复合诱导子和光质诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞次生代谢产物的影响

Effects of Composite Inducers and Light Quality Inducers on Secondary Metabolites in Epimedium sagittatum Suspension Cells

摘要

通过添加不同浓度复合诱导子及不同光周期的光质诱导子，探讨复合诱导子和光质诱导子对箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum）悬浮细胞主要次生代谢产物的影响。该研究在最佳培养条件下，设计正交试验，将25、50、75 μmol⋅L^-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），25、50、75 μmol⋅L^-1水杨酸（salicylic acid，SA），0、10、20 mg⋅L^-1壳聚糖（chitosan，CTS）3种诱导子进行复合诱导，并选取不同光质和光周期进行诱导。结果表明：与对照组相比，经过复合诱导子和光质诱导子处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中，黄酮醇苷、总黄酮、总酚酸及总皂苷等次生代谢产物含量均呈现上升趋势。F4处理组（50 µmol⋅L^-1 MeJA、25 µmol⋅L^-1 SA、20 mg⋅L^-1 CTS）和G6处理组（蓝光，16 h）黄酮醇苷含量显著高于对照组，分别是对照组的2.92倍和3.79倍；F3处理组（25 µmol⋅L^-1 MeJA、50 µmol⋅L^-1 SA、10 mg⋅L^-1 CTS）和G6处理组（蓝光，16 h）总黄酮含量显著高于对照组，分别为对照组的1.42倍和1.27倍；F2处理组（25 µmol⋅L^-1 MeJA、25 µmol⋅L^-1 SA）和G4处理组（蓝光，12 h）总酚酸含量显著高于对照组，分别为对照组的4.11倍和2.94倍；F8处理组（75 µmol⋅L^-1 MeJA、75 µmol⋅L^-1 SA）和G2处理组（白光，12 h）总生物碱含量高于对照组，分别是对照组的1.28倍和1.02倍；F5处理组（50 µmol⋅L^-1 MeJA、50 µmol⋅L^-1 SA）和G6处理组（蓝光，16 h）总皂苷含量显著高于对照组，分别是对照组的3.73倍和3.05倍。因此，添加外源诱导子是提高箭叶淫羊藿次生代谢产物的有效途径，对黄酮类化合物和总皂苷等次生代谢产物的合成与积累具有显著促进作用。

Abstract

This study investigated the effects of composite inducers at varying concentrations and photomorphogenic inducers under different photoperiods on the major secondary metabolites in Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc.） Maxim. suspension cells. Orthogonal experiments were conducted under optimal culture conditions to evaluate the effects of three composite inducers： MeJA at 25， 50， and 75 μmol⋅L^-1； SA at 25， 50， and 75 μmol⋅L^-1； and CTS at 0， 10， and 20 mg⋅L^-1. Additionally， induction was performed under varying light qualities and photoperiods. The findings demonstrated that the levels of secondary metabolites， including flavonol glycosides， total flavonoids， total phenolic acids， and total saponins， increased in E. sagittatum suspension cells treated with composite inducers and photomorphogenic inducers compared to the control group. The F4 treatment group （50 µmol⋅L^-1 MeJA， 25 µmol⋅L^-1 SA， 20 mg⋅L^-1 CTS） and G6 treatment group （blue light， 16 h） exhibited significantly higher flavonol glycoside content， being 2.92 and 3.79-fold higher than the control， respectively. The F3 treatment group（25 µmol⋅L^-1 MeJA， 50 µmol⋅L^-1 SA， 10 mg⋅L^-1 CTS） and G6 treatment group（blue light， 16 h） demonstrated significantly higher total flavonoid content， approximately 1.42 and 1.27-fold higher than the control， respectively. The F2 treatment group（25 µmol⋅L^-1 MeJA， 25 µmol⋅L^-1 SA） and G4 treatment group （blue light， 12 h） exhibited significantly elevated total phenolic acid content， being 4.11 and 2.94-fold higher than the control， respectively. The F8 treatment group（75 µmol⋅L^-1 MeJA， 75 µmol⋅L^-1 SA） and G2 treatment group （white light， 12 h） exhibited higher total alkaloid content， being 1.28 and 1.02-fold higher than the control， respectively. The total saponin content in the F5 treatment group（50 µmol⋅L^-1 MeJA， 50 µmol⋅L^-1 SA） and G6 treatment group（blue light， 16 h） was significantly higher， being 3.73 and 3.05-fold higher than the control， respectively. These results indicated that the application of exogenous inducers effectively enhanced the synthesis and accumulation of secondary metabolites， such as flavonoids and total saponins， in E. sagittatum.

