枯草芽孢杆菌C08可湿性粉剂研制及其对番茄早疫病防治效果

Development of a Wettable Powder Formulation of Bacillus subtilis C08 and Its Biocontrol Efficacy Against Tomato Early Blight

摘要

番茄（Solanum lycopersicum）早疫病由茄链格孢菌（Alternaria solani）侵染引发，由于其潜育期短且再侵染迅速，已成为影响番茄产量与品质的重要病害之一。相比传统化学防治方法，生物防治具有环境友好和绿色可持续的优势，展现出巨大的发展潜力。本研究从健康番茄根际土壤中筛选出1株对早疫病具有显著拮抗活性的芽孢杆菌（Bacillus）（编号C08），并优化其发酵条件，以发酵产物为基础制备可湿性粉剂。结果表明：该粉剂不仅对番茄早疫病表现出较高的防治效果，还能够显著促进植株生长，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性，同时改善土壤中蔗糖酶与脲酶的活性，为番茄早疫病的绿色防控提供潜在的生物防治资源与应用基础。

Abstract

Tomato early blight， caused by Alternaria solani， represents a significant disease that severely impacts both the yield and quality of tomatoes， primarily due to its short latent period and rapid reinfection cycle. In contrast to conventional chemical control methods， biological control offers considerable potential due to its environmentally friendly and sustainable attributes. In this study， a strain of Bacillussubtilis， designated as C08， demonstrating strong antagonistic activity against A.solani， was isolated from the rhizosphere soil of healthy tomato plants. The fermentation conditions were optimized， and a wettable powder formulation was subsequently developed using the fermentation broth as the active ingredient. The results indicated that the formulation achieved high efficacy in controlling tomato early blight， significantly promoted plant growth， enhanced the activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD）， and improved soil enzyme activities such as sucrase and urease. These findings suggest that strain C08 holds substantial promise as a biocontrol agent for the sustainable management of tomato early blight.

Graphical abstract

关键词

枯草芽孢杆菌 / 番茄早疫病 / 可湿性粉剂 / 生物防治

Key words

Bacillus subtilis / tomato early blight / wettable powder / biological control

番茄（Solanum lycopersicum）是全球广泛栽培的重要经济作物之一，在我国蔬菜产业中占据重要地位^［1］。然而，其在生长过程中易受多种病害侵袭，尤其是由茄链格孢菌（Alternaria solani）引起的早疫病（early blight）。该病害发病普遍且危害严重，是影响番茄产量和品质的主要因素之一^［2］。早疫病可发生于番茄整个生育期，主要侵染叶片、茎秆和果实。发病初期，受害部位出现典型的“靶斑”症状，严重时导致大量落叶和果实腐烂，进而引起产量下降与商品价值降低，对番茄生产造成严重的经济损失^［3］。

目前，化学农药仍是防治番茄早疫病的主要手段。然而，长期依赖化学防治不仅易导致病原菌抗药性增强，还可能破坏土壤微生态，威胁环境安全，同时在农产品中的农药残留积累也对人体健康构成潜在风险^［4］。因此，开发高效、环保且可持续的生物防治策略已成为当前植物病害管理的重要发展方向^［5］。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类兼具拮抗活性与促生功能的典型生防细菌，具有形成芽孢、代谢产物丰富、环境适应性强等特点，在防治植物真菌病害方面展现出广泛的应用前景^［6］。其可通过产生抗菌肽（如伊枯草菌素、苏云金芽孢杆菌素等）抑制病原菌生长，或通过竞争营养、诱导植物系统抗性等方式实现多重防病效应^［7］。此外，枯草芽孢杆菌还可以促进植物根系发育，增强其抗逆能力，是构建绿色农业和可持续病害管理体系的重要微生物资源^［8］。

制剂化是生防菌应用于农业生产的重要环节^［9］。可湿性粉剂作为一种常见的微生物农药剂型，具有运输便捷、便于储存及田间施用等优点，适用于规模化推广应用^［10-11］。本研究以筛选获得的高效拮抗菌株枯草芽孢杆菌C08为研究对象，围绕其可湿性粉剂的研制开展系统研究。通过优化载体材料与辅料配比，制备出稳定性良好、悬浮率高、活菌数符合标准的微生物制剂产品。同时，结合温室与田间试验，系统评估其对番茄早疫病的实际防治效果，并观察分析其对番茄植株生长的影响，旨在为该菌株的生防产品开发提供理论依据与技术支撑，推动其在绿色农业中的实际应用与推广。

