸结合及催化核心区域，证明该基因家族功能的保守性。

基因注释结果显示：ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ含有不同的特征结构域家族，ClassⅠ主要为负责二聚化的dimerization2 superfamily/dimerization和结合S-腺苷甲硫氨酸的AdoMet_MTases superfamily（部分为Methyltransf_2）；ClassⅡ和ClassⅢ分别为PLN02589和Methyltransf_7。

2.2　 PaOMT 基因的染色体定位分析

利用TBtools软件进行染色体定位分析，结果显示：82个基因在25条染色体骨架上呈无规则分布，且不同染色体骨架上的基因分布密度存在差异，基因数量在1~14个之间（图2）。其中，第5号染色体上基因分布最为密集，包含14个PaOMT基因；而在8条染色体（chr9、chr13、chr16、chr21、chr25、chr35、chr37和chr38）上，基因分布最少，每条染色体仅含有1个PaOMT基因。值得注意的是，在多个染色体上均发现OMT基因成簇聚集现象，形成包含3~14个基因的密集区域。例如，5号染色体上存在一个包含14个基因的聚集区。这些基因簇成员在系统进化树中归属于相同的亚组，提示其可能来源于近期的串联复制事件。此外，黄檗OMT基因定位图谱表明，串联复制是黄檗OMT基因家族扩增的重要机制。

2.3　 PaOMT 基因表达谱分析及候选基因筛选

基于课题组前期的黄檗转录组数据，分析OMT基因在黄檗不同组织中的表达模式，并筛选潜在的功能基因（图3）。根据聚类分析，PaOMT成员在18个组织中的基因表达存在显著差异。其中，28个基因PaOMT1~PaOMT9，PaOMT18、PaOMT20、PaOMT21、PaOMT22、PaOMT28、PaOMT30、PaOMT45~PaOMT47、PaOMT50、PaOMT52/53、PaOMT63/64、PaOMT70~PaOMT72、PaOMT79和PaOMT81在黄檗根或某一特定组织中的FPKM值高于50。大部分基因在黄檗根中表达较高，例如PaOMT1~PaOMT3、PaOMT5、PaOMT45/46和PaOMT72；个别基因在其他组织中表达较高，如PaOMT30、PaOMT53和PaOMT81在茎中表达较高，PaOMT20在树皮中表达较高。此外，其余54个基因在黄檗各组织中均低表达或几乎无表达，如PaOMT62、PaOMT74和PaOMT82。在这28个高表达基因中，部分成员已被证实参与黄檗BIA生物合成途径的关键甲基化步骤：PaOMT4/5能够催化（S）-去甲乌药碱C-6位羟基的甲基化；PaOMT3负责3'-羟基-N-甲基乌药碱C-4'位的甲基化修饰；PaOMT1则可催化（S）-金黄紫堇碱在C-9和C-2位发生连续甲基化反应；而PaOMT2、PaOMT7~PaOMT9则参与BIA合成中的N-甲基化过程^［13］。考虑到PaOMT18和PaOMT21的蛋白序列不完整，且PaOMT45/46、PaOMT63/64存在序列冗余，本研究最终筛选出16个非冗余且功能尚未明确的候选基因，作为后续功能验证的研究对象。

2.4　候选 PaOMT 基因在大肠杆菌中异源表达及功能验证

在筛选获得的16个候选基因中，除PaOMT20因未能成功扩增而缺失外，其余15个OMTs（PaOMT6/22/28/30/45/47/50/52/53/63/70/71/72/79/81）候选基因成功克隆并分别构建到原核表达载体pET28a中，随后在大肠杆菌中诱导蛋白表达。以（S）-金黄紫堇碱（1）为底物，对超声破碎后获取的粗酶液进行体外酶活性测试，以鉴定候选PaOMTs蛋白的甲基化活性（图4）。HPLC检测分析发现，PaOMT1可催化（S）-金黄紫堇碱生成2个产物峰，即（S）-四氢非洲防己碱（2）和（S）-四氢巴马汀（3），这与已报道的功能一致^［13］。PaOMT30在以（S）-金黄紫堇碱为底物时，在21.20 min催化生成新的产物峰4。根据底物特性推测，PaOMT30能够催化底物（S）-金黄紫堇碱的C-2羟基发生O-甲基化，生成（S）-四氢巴马汀红碱（4，M+H⁺m/z=342）。反应产物峰的二级离子碎片图谱见图5。

3 讨论

黄檗OMTs基因家族鉴定结果显示，从基因组中鉴定出的82个OMT成员，数量显著多于拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物，这可能与其复杂的次生代谢特征，尤其是BIA合成途径多样性密切相关。系统发育分析表明，所有黄檗OMT蛋白均归属于ClassⅠ类群，该类群可进一步划分为ClassⅠa和ClassⅠb 2个亚族，这一划分得到系统进化树拓扑结构和保守基序分析结果（高支持率）的有力支持。值得注意的是，尽管2个亚族均保留了负责SAM结合与催化的核心基序，但其两端的基序组成存在显著差异，这些特异性基序可能通过影响底物结合口袋的构象，从而决定其对不同类别BIA的催化特异性。