Graphical abstract

关键词

箭叶淫羊藿 / 悬浮细胞 / 复合诱导子 / 光质诱导子 / 次生代谢产物

Key words

Epimedium sagittatum / suspension cells / composite inducers / light quality inducers / secondary metabolites

箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum），又称三枝九叶草，属于小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（Epimedium）多年生草本植物，是淫羊藿药材的主要基原植物之一。其性温，味辛、甘，归肝、肾经。自《神农本草经》首次记载以来，该植物一直被历版《中华人民共和国药典》收录^［1］。其化学成分主要包括黄酮类、多糖类、木脂素类和生物碱类化合物^［2］。近年来，随着以淫羊藿为主要原料的仙灵骨葆胶囊、骨松宝胶囊、淫羊藿素软胶囊等中成药市场需求激增，淫羊藿野生资源濒临枯竭。选择合适的淫羊藿人工培养技术成为保障药材可持续供给的关键。目前，大量研究表明，利用植物细胞培养技术生产天然产量较低的次生代谢产物，是缓解植物资源有限问题的有效途径之一。其中，植物细胞悬浮培养技术以愈伤组织为起始材料，将离体植物组织置于液体培养基中，经摇床培养促其生长。优质悬浮细胞系具有松散、分布均匀、生长快、重复性高且易于调控等特性，是研究植物生长发育机制及代谢调控的重要手段^［3］，尤其在药用植物有效成分研究中作用显著，已在三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）^［4］、宿半夏（Pinellia ternate）^［5］、肉苁蓉（Cistanches Herba）^［6］等多种药用植物中建立了细胞悬浮体系。本课题组前期研究^［7］表明，箭叶淫羊藿悬浮细胞生长速度较快，次生代谢产物含量高且稳定，因此悬浮细胞培养是解决箭叶淫羊藿次生代谢产物不足的有效方法之一。

诱导子是一种特殊的物质，能够激发植物组织细胞产生并积累植保素，同时引发植物的过敏反应^［8］。诱导子作用于植物细胞内的特定基因，迅速且有选择性地诱导植物特定基因的表达，从而促使植物大量合成并积累次生代谢产物^［9］。在植物悬浮细胞中添加诱导子，可通过激活防御反应、调控代谢途径、优化信号传导等方式，显著提高目标次生代谢产物的产量，同时促进细胞生长与产物稳定性，是植物细胞培养中提升生产效率的关键技术手段。王晓丽等^［10］研究发现，水杨酸、壳聚糖可提高雷公藤（Tripterygium wilfordii）悬浮不定根中次生代谢产物含量；郝甜甜等^［11］研究发现，茉莉酸甲酯和水杨酸对西洋参（Panax quinquefoliusm）愈伤组织生长和皂苷生物合成有影响；雷瑞祥等^［12］研究发现，水杨酸可提高秦艽（Gentiana macrophylla）愈伤组织总酚酸、总黄酮的含量；王俊燚^［13］研究发现，茉莉酸甲酯可以提高银杏（Ginkgo biloba）悬浮细胞中黄酮产量，表明茉莉酸甲酯、水杨酸和壳聚糖诱导子可提高植物悬浮体系中次生代谢产物含量。除上述诱导子外，环境因素也会显著调控次生代谢产物合成，其中光照是植物生命活动中最重要的环境因素之一。Yang等^［14］研究了不同光照对箭叶淫羊藿次生代谢产物的影响，发现蓝光处理通过上调黄酮合成基因的表达水平，增加了叶片中朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的含量。因此，研究不同光质处理对箭叶淫羊藿悬浮细胞次生代谢产物的影响，可为添加不同光质提高植物次生代谢产物含量在生产实践中的应用提供理论依据。