1 材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　菌株

试验所用生防菌株分离自山东省潍坊市寿光马连庄番茄早疫病发病田块的健壮番茄植株根际，并保存于东北农业大学番茄实验室。番茄早疫病病原菌（茄链格孢菌）由东北农业大学番茄实验室保存。

1.1.2　植物材料

本研究选用栽培番茄不同品种作为试验材料，其中品种‘普罗旺斯’用于幼苗阶段处理试验，购自寿光易贤农业科技有限公司；品种‘Ailsa Craig’用于种子萌发相关试验与统计分析，由东北农业大学番茄实验室保存。

1.1.3　培养基

Luria-Bertani（LB）固体培养基、LB液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA培养基）、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA培养基）、淀粉培养基、明胶培养基、柠檬酸铁铵半固体培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基等。

1.1.4　试剂

供试药品及生化试剂：琼脂、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物、豆粕、牛肉膏、明胶、柠檬酸铁铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙、NaCl、H₂O₂、高岭土、硅藻土、白炭黑、膨润土、达润DCM-82、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（DBS）、吐温-80、达润D317、PEG8000、木质素磺酸钙、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、糊精、抗坏血酸、75%乙醇、95%乙醇等，均为分析纯级。

供试试剂盒：过氧化物酶（POD）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、土壤蔗糖酶（S-SC）试剂盒、土壤脲酶（S-UE）试剂盒、土壤过氧化氢酶（S-CAT）试剂盒，均购自苏州格锐思生物有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　菌株取样与筛选鉴定

选用无菌工具于番茄早疫病发病田块健壮番茄根际5~10 cm深处进行多点取样，去除土壤中的大颗粒杂质，对其进行编号保存。用200目（孔径约为0.074 mm）土壤筛对编号土样进行过筛，称取1 g过筛后土样倒入无菌锥形瓶中，并倒入9 mL无菌水充分震荡，静置30 min（瓶中固液明显分层），取1 mL瓶中上清液及9 mL无菌水充分震荡，得到稀释倍数为10^-1的土壤悬浊液，取1 mL 10^-1稀释倍数土壤悬浊液及9 mL无菌水再次充分震荡，得到稀释倍数为10^-2的土壤悬浊液，以此类推，重复以上步骤至稀释倍数达到10^-5。在超净工作台中将已灭菌的LB培养基进行倒板，待平板凝固后，取100 µL 10^-5稀释倍数的土壤悬浊液进行涂布，均匀涂布后于恒温培养箱中保存。试验重复4次。72 h后于恒温培养箱中取出，采用平板划线法将培养基中生长出的颜色及形态各异的单菌落分别接种于LB培养基上进行培养，每种菌株重复3次，编号后保存。

采用平板对峙法对保存菌株进行初筛。取活化的番茄早疫病病原菌置于PDA培养基中心，四周等距放置分离纯化的菌株，培养5 d后测量抑菌带宽度，重复3次，筛选出具有明显拮抗效果的菌株。采用牛津杯法复筛，将初筛菌株制成菌悬液滴入牛津杯中，距病原菌3 cm处培养5 d，测定抑菌带宽度，重复3次，最终筛选出抗性广谱的优良菌株。对筛选菌株进行菌体形态观察、革兰氏染色及多项生理生化试验（包括淀粉酶水解、明胶液化、过氧化氢酶、硫化氢（H₂S）产生、吲哚及甲基红试验），以辅助菌株鉴定。采用柱式法提取基因组 DNA，使用16S rDNA特异引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶检测和磁珠纯化后测序，并通过NCBI-BLAST比对与构建系统发育树，确定菌株的种属归属。

1.2.2　发酵条件优化

制备种子液，用接种环挑取固体平板上活化的单菌落，接种于装液量为200 mL的LB液体培养基中，35 ℃、180 rpm摇床培养48 h。以LB培养基为基础发酵培养基，体积分数4%种子液接种培养48 h。通过单因素试验优化碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉等）、氮源（胰蛋白胨、酵母提取物等）、无机盐（硝酸钾、磷酸盐、硫酸镁等）及其添加量，以及pH（6.0~7.5）、发酵时间（24~60 h）、接种量（2%~8%）和装液量（50~200 mL）对活菌数的影响，均采用稀释涂布法测定，重复3次。

