陕西羽叶报春四倍体诱导、鉴定与性状分析

Induction, Identification, and Trait Analysis of Tetraploid Primula filchnerae

摘要

为探索陕西羽叶报春（Primula filchnerae）多倍体诱导技术，本研究分别采用种子浸泡法和生长点棉球滴加法进行秋水仙素处理，比较不同浓度与处理时间对发芽率、死亡率及四倍体诱导率的影响，并通过流式细胞术与根尖染色体计数进行倍性检测与验证。结果表明：秋水仙素处理总体抑制种子萌发并提高幼苗死亡率，但在适宜浓度下可显著提高四倍体诱导率。种子处理组中，0.02 g⋅L^-1、24 h处理组的种子发芽率最高，为（77.67±3.51）%；0.05 g⋅L^-1、24 h处理组的幼苗死亡率最低，为（2.16±0.93）%，且四倍体诱导率最高，为（30.12±4.02）%。生长点处理组中，0.05 g⋅L^-1处理效果最佳，四倍体诱导率为（40.00±10.00）%。流式细胞术检测结果表明，四倍体材料的G₀/G₁主峰较二倍体明显偏移；染色体计数进一步验证，二倍体染色体数为2n=2x=24，四倍体染色体数为2n=4x=48。形态学和细胞学比较分析表明，四倍体植株的叶片及花朵相关指标显著优于二倍体，生长势更强，观赏价值更高。此外，四倍体植株的气孔尺寸增大、气孔密度降低，符合多倍体植株的典型细胞学特征。综上所述，本研究建立了高效的陕西羽叶报春秋水仙素诱导与倍性鉴定技术体系，为该物种多倍体育种及种质创新提供了技术支撑。

Abstract

To establish an efficient polyploid induction protocol for Primula filchnerae， seeds and shoot apices were treated with colchicine using the seed immersion method and the cotton ball dropping method. The effects of different colchicine concentrations and treatment durations on germination rate， mortality rate and tetraploid induction rate were compared. Flow cytometry and root-tip chromosome counting were used for ploidy detection and verification. The results showed that colchicine treatment generally suppressed seed germination and increased seedling mortality rate， but it significantly increased the tetraploid induction rate at the optimal concentration. For seed treatment， the highest germination rate（77.67±3.51）% occurred under 0.02 g⋅L^-1 colchicine treatment for 24 h， while the lowest mortality rate（2.16±0.93）% and the highest tetraploid induction rate （30.12±4.02）% occurred under 0.05 g⋅L^-1 colchicine treatment for 24 h. For the shoot apex treatment， 0.05 g⋅L^-1 colchicine treatment had the highest tetraploid induction rate of （40.00±10.00）%. Flow cytometry analysis revealed that the G₀/G₁ peak of tetraploid plants was significantly shifted from that of diploids， and chromosome counting confirmed that the diploid chromosome number was 2n=2x=24 and the tetraploid chromosome number was 2n=4x=48. Morphological and cytological comparative analysis indicated that the leaf and flower-related traits such as growth potential and ornamental value of tetraploid plants were significantly superior to that of diploid plants. In addition， tetraploids had an increased stomatal size and a decreased stomatal density compared to diploids， which is consistent with typical cytological features of polyploids. In summary， this study established an efficient colchicine-induced polyploidization and ploidy identification protocol for P. filchnerae， and provides technical support for polyploid breeding and germplasm innovation in the species.

Graphical abstract

关键词

陕西羽叶报春 / 秋水仙素 / 四倍体 / 流式细胞术 / 染色体计数 / 形态学性状

Key words

Primula filchnerae / colchicine / tetraploid / flow cytometry / chromosome counting / morphological traits

多倍体育种是当前园艺植物改良与种质创新的关键技术之一。全基因组加倍可在细胞、组织及器官水平引发一系列连锁反应，从而影响植物生长发育，改变其功能性状及环境适应性，为优良新材料的培育与利用提供重要支撑^［1］。在园艺植物中，人工诱导多倍体常用于拓宽遗传变异基础并改良观赏性状（如花器官增大、叶色加深等）。此外，多倍体材料在抗逆性、次生代谢等功能性状方面往往表现出与二倍体不同的特征^［1-2］。然而，多倍体效应具有显著的物种特异性，且受诱导参数、外植体类型及鉴定流程等因素影响，多倍体诱导率与材料稳定性常存在较大差异。因此，建立针对目标物种的可重复诱导与鉴定体系，是多倍体育种投入实际应用的基础与前提^［2］。

秋水仙素作为经典的有丝分裂抑制剂，是园艺植物人工诱导多倍体最常用的化学诱导剂之一。其通过抑制微管聚合、阻断纺锤体形成，使复制后的染色体无法正常分离，从而实现染色体加倍^［3］。已有研究^［4-6］表明，在观赏植物及经济作物中，利用秋水仙素处理愈伤组织、分生组织或处理种子、幼苗等，可成功获得稳定的四倍体材料，并观察到典型的形态学与细胞学变化。例如，Ha等^［7］在大麻（Cannabis sativa）多倍体诱导试验中发现，0.5 mmol·L^-1秋水仙素处理24 h为最佳条件；Mo等^［8］研究表明，云锦杜鹃（Rhododendron fortunei）经0.1%秋水仙素浸泡24 h可获得最优诱导效果；Luo等^［9］指出，橡胶草（Taraxacum koksaghyz）在0.1%秋水仙素处理48 h时，多倍体诱导效率可达56.6%。上述研究表明，只有在适宜的外植体生理状态下，系统优化药剂浓度与处理时间，才能获得稳定的多倍体诱导与筛选效果^［10-11］。