课题组的前期研究^［15］表明，茉莉酸甲酯、水杨酸和壳聚糖等单一植物激素作为诱导子能有效促进箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮的积累，其中50 μmol·L^-1茉莉酸甲酯、50 μmol·L^-1水杨酸和10 mg·L^-1壳聚糖效果最为显著。前期试验结果表明，单一诱导子能有效提高箭叶淫羊藿次生代谢产物含量，且复合诱导子间或具协同增效作用；同时，不同波段光质处理试验可与前期蓝光研究形成互补验证。基于此，本研究采用三因素三水平正交试验设计，旨在筛选出促进箭叶淫羊藿悬浮细胞次生代谢产物积累的最优诱导子组合，以及调控其次生代谢最有效的光质条件，从而为箭叶淫羊藿悬浮细胞次生代谢产物的高效调控与组织培养技术优化奠定理论基础，并为LED光质应用于药用植物组织培养中的精准调控提供科学参考。

1 材料与方法

1.1　材料

箭叶淫羊藿悬浮细胞由河南中医药大学道地药材生态种植工程技术研究中心保存。在箭叶淫羊藿愈伤组织接种至固体培养基14 d后，选取生长状态良好的愈伤组织，在超净工作台上将其转移至三角瓶液体培养基中进行悬浮培养。培养条件为温度25 ℃，转速110 r·min^-1，环境保持黑暗。培养液配方沿用继代愈伤组织的培养基营养配比，具体为WPM培养基+1.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2，4-D +20 g·L^-1蔗糖，pH调整为5.8~6.2，且不添加琼脂。培养容器为150 mL的三角瓶，向每瓶加入50 mL培养液。悬浮培养周期为7 d，在超净工作台上使用灭菌纱布进行转接，继代4~5次。

1.2　复合诱导子组

1.2.1　诱导子配制

茉莉酸甲酯（MeJA）溶液制备^［16］：精准移取235.0 μL MeJA，用95%乙醇定容至10 mL，配制成100 mmol·L^-1溶液作为母液。母液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。使用时将培养液的浓度分别稀释至25、50、75 μmol·L^-1。

水杨酸（SA）溶液制备^［16］：准确称取138.0 mg SA粉末，用适量95%乙醇溶解，蒸馏水定容至10 mL，配制成100 mmol·L^-1溶液作为母液。母液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。使用时将培养液浓度分别稀释至25、50、75 μmol·L^-1。

壳聚糖（CTS）诱导子制备^［17-18］：准确称取0.2 g CTS粉末置于100 mL三角瓶中。将三角瓶置于60 ℃水浴中，于15 min内向三角瓶中以滴加方式加入0.4 mL冰乙酸，然后加入蒸馏水，待CTS粉末溶解后将其定容至40 mL。冷却后加入NaOH溶液调至pH=5.8，之后于121 ℃、0.1 MPa灭菌20 min，备用。使用时将培养液质量浓度分别调为0、10、20 mg·L^-1。

1.2.2　正交试验设计

在课题组前期研究的单一因素最佳培养条件下（黑暗培养），以25、50、75 μmol·L^-1 MeJA，25、50、75 μmol·L^-1 SA，0、10、20 mg·L^-1 CTS为诱导因子进行复合诱导。采用L₉（3³）正交设计进行优化（表1~2）。在箭叶淫羊藿悬浮细胞生长中后期（第6天）添加诱导子溶液，分别向培养体系中添加不同组别的诱导子溶液。复合诱导子组同时设置双对照组：对照组1（CK）为等体积蒸馏水处理，对照组2为实验室前期优化的50 μmol·L^-1 MeJA（M-50）处理。每组试验设置3次生物学重复，处理48 h后，采用30 μm滤布收集悬浮细胞，经蒸馏水洗涤3次后测定鲜质量，置于超低温冰箱中-80 ℃冻存备用。

1.3　光质诱导子

不同LED光源处理方法：所有箭叶淫羊藿悬浮细胞均在25 ℃、60%相对湿度、300 μmol·m^-2·s^-1光强条件下，选取不同光质进行培养。白光处理为12 h光照，黄光（550~590 nm）处理为12 h光照，蓝光（430~470 nm）处理分别设置为8 h、12 h、16 h和24 h光周期，黑暗培养组作为对照组G1（表3）。每组试验设置3次生物学重复，培养8 d后，用30 μm滤布收集悬浮细胞，经蒸馏水洗涤3次后测定鲜质量，置于超低温冰箱中-80 ℃冻存备用。

1.4　次生代谢产物含量测定

1.4.1　黄酮醇苷含量测定

对照品溶液制备：以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷为标准品，绘制标准曲线（表4）。分别称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的对照品0.53、0.53、0.40、0.45 mg，置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，配置成体积为10 mL的混合对照品储备液，过0.22 μm微孔滤头，4 ℃避光保存备用。