1.2.3　可湿性粉剂研制

可湿性粉剂相关指标包括润湿时间、悬浮率、细度、含水量及pH，均参照国家标准测定，试验重复3次。载体筛选：将发酵液分别与高岭土、硅藻土、白炭黑、膨润土按体积比7∶3混合制备母粉，测定悬浮率、润湿时间和活菌数，综合生物相容性及成本选出最优载体。润湿剂、分散剂及其比例的筛选分别在母粉基础上添加多种助剂，测定相关指标，确定最佳配比。稳定剂和紫外保护剂的筛选通过添加不同助剂后烘干、培养或紫外照射，检测活菌数以选出最适添加剂。最终依据筛选结果配制出C08最佳配方可湿性粉剂。为评价其贮藏稳定性，将制备的可湿性粉剂在室温条件下贮藏，并于60 d内每间隔10 d测定一次活菌数；通过不同倍数稀释液处理番茄种子和叶片，观察发芽率和病害防治效果综合确定最佳稀释倍数。所有试验均重复3次。

1.2.4　防治效果及促生效果评价

试验于温室内进行，环境条件为温度（25±2） ℃、相对湿度65%~75%、光照周期16 h光照/8 h黑暗。设置4组处理：C08可湿性粉剂稀释至最佳稀释倍数300倍（该稀释倍数由前期试验筛选确定），与生防菌株发酵液（稀释至活菌浓度约为1×10⁸ CFU·mL^-1）、50%多菌灵（稀释倍数为800倍，有效成分质量浓度约为62.5 mg·L^-1）及无菌水对照，分别均匀喷施于长势一致的番茄植株表面。24 h后喷施早疫病病原菌菌悬液（浓度约为1×10⁹ CFU·mL^-1），每组设3次重复。处理30 d后，依据《番茄早疫病病情分析标准》记录病情指数、发病率及防治效果。病情分级标准见表1，发病率、病情指数、预防效果计算公式如下：

发病率=（发病叶片数/调查总叶片数）×100%（1）

病情指数=∑（（各级病叶数×相对级数）/（调查总叶数×最高级数））×100（2）

预防效果=（空白对照病情指数-处理组病情指数）/空白对照病情指数×100%（3）

另取长势一致的番茄植株，在接种病原菌24 h后，按照上述4组处理方式喷施番茄植株。分别在处理1~7 d后采集相似叶位的叶片，计算其7 d内SOD与POD的酶活性变化。称取0.1 g叶片，加入1 mL提取液，冰浴研磨后离心（4 ℃，8 000 rpm，10 min），取上清液用于测定。SOD活性（U·g^-1）：波长设为450 nm，依据SOD试剂盒说明加入试剂反应30 min后测定吸光度。抑制百分率和SOD活性的计算公式如下：

抑制百分率=［（A_空白管1-A_空白管2）-（A_样本管- A_{样本对照管}）］/（A_空白管1-A_空白管2）×100%（4）

A_SOD=10×［抑制百分率/（1-抑制百分率）］/m×D（5）

式中：A为吸光度；m为样本质量；D为样本稀释倍数。

POD活性（ΔOD₄₇₀·min·g^-1）：波长设为470 nm，按照POD试剂盒指示依次加入试剂，充分反应后测定初始吸光度，再于1 min后测定，计算ΔA。计算公式如下：

A_{\mathrm{P}\mathrm{O}\mathrm{D}}=\mathrm{100}\times \mathrm{\Delta }A/m（6）

式中：ΔA为初次测定吸光度-1 min后测定吸光度；m为样本质量。

为进一步分析C08可湿性粉剂对番茄幼苗的促生效果，将4组处理等量灌根番茄幼苗，试验设3次重复。处理20 d后，分别测定4组植株的株高、根长等形态学指标及根系生长情况。此外，通过灌根处理，每间隔7 d采集根际土样用于土壤酶活性测定。土壤蔗糖酶活性（A_SSC，mg·d^-1·g^-1）：将土样按试剂盒说明加试剂反应4 h后离心，显色反应（95 ℃，5 min），波长540 nm测定吸光度。计算公式如下：