基因复制在PaOMT基因家族扩张中发挥了关键作用。染色体定位分析显示，PaOMT基因在基因组中呈不均匀分布，并在多个染色体上形成明显的基因簇，其中5号染色体上的基因簇包含14个成员。这些位于同一基因簇的成员在系统进化树上往往聚集于同一分支，表明串联复制是该基因家族扩张的主要驱动力^［18］。推测OMT基因的串联复制通过亚功能化或新功能化进化，丰富黄檗的次生代谢谱，进而增强其环境适应性。本研究通过分析PaOMT基因在黄檗各组织中的表达模式，并结合体外酶活试验证实，PaOMT30能够以（S）-金黄紫堇碱为底物，催化生成（S）-四氢巴马汀红碱，鉴定出黄檗BIA生物合成途径中未知的C-2氧甲基化步骤。总之，本研究在全基因组层面对黄檗OMT基因家族进行系统性分析，成功鉴定出可催化（S）-金黄紫堇碱C-2位羟基O-甲基化的PaOMT30，为解析黄檗BIA生物合成中的甲基化修饰机制提供了重要依据。

参考文献

[1] 徐鸿雁，王洪伟，张娟，等.浅谈珍贵树种黄檗资源利用与保护对策［J］.南方农业，2023，17（21）：182-185.

[2] XU H Y， WANG H W， ZHANG J，et al.A brief discussion on resource utilization and protection strategies of the rare tree species Phellodendron amurense ［J］.South China Agriculture，2023，17（21）：182-185.

[3] FAN K Q， ZHANG L M， SONG F Y，et al.Pharmacological properties and therapeutic potential of berberine：a comprehensive review［J］.Frontiers in Pharmacology，2025，16：1604071.

[4] BALÁŽOVÁ L， KURHAJEC S， KELLO M，et al.Antiproliferative effect of Phellodendron amurense Rupr. based on angiogenesis［J］.Life，2022，12（5）：767.

[5] CHEN S S， SHEN W N， LIU Y H，et al.Efficacy and safety of triple therapy containing berberine，amoxicillin，and vonoprazan for Helicobacter pylori initial treatment：a randomized controlled trial［J］.Chinese Medical Journal，2023，136（14）：1690-1698.

[6] TIAN Y， KONG L Z， LI Q，et al.Structural diversity，evolutionary origin，and metabolic engineering of plant specialized benzylisoquinoline alkaloids［J］.Natural Product Reports，2024，41（11）：1787-1810.

[7] BU J L， ZHANG X H， LI Q S，et al.Catalytic promiscuity of O-methyltransferases from Corydalis yanhusuo leading to the structural diversity of benzylisoquinoline alkaloids［J］.Horticulture Research，2022，9：uhac152.

[8] LASHLEY A， MILLER R， PROVENZANO S，et al.Functional diversification and structural origins of plant natural product methyltransferases［J］.Molecules，2023，28（1）：43.

[9] LISCOMBE D K， LOUIE G V， NOEL J P.Architectures，mechanisms and molecular evolution of natural product methyltransferases［J］.Natural Product Reports，2012，29（10）：1238-1250.

[10] MORISHIGE T， TSUJITA T， YAMADA Y，et al.Molecular characterization of the S-adenosyl-L-methionine：3'-hydroxy-N-methylcoclaurine 4'-O-methyltransferase involv-ed in isoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica ［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275（30）：23398-23405.

[11] CABRY M P， OFFEN W A， SALEH P，et al.Structure of Papaver somniferum O-methyltransferase 1 reveals initiation of noscapine biosynthesis with implications for plant natural product methylation［J］.ACS Catalysis，2019，9（5）：3840-3848.

[12] CHANG L M， HAGEL J M， FACCHINI P J.Isolation and characterization of O-methyltransferases involved in the biosynthesis of glaucine in Glaucium flavum ［J］.Plant Physiology，2015，169（2）：1127-1140.

[13] SHAH S B A， KONG L Z， DONG Y Z，et al.Selection and functional identification of berberine biosynthetic genes in Berberis amurensis ［J］.Medicinal Plant Biology，2025，4（1）：e024.

[14] XU Z C， TIAN Y， WANG J，et al.Convergent evolution of berberine biosynthesis［J］.Science Advances，2024，10（48）：eads3596.

[15] LIU T X， ZHANG W R， WANG S J，et al.Metabolome and transcriptome association study reveals biosynthesis of specialized benzylisoquinoline alkaloids in Phellodendron amurense ［J］.Chinese Herbal Medicines，2025，17（1）：178-188.

[16] KATOH K， MISAWA K， KUMA K I，et al.MAFFT：a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform［J］.Nucleic Acids Research，2002，30（14）：3059-3066.

[17] NGUYEN L T， SCHMIDT H A， VON HAESELER A，et al.IQ-TREE：a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies［J］.Molecular Biology and Evolution，2015，32（1）：268-274.

[18] CHEN C J， CHEN H， ZHANG Y，et al.TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］.Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[19] AN Z J， GAO R R， CHEN S S，et al.Lineage-specific CYP80 expansion and benzylisoquinoline alkaloid diversity in early-diverging eudicots［J］.Advanced Science，2024，11（19）：e2309990.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(82274037)