供试品溶液制备：采用真空冷冻干燥法对箭叶淫羊藿悬浮细胞进行干燥处理，研磨后过药典三号筛。称取干燥样品0.100 0 g于1.5 mL试管中，加入70%乙醇1 mL，超声处理（功率400 W，频率50 kHz）1 h，冷却至室温后，于4 ℃下以8 000 r·min^-1离心10 min，取上清液作为测定液备用。

色谱条件：色谱柱为SymmetryC18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）；流动相为乙腈（B）-水（C）；梯度洗脱（0~30 min，24%→26% B；30~31 min，26%→45% B；31~45 min，45%→47% B；45~55 min，47%→24% B；55~60 min，24% B）；进样体积10 μL；流速1 mL·min^-1；检测波长270 nm；柱温30 ℃。

根据上述色谱条件测定样品，并设置3次生物学重复。

1.4.2　总黄酮含量测定

按照2020版《中华人民共和国药典》淫羊藿项下规定方法进行检测^［1］，设置3次生物学重复。所得标准曲线方程为y=0.025 8x+0.180 1（r=0.999 3），标准曲线适用范围为0.8~103.0 μg·mL^-1。

1.4.3　总酚酸含量测定

总酚酸按照福林酚法^［19］进行测定，设置3次生物学重复。所得标准曲线方程为y=4.794 1x+0.003 9（r=0.999 0），标准曲线适用范围为0.025~0.150 g·L^-1。

1.4.4　总生物碱含量测定

总生物碱采用酸性染料比色法^［20-21］进行测定，设置3次生物学重复。所得标准曲线方程为y=6.034 0x+0.056 8（r=0.999 3），标准曲线适用范围为0.001 5~0.195 0 g·L^-1。

1.4.5　总皂苷含量测定

总皂苷依据文献^［22］中的方法进行测定，设置3次生物学重复。所得标准曲线方程为y=0.338 0x+0.064 6（r=0.999 5），标准曲线范围为0.05~0.50 g·L^-1。

1.4.6　数据处理

使用SPSS 25.0软件进行数据处理与分析，GraphPad Prism 8和ChiPlot软件进行数据处理及图表绘制。利用单因素方差分析完成各指标的显著性分析（P<0.05），采用Origin 2024软件制图。图中数据以平均值±标准误差表示。

细胞生长量计算公式为

细胞生长量=增殖后的细胞鲜质量-初始细胞鲜质量（1）

细胞增长率计算公式为

细胞增长率=（（增殖后的细胞鲜质量-初始细胞鲜质量）/初始细胞鲜质量）×100%（2）

2 结果与分析

2.1　复合诱导子试验结果

2.1.1　复合诱导子调控箭叶淫羊藿悬浮细胞生长量分析

研究结果表明，F4组细胞生长量最高，细胞增长率达到最大值114.17%（表5）。此时，复合诱导子处理下的箭叶淫羊藿悬浮细胞呈现颗粒均匀、色泽淡黄、分散性良好的特性。与空白对照组（仅基础培养基）和传统植物激素MeJA（50 μmol·L^-1）阳性对照组相比，F4组表现出显著促细胞生长效应，且数据离散程度显著降低，表明复合诱导子具有稳定且促生长特性。

2.1.2　复合诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞黄酮醇苷含量的影响

不同诱导子处理后，箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷成分含量呈现不同的变化。根据药典中箭叶淫羊藿含量测定项的规定，总黄酮醇苷包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷。本研究通过检测分析，明确鉴定出样本中存在朝藿定A、朝藿定C及淫羊藿苷等成分，仅在部分样本中检出微量朝藿定B。在箭叶淫羊藿悬浮细胞中，黄酮醇苷含量随不同诱导子浓度呈现不同的变化趋势。总体来看，复合诱导子处理组对箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷成分含量具有显著的向上调节作用，效果明显优于CK组和M-50组，促进了黄酮醇苷成分的积累。相较于单一植物激素作为诱导子，复合诱导子更能有效促进箭叶淫羊藿悬浮细胞的生长及次生代谢产物的积累。当诱导子组合为F4时，箭叶淫羊藿悬浮细胞中朝藿定A、朝藿定C和总黄酮醇苷的含量达到最大值（图1），分别为（801.081 0±24.047 6）、（1 663.257 0±166.190 8）和（3 279.029 0±174.720 8） μg·g^-1，分别是CK组的5.88倍、4.22倍和2.92倍，同时也是M-50组的2.74倍、2.10倍和2.36倍；当诱导子组合为F8时，箭叶淫羊藿悬浮细胞中淫羊藿苷含量达到最大值，分别是CK组和M-50组的1.49倍和2.88倍，但总体积累量低于F4诱导子处理组，与细胞生长量测定结果一致。