A_SSC=1.7×（ΔA+0.023 3）/m×D（7）

式中：ΔA为A_测定管-A_对照管；m为样本质量；D为样本稀释倍数。

土壤脲酶活性（A_SUE，µg·d^-1·g^-1）：土样加试剂反应24 h后离心，显色（37 ℃，20 min），波长578 nm测定吸光度。计算公式如下：

A_SUE=16×（ΔA+0.001 5）/m（8）

式中：ΔA为A_测定管-A_对照管；m为样本质量。

土壤过氧化氢酶活性（A_SCAT，µmol·d^-1·g^-1）：土样加试剂反应30 min后离心，显色（静置3 min），波长510 nm测定吸光度。计算公式如下：

A_SCAT=35.8×（ΔA+0.045 7）/m（9）

式中：ΔA为A_无土管-（A_测定管-A_无基质管）；m为样本质量。

所有试验均设3次重复，以确保数据的可靠性与科学性。

1.2.5　数据处理

使用SPSS 26.0、Design Expert 8.0.6和Origin 9.65等软件进行数据的处理与分析。

2 结果与分析

2.1　生防菌株筛选结果

通过平板对峙法将分离纯化后的菌株进行初筛，初筛结果显示，分离出的62份菌株中，编号为C08、C19、C27和C54的菌株产生明显抑菌带，对番茄早疫病病原菌具有抑制效果。将上述4种菌株通过牛津杯法进行复筛，试验重复3次，试验结果如图1所示，C08与番茄早疫病病原菌对峙的抑菌带最宽，抑制效果最佳。

2.2　生防菌株鉴定结果

2.2.1　生防菌株菌体形态观察及革兰氏染色与生理生化鉴定结果

将菌株C08置于恒温培养箱中培养48 h后取出，进行形态观察及革兰氏染色，结果如图2所示。菌落整体呈黄色，表面干燥、粗糙且有凸起，无明显气味，边缘不规则；革兰氏染色后，显微镜下观察显示：菌体呈蓝紫色杆状，属革兰氏阳性菌。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，鉴定结果如表2所示。

2.2.2　生防菌株16S rDNA系统发育树的构建

对生防菌株C08的16S rDNA测序结果进行BLAST比对，并构建其系统发育树，如图3所示。结果显示，与生防菌株C08序列一致性最高的为Bacillus subtilis。结合菌株形态观察及生理生化鉴定结果，初步将生防菌株C08鉴定为枯草芽孢杆菌。

2.3　生防菌株C08发酵优化结果

2.3.1　发酵培养基组分及其添加量优化结果

为筛选生防菌株C08的最适发酵培养基组分，分别考察了不同碳源、氮源及无机盐对其活菌数的影响。在碳源选择中，可溶性淀粉效果最佳，72 h后活菌数达到0.54×10⁸ CFU·mL^-1。进一步优化其添加量后，当质量浓度为5 g·L^-1时，活菌数提升至0.56×10⁸ CFU·mL^-1（图4A）。在氮源方面，豆粕表现最优，活菌数达到0.68×10⁸ CFU·mL^-1；优化其添加量后，当质量浓度为20 g·L^-1时，活菌数进一步提升至0.95×10⁸ CFU·mL^-1（图4B）。在无机盐筛选中，硫酸镁效果最佳，活菌数达到0.80×10⁸ CFU·mL^-1，其最佳添加量为0.5 g·L^-1（图4C）。综上，确定可溶性淀粉（5 g·L^-1）、豆粕（20 g·L^-1）和硫酸镁（0.5 g·L^-1）为生防菌株C08发酵的最适碳源、氮源和无机盐。

2.3.2　发酵条件优化结果

为进一步优化生防菌株C08的发酵培养条件，分别考察了pH、发酵时间、接种量及装液量对活菌数的影响。结果表明：初始pH为7.0时，72 h的活菌数最高，达到0.51×10⁸ CFU·mL^-1（图5A）；发酵时间为36 h时，活菌数达到最高值0.58×10⁸ CFU·mL^-1（图5B）；接种量为体积分数4%时，活菌数达到最大值0.51×10⁸ CFU·mL^-1（图5C）；装液量为100 mL时，活菌数最高，达到0.65×10⁸ CFU·mL^-1（图5D）。综上所述，确定pH 7.0、发酵时间36 h、接种量4%、装液量100 mL为生防菌株C08的最适发酵条件。