2.1.3　复合诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞总黄酮、总酚酸、总生物碱、总皂苷含量的影响

不同复合诱导子诱导下箭叶淫羊藿悬浮细胞中各类成分的含量存在显著差异（图2）。在总黄酮含量方面，复合诱导子处理组在提升总黄酮含量上表现出明显优势，均高于CK组和M-50组，这可能是因为复合诱导子组合方式与浓度配比更为适宜，能够高效激活苯丙烷途径中的关键酶，从而促进黄酮类化合物的合成与积累。其中，经F3组处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中总黄酮含量最高，为（53.64±0.05） mg·g^-1，分别是CK组和M-50组的1.42倍和1.29倍，具有显著性差异。F5处理组效果次之，诱导效果较好，可能源于中等浓度的MeJA和SA组合更有利于细胞整体代谢平衡。在总酚酸含量方面，复合诱导子处理组同样表现出显著优势，均高于CK组和M-50组。经F2组处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中总酚酸含量最高，为（54.83±0.71） mg·g^-1，分别是CK组和M-50组的4.11倍和3.17倍，具有显著性差异。在总生物碱含量方面，F2和F8组的含量高于CK组，该处理能够更有效地激活箭叶淫羊藿悬浮细胞中生物碱的合成与积累机制。其中，经F8组处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中总生物碱含量最高，为（3.86±0.29） mg·g^-1，分别是CK组和M-50组的1.26倍和1.73倍。在总皂苷含量方面，复合诱导子处理组的总皂苷含量均高于CK组，其中F5处理组效果尤为显著，总皂苷含量为（71.75±0.73） mg·g^-1，分别是CK组和M-50组的3.73倍和1.68倍，具有显著性差异。

2.1.4　复合诱导子调控下箭叶淫羊藿悬浮细胞中代谢产物相关性分析

在复合诱导子处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中（图3），CTS浓度与总生物碱含量呈显著负相关（P<0.01）；细胞生长量与朝藿定A、总黄酮醇苷含量呈显著正相关（P<0.05）；朝藿定A含量与总生物碱含量呈显著负相关（P<0.05）；朝藿定A含量与朝藿定C含量呈显著正相关（P<0.01）；朝藿定A含量与总黄酮醇苷含量呈极显著正相关（P<0.000 1）；朝藿定C含量与总生物碱含量呈显著负相关（P<0.05）；朝藿定C含量与总黄酮醇苷含量呈极显著正相关（P<0.000 1）；淫羊藿苷含量与总黄酮醇苷含量呈显著正相关（P<0.05）；总皂苷含量与总黄酮、总酚酸含量呈显著正相关（P<0.05）。

箭叶淫羊藿悬浮细胞代谢产物与诱导子种类和浓度密切相关。其中，朝藿定A、朝藿定C和总黄酮醇苷含量之间呈现极显著正相关，其他成分之间的相关性则随着复合诱导子种类及浓度的变化而有所不同。

2.2　光质诱导子试验结果

2.2.1　光质诱导子调控下箭叶淫羊藿悬浮细胞生长量分析

研究结果表明，G6组细胞生长量最高，细胞增长率达到168.67%（表6）。此时，在光质诱导子处理下，箭叶淫羊藿悬浮细胞呈现出颗粒均匀、色泽淡黄、分散性良好的特性。与空白对照组（仅基础培养基）和传统植物激素MeJA（50 μmol·L^-1）阳性对照组相比，蓝光16 h诱导子处理组表现出显著的细胞生长促进效应，且数据离散程度明显降低，这表明光质诱导子具有稳定且促生长特性。

2.2.2　光质诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞黄酮醇苷含量的影响

不同光质诱导子处理后，箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷成分含量表现出不同的变化趋势（图4）。总体来看，光质诱导子在12 h和16 h处理组中对箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷成分含量具有显著的上调作用，效果明显优于G1组，促进黄酮醇苷成分的积累。这表明光质诱导子在特定条件下对箭叶淫羊藿悬浮细胞的生长及次生代谢产物的积累具有促进作用。当光质诱导子为G6（蓝光，16 h）时，箭叶淫羊藿悬浮细胞中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、总黄酮醇苷的含量均达到最大值，分别为（1 365.62±11.59）、（856.37±5.27）、（3 764.22±30.12）、（8 205.12±10.21） μg·g^-1，且与其他处理均具有显著性差异。此时，总黄酮醇苷含量为G1组的3.80倍，与细胞生长量的测定结果一致。

2.2.3　光质诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞总黄酮、总酚酸、总生物碱、总皂苷含量的影响

不同光质诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞中各类成分含量的影响存在显著差异（图5）。在总黄酮含量方面，光质诱导子G6处理组表现出明显优势，其含量为（48.00±0.04） mg·g^-1，是G1组的1.27倍，且具有显著性差异。在总酚酸含量方面，光质诱导子G4处理组提升效果最为显著，其含量为（39.84±0.80） mg·g^-1，是G1组的2.94倍，同样具有显著性差异。在总生物碱含量方面，G1组作为对照组，其含量显著高于G7组，与G2和G3组无显著差异。在总皂苷含量方面，光质诱导子G6处理组表现突出，其含量为（58.75±0.58） mg·g^-1，是G1组的3.05倍，且具有显著性差异。上述结果表明，不同光质诱导子及其处理时间对箭叶淫羊藿悬浮细胞的生长及代谢产物积累具有显著的调控作用。

2.2.4　光质诱导子调控下箭叶淫羊藿悬浮细胞中代谢产物相关性分析

经光质诱导子处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞中（图6），生长量与总酚酸含量呈极显著正相关（P<0.001）；生长量与淫羊藿苷、总黄酮醇苷和总酚酸含量呈显著正相关（P<0.05）；朝藿定A含量与朝藿定B、总皂苷含量呈显著正相关（P<0.05）；朝藿定A含量与朝藿定C、总黄酮醇苷含量呈显著正相关（P<0.01）；朝藿定B含量与朝藿定C含量呈显著正相关（P<0.05）；朝藿定B含量与总黄酮含量呈显著正相关（P<0.01）；朝藿定C含量与总黄酮醇苷含量呈显著正相关（P<0.01）；朝藿定C含量与总黄酮、总皂苷含量呈显著正相关（P<0.05）；淫羊藿苷含量与总酚酸含量呈显著正相关（P<0.01）；淫羊藿苷含量与总皂苷含量呈显著正相关（P<0.05）；总黄酮醇苷含量与总皂苷含量呈显著正相关（P<0.01）；总酚酸含量与总皂苷含量呈显著正相关（P<0.05）。

不同光质诱导子处理对箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷、总酚酸、总黄酮、总皂苷、总生物碱等次生代谢产物含量具有不同程度的影响。结果表明，箭叶淫羊藿悬浮细胞代谢产物与光质诱导子的种类及作用时间密切相关。其中，生长量与总酚酸呈现极显著正相关，其他成分之间的相关性随光质诱导子种类及作用时间的变化而变化。