2.4　生防菌株C08可湿性粉剂研制结果

2.4.1　可湿性粉剂载体的筛选结果

生防菌株C08可湿性粉剂的载体筛选结果见表3。在4种载体中，白炭黑和高岭土的悬浮率较高，分别为50.23%和48.76%，且润湿时间较短；硅藻土的悬浮率最低（36.12%），而膨润土的活菌数最低，表明其与菌株C08的生物相容性较差。综合考虑悬浮性、润湿性、生物相容性及成本等因素，最终确定高岭土为生防菌株C08可湿性粉剂的最适载体。

2.4.2　可湿性粉剂润湿剂和分散剂及其比例的筛选结果

生防菌株C08可湿性粉剂的润湿剂筛选结果见表4。加入润湿剂显著降低水的表面张力，并缩短母粉的润湿时间。其中，十二烷基苯磺酸钠的润湿时间最短，为38.76 s，且悬浮率最高，达到53.39%。因此，选择DBS作为润湿剂。分散剂筛选结果见表5，木质素磺酸钙显著提升了悬浮率至75.52%，同时提高了活菌数，最终被确定为分散剂。润湿剂与分散剂比例优化结果见表6，当体积比为2∶8时，润湿时间为56.21 s，悬浮率达到78.52%，活菌数为2.23×10⁸ CFU·g^-1，综合性能最佳。

2.4.3　可湿性粉剂稳定剂与紫外保护剂的筛选结果

生防菌株C08可湿性粉剂的稳定剂筛选结果如表7所示。在未添加稳定剂的情况下，样品于50 ℃培养10 d后，活菌数下降至1.82×10⁸ CFU·g^-1。添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙及羧甲基纤维素钠，均能在不同程度上稳定菌体。其中，碳酸钙的效果最为显著，活菌数可达2.14×10⁸ CFU·g^-1，且其生物相容性良好，因此被选为稳定剂。紫外保护剂的筛选结果见表8。经12 h紫外光照射模拟大田条件后，抗坏血酸处理组表现出显著的保护效果，活菌数达2.20×10⁸ CFU·g^-1，因此被选为紫外保护剂。

2.4.4　生防菌株C08可湿性粉剂质量检测、贮藏时间及最佳稀释倍数测定结果

依据国家标准对生防菌株C08可湿性粉剂的质量指标进行检测（表9）。结果显示，其活菌数达到2.24×10⁸ CFU·g^-1，细度为95.22%，润湿时间为56.21 s，悬浮率为78.52%，含水量为2.45%，pH为7.0，杂菌率为0.54，各项指标均符合标准，适用于番茄早疫病的防治。储存稳定性测试（图6A）表明，在室温条件下（温度控制在（20±2） ℃，相对湿度保持在40%~60%，密封储存）保存60 d后，活菌数降至1.84×10⁸ CFU·g^-1，稳定性有所下降，因此建议在40 d内使用。种子萌发试验（图6B）显示，48 h时500倍稀释液对种子萌发的促进效果最佳（萌发率为67%），而72 h时300倍稀释液效果最优（萌发率为88%）。离体叶片防效试验（表10，图6C）表明，300倍稀释液的防效最高（71.45%，显著优于对照组），500倍稀释液次之（56.63%）。综合考虑，确定300倍稀释液为最佳使用浓度。

2.5　生防菌株C08可湿性粉剂防效与促生效果

2.5.1　生防菌株C08可湿性粉剂对温室盆栽番茄早疫病的防治效果

包括生防菌株 C08可湿性粉剂在内的3种处理及对照组对番茄早疫病的防治效果见图7和表11。3种处理中，多菌灵处理的植株病情指数最低（18.15），防治效果最佳（65.33%）；生防菌株C08可湿性粉剂次之，病情指数为20.26，防治效果为 60.27%；生防菌株C08发酵液的温室盆栽防治效果略低于前两者，但与对照组相比仍表现出显著的抑病效果。

2.5.2　生防菌株C08可湿性粉剂对诱导番茄抗性相关防御酶活性的测定结果

3种处理及对照对番茄SOD活性的影响如图8A所示。喷施生防菌株C08可湿性粉剂后，SOD活性持续上升，并于第5天达到峰值，随后逐渐下降，其提升幅度在各处理中最为显著。生防菌株C08发酵液处理同样能够提高SOD活性，于第4天达到峰值后逐渐下降。多菌灵处理则在第3天达到峰值，随后趋于平缓下降。总体来看，生防菌株C08可湿性粉剂在诱导番茄SOD活性方面效果最为突出，表明其具有增强植株抗性的潜力。