3 讨论与结论

在植物细胞悬浮培养过程中，次生代谢物的积累与悬浮细胞的生长往往呈负相关，多数次生代谢物在生长后期才开始合成。通过诱导子的调控，能够实现生物量与次生代谢物积累之间的平衡。笔者前期研究^［15］表明，在箭叶淫羊藿悬浮培养6 d后，分别添加MeJA、SA、CTS溶液可显著促进箭叶淫羊藿悬浮细胞中黄酮醇苷的积累，其最佳诱导子浓度分别为50 µmol·L^-1、50 µmol·L^-1、10 mg·L^-1。经200 µmol·L^-1 MeJA处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞总酚酸、总生物碱及总皂苷含量达到最大值；经100 µmol·L^-1 MeJA处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞总黄酮含量达到最大值；经50 µmol·L^-1 SA处理和75 mg·L^-1 CTS处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞总生物碱含量达到最大值；经25 µmol·L^-1 SA处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞总皂苷含量达到最大值。有研究^［23］采用4因素4水平正交试验法筛选出对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）岩藻黄素含量促进效果最佳的诱导子组合，其岩藻黄素含量在诱导子组合处理下达到21.77 mg·g^-1，较对照组提高了104%。MeJA与其他激素相互作用调节植物次生代谢产物合成，例如在胡萝卜（Daucus carota var.sativa）中，SA与MeJA组合可显著促进愈伤组织花青素合成^［24］。生物诱导子酵母提取物（YE）和非生物诱导子银离子（Ag⁺）复合诱导子抑制丹参（Salviae miltiorrhiza）毛状根的生长，同时对不同成分的积累具有不同的影响，抑制初生代谢产物的积累，促进次生代谢产物积累^［25］。相较于单一诱导子，利用不同诱导子之间的协同作用组合处理植物，往往能够显著提高其次生代谢产物含量^［26］。因此，本研究以MeJA、SA和CTS为因素进行正交试验。结果显示，相较于单一诱导子处理，采用不同浓度诱导子组合配方处理时，悬浮细胞的生长状况及代谢产物的积累情况均存在显著差异。通过多指标选择法筛选出F4诱导子组合为黄酮醇苷最优复合诱导子；F3诱导子组合为总黄酮最优复合诱导子；F2诱导子组合为总酚酸最优复合诱导子；F8诱导子组合为总生物碱最优复合诱导子；F5诱导子组合为总皂苷最优复合诱导子。本研究初步将复合诱导子应用于植物组织培养领域，为探究箭叶淫羊藿悬浮细胞中次生代谢产物合成机制奠定了理论基础，也为利用箭叶淫羊藿悬浮细胞大规模工业化生产有用的次生代谢产物提供了参考。

光是通过不同光受体调节植物生长发育的最重要因素之一^［27］。光不仅影响药用植物的生长发育、生理及生化特性，还影响次生代谢物的积累^［28］，因此调控光质是提高其品质的有效方法。箭叶淫羊藿次生代谢产物中含有黄酮醇苷等功能成分，其含量直接影响箭叶淫羊藿的品质和药用价值^［29］。本研究发现，12 h白光、12 h黄光、12 h蓝光和16 h蓝光均能促进箭叶淫羊藿悬浮细胞黄酮醇苷、总黄酮和总酚酸的积累。其中，G4组和G6组对箭叶淫羊藿悬浮细胞生物量的积累具有显著促进作用，同时能够提高箭叶淫羊藿黄酮醇苷和总黄酮等次生代谢产物含量。这一结果与蓝光能够促进紫花苜蓿（Medicago sativa）幼苗^［30］和银杏（Ginkgo biloba）苗木^［31］中黄酮类化合物和总酚酸积累的研究结果一致。而8 h蓝光和24 h蓝光处理组对黄酮醇苷和总黄酮等次生代谢产物积累的诱导效果不如12 h蓝光和16 h蓝光处理组，其原因可能是因为光周期时长过短或过长，对悬浮细胞的刺激过少或过多，因此诱导效果不如12 h和16 h光周期的处理组。12 h蓝光处理组可显著提高箭叶淫羊藿悬浮细胞中总皂苷含量，这与蓝光有利于刺激西洋参（Panax quinquefolius）^［32］、人参（Panax ginseng）^［33］和走马胎（Ardisia gigantifolia）^［34］幼苗总皂苷生成的研究结果一致。综合考虑生长、生理指标，初步认为16 h蓝光处理的箭叶淫羊藿悬浮细胞生长量适中，次生代谢产物含量较高，是较适合其生长的LED光质。本试验结果为箭叶淫羊藿悬浮细胞工厂化生产的光质调控技术提供了理论基础。

综上，复合诱导子和光质诱导子对箭叶淫羊藿悬浮细胞生长和次生代谢产物积累具有显著影响。相对于单一诱导子，F4诱导子组处理下悬浮细胞表现更优，但在不同次生代谢产物中的最佳组合比例不同。综合生长量和次生代谢产物含量，16 h蓝光光质处理有利于悬浮细胞生长和次生代谢产物积累。在后续研究中，可以进一步探究不同的光质组合对悬浮细胞生长的促进作用，提高相关成分含量，为定向精准诱导悬浮细胞次生代谢物提供参考。

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基金资助

中央本级重大增减支项目(2060302)

重庆市药物种植研究所2024年刘正宇全国名老中医药专家传承工作室开放课题(2024jbky-kfkt-007)

河南中医药大学博士科研基金(BSJJ2024-04)

河南省现代农业产业技术体系项目(HARS-22-11-Z3)