3种处理及对照对番茄POD活性的影响如图8B所示。各处理均显著提升了POD活性，其中生防菌株C08可湿性粉剂处理后酶活性持续增强，于第4天达到峰值，随后逐渐下降，并在第7天回归至初始水平，其提升幅度和持续时间均优于其他处理。多菌灵处理在初期效果较为显著，于第3天达到峰值后迅速下降；生防菌株C08发酵液的效果相对较弱，于第4天达峰后逐渐回落。综合分析表明，生防菌株C08可湿性粉剂对番茄POD活性的提升作用最强，展现出良好的抗病诱导潜力。

2.5.3　生防菌株C08可湿性粉剂对番茄幼苗形态指标的影响

如表12和图9所示，生防菌株C08可湿性粉剂处理显著促进番茄植株生长。其株高、茎粗、地上部鲜质量和根系鲜质量分别为对照组的1.51 倍、1.17倍、1.83倍和1.66倍，促生效果最为显著。生防菌株C08发酵液和多菌灵处理组对番茄生长也表现出一定的促进作用，其中多菌灵处理的促生效果略优于生防菌株C08发酵液。

2.6　生防菌株 C08可湿性粉剂对番茄根际土壤酶活性的影响

如图10所示，生防菌株C08可湿性粉剂等3种处理对番茄根际土壤中蔗糖酶（S-SC）、脲酶（S-UE）及过氧化氢酶（S-CAT）活性均产生了显著影响。在生防菌株C08可湿性粉剂处理组中，S-SC和S-UE活性随时间逐渐升高，分别于第28天达到峰值（18.33 mg·d^-1·g^-1和147.67 μg·d^-1·g^-1），表现出显著的诱导效应。生防菌株C08发酵液处理组同样表现出较强的促进作用，S-SC和S-UE活性分别在第14天和第21天达到峰值后逐渐下降。而多菌灵处理组在初期活性略有提升，随后逐渐下降至低于对照水平，呈现“先激活后抑制”的趋势。

在S-CAT活性方面，生防菌株C08可湿性粉剂和发酵液处理均导致其活性逐渐下降，至第28天分别降至586.33和596.33 μmol·h^-1·g^-1，表明处理促进了土壤中过氧化氢的分解，从而降低了植株对内源S-CAT的依赖。相比之下，多菌灵处理组在前期活性下降，后期有所回升，至第28天略高于对照。

综上所述，生防菌株C08可湿性粉剂能够显著提升番茄根际土壤中S-SC和S-UE的活性，同时降低S-CAT活性，有助于提高植株的抗逆性及养分转化效率。

3 讨论

随着可持续农业的发展和公众环保意识的增强，生物防治技术受到广泛关注。作为生物防治的核心，生防菌株已成为国内外研究的重要方向。其中，芽孢杆菌因其易于分离培养、具有广谱抑菌活性、繁殖迅速且能产生多种次生代谢产物，成为当前生物防治研究的热点之一^［12-13］。研究表明，多种芽孢杆菌可通过竞争^［14-15］、拮抗^［16-18］、溶菌^［19］和诱导植物抗性^［20］等机制防控植物病害，还可通过溶磷^［21-22］、固氮^［23-24］、分泌激素^［25］等途径促进植物生长，展现出显著的生物促生与防病作用。Xie等^［26］分离获得的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）LZ88对烟草（Nicotiana tabacum）褐斑病的抑菌率高达81.96%，其通过分泌抗菌蛋白和释放挥发性物质对病原菌产生拮抗作用，同时具备诱导植物基础免疫反应的能力。此外，FMC公司利用枯草芽孢杆菌FMCH002和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）FMCH001开发出杀菌剂‘F4018-4’，可用于防治玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）等作物的种子腐烂病和苗期立枯病，展现出良好的应用前景。

本研究从健壮的番茄根际土壤中分离纯化出1株具有抑制番茄早疫病能力的生防菌株，验证了其在以番茄早疫病为靶标病害的防治中具有良好的生防潜力。通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA测序等多种鉴定方法，初步确定该菌株属于枯草芽孢杆菌属，为其后续功能研究奠定了坚实基础。鉴于微生物菌剂在植物病害防治中的广泛应用，合理制备菌剂以保证其活性和稳定性尤为关键。目前，我国广泛应用于植物病害防治的微生物菌剂剂型主要包括可湿性粉剂、悬浮剂和水分散粒剂等。其中，可湿性粉剂因其润湿性好、喷洒方便、制作和运输成本低、有效成分含量高、适用范围广等优点，已成为占比最高的微生物菌剂剂型。为保证其防治效果，合理选择可湿性粉剂的载体与助剂尤为重要。杜丹超等^［27］的研究表明，以硅藻土作为载体不仅与生防菌株具有良好的生物相容性，还能在一定程度上促进孢子萌发和菌丝生长，有利于提升菌剂的稳定性与活性。

本研究以生防菌株C08为有效成分，系统开展了其可湿性粉剂的配方优化研究。经载体与助剂筛选，结果表明：以高岭土作为载体可最大程度提高C08菌株的活菌数，与赵春燕等^［28］的研究结论一致；以十二烷基苯磺酸钠作为润湿剂，木质素磺酸钙为分散剂（体积比为2∶8），分别以碳酸钙和抗坏血酸作为稳定剂和紫外保护剂，该配方与敖明远等^［29］的研究结果相吻合。最终确立的最优配方为高岭土73%、十二烷基苯磺酸钠4%、木质素磺酸钙16%、碳酸钙2%、抗坏血酸5%。制得的生防菌株C08可湿性粉剂活菌数达2.24×10⁸ CFU·g^-1，细度为95.22%，润湿时间为56.21 s，悬浮率为78.52%，含水量为2.45%，pH为7.0，杂菌率为0.54%，各项指标均符合国家标准。通过番茄种子萌发试验与离体叶片防效试验，确定生防菌株C08可湿性粉剂的最佳稀释倍数为300倍，可应用于番茄促生及早疫病的防治。

微生物菌剂的应用是当前农业中应对植物土传病害的有效策略之一。赵新贝等^［30］利用生防菌株TD-7发酵液进行番茄灰霉病温室防治试验，盆栽防效高达80.61%；姚蒋庞等^［31］开发的黑曲霉（Aspergillus niger）水分散片剂对烟草青枯病的大田防效达50%以上，提升了植株的抗逆能力。本研究温室试验结果表明，生防菌株C08可湿性粉剂处理后番茄病情指数为20.26，防治效果为60.27%，虽略低于多菌灵（病情指数18.15，防效65.33%），但显著优于对照组，显示出良好的防治潜力。对酶活性测定发现，喷施生防菌株C08可湿性粉剂后植株SOD和POD活性在短期内显著升高，表明其可有效诱导植物抗性。

促生作用亦是生防菌剂的重要功能之一，已成为研究热点。陈雨薇等^［32］研究发现，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）GZ8-6可显著促进马铃薯生长，处理后的株高和地下部鲜质量较病原菌处理分别提升34.65%和124.79%。本研究同样证实，生防菌株C08可湿性粉剂显著促进番茄植株生长，株高、茎粗、地上部鲜质量及根系鲜质量分别较对照提高1.51倍、1.17倍、1.83倍和1.66倍；根系发育更旺盛、分布更广，有利于提高植株对土壤养分的吸收能力。

综上所述，本研究验证的制剂配方及应用效果与国内外同类研究结果一致，丰富了芽孢杆菌菌剂开发及应用的理论与实践基础，为绿色农业病害防控提供了可行技术方案。

4 结论

本研究成功筛选并鉴定了具有广谱抑菌及显著促生效果的枯草芽孢杆菌C08菌株，系统优化并开发了其高效稳定的可湿性粉剂制剂。该菌剂活菌数符合国家标准，物理化学性能优良。温室试验结果表明，生防菌株C08可湿性粉剂在300倍稀释条件下，能有效防治番茄早疫病并显著促进植株生长，增强植株抗氧化酶活性和抗病能力。研究成果为芽孢杆菌在植物病害绿色防控中的应用提供了新的技术路径，具备良好的推广前景，对推动可持续农业发展具有重要意义。

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基金资助

国家自然科学基金创新研究群体项目(32072588)

国家自然科学基金联合基金项目(U22A20495)

山东省重点研发计划项目(2024LZGCQY015)