陕西羽叶报春（Primula filchnerae）为中国特有的报春花科（Primulaceae）报春花属（Primula）多年生草本植物。其全株密被多细胞柔毛；花冠初开时呈紫色，后渐变为粉红色，裂片基部具橘黄至紫红色彩斑；果期花萼增大呈灯笼状，观赏价值突出^［12-13］。然而，该物种野外种群数量稀少，被《中国物种红色名录》和《世界自然保护联盟红色名录》列为濒危物种，亟需通过种质创新与繁殖技术促进资源保护与开发利用^［14-17］。报春花属植物的多倍体诱导主要采用化学方法^［18-21］。已有研究表明，不同报春花材料对秋水仙素的最适浓度与处理时间存在显著差异：田埂报春（P. forbesii）在0.08%秋水仙素处理48 h时诱导率最高（56%）^［18］；而滇北球花报春（P. denticulata subsp. sinodenticulata）需0.60%秋水仙素处理72 h，诱导率方达54%^［19］。总体而言，报春花多倍体诱导技术仍存在诱导效率不稳定、不同起始材料适配性不足及鉴定流程欠规范等问题，难以满足种质创新与产业应用需求^［22］。目前，针对陕西羽叶报春，尚缺乏以不同起始材料（如种子与生长点）进行诱导参数优化及可重复鉴定体系的系统研究，亦缺少对诱变四倍体表型特征的量化表征分析。

基于上述研究现状，本研究旨在比较秋水仙素处理对陕西羽叶报春种子与生长点两类起始材料的诱导效应，筛选关键诱导参数并建立稳定的倍性鉴定流程。此外，通过测定并比较诱变四倍体与二倍体对照的形态指标及气孔特征，明确多倍体化引发的表型变异。研究结果将为陕西羽叶报春四倍体种质创制及园艺开发应用提供可重复的技术路线与材料基础。

1 材料与方法

1.1　供试材料

本研究设置种子处理组与生长点处理组多倍体诱导试验。种子处理组供试材料为2024年4月于果实成熟期采收的陕西羽叶报春种子（图1A）。种子近球形、略扁，直径0.6~2.2 mm，褐色至深褐色，表面粗糙，千粒质量约为0.118 g。生长点处理组供试材料为购自北京花木有限公司的陕西羽叶报春幼苗（图1B），单株具4~6片叶。

1.2　陕西羽叶报春多倍体诱导

1.2.1　种子处理组诱导试验

选取饱满种子，于清水中浸泡24 h。吸干表面水分后，进行秋水仙素浸泡。试验采用二因素全因子设计（表1），设置3组秋水仙素质量浓度（0.02、0.05、0.10 g·L^-1）与3组浸泡时间（12、24、48 h）。以清水浸泡为对照（CK），每组处理300粒种子。将V（沙壤土）∶V（珍珠岩）∶V（腐殖土）=1∶1∶1混匀，填入72孔穴盘中，压实、整平。浸泡后的种子用蒸馏水冲洗3~5次，播种于穴盘中，覆盖塑料薄膜。待子叶展开后揭除薄膜，统计植株发芽率。培养30 d后统计植株死亡率。发芽后120 d内，每周记录地上部分生长情况。

1.2.2　生长点处理组诱导试验

将少量医用脱脂棉置于幼苗茎尖生长点处，分别滴加清水（CK）、秋水仙素溶液（0.02、0.05、0.10 g·L^-1），使棉球充分湿润。处理期间每12 h各滴加1次，连续处理48 h。试验共设置4个处理组（表2），每处理组30株幼苗。处理后120 d内，每周记录地上部分生长情况。

1.3　多倍体鉴定

以二倍体植株为对照，采用流式细胞术检测秋水仙素处理后所有存活植株的倍性，依据G₀/G₁主峰位置判定DNA含量^［23］。从各处理组存活的植株采集幼嫩叶片，去除中脉后剪取40~50 mg组织，蒸馏水洗净并吸干表面水分后，置于塑料培养皿中备用。向样品中加入1 mL新鲜配制的细胞核提取液，于冰上使用双面刀片迅速切碎组织。使用1 mL移液器吸取样品，经孔径48 μm的尼龙筛网过滤至2 mL离心管中。加入28 μL PI染液，避光孵育30 min，上机检测。通过分析DNA含量峰值位移，筛选出DNA含量加倍植株，进一步进行染色体计数鉴定。

对经流式细胞术筛选的疑似多倍体植株进一步采用染色体计数法进行倍性验证。首先，于晴天上午09：00—10：00剪取长约2 mm根尖，置于0.10 g·L^-1秋水仙素溶液中，4 ℃避光处理2.5 h，以抑制纺锤体形成，促进染色体凝缩。处理结束后，蒸馏水冲洗根尖3~5次，去除残留药液。随后，使用新配制的卡诺氏固定液（V（无水乙醇）∶V（冰醋酸）=3∶1）于4 ℃固定24 h。固定后，用蒸馏水冲洗3次，转入0.075 mol·L^-1 KCl低渗液中处理8 min，使染色体分散。低渗处理后，将根尖置于1 mol·L^-1盐酸中，60 ℃水浴解离10 min。解离结束后，用蒸馏水冲洗4~5次，每次更换清水，持续10 min，以去除残留解离液。将根尖置于载玻片上，用手术刀和解剖针轻轻分散组织，使细胞均匀散开。滴加卡宝品红染液，染色10 min，压片^［24-25］。显微镜下观察染色体数目，与二倍体对照比较，确定倍性水平，统计各组变异植株数量及四倍体诱导率。

1.4　形态学观察

以相同栽培条件下的二倍体植株为对照，对四倍体植株进行形态学观测。测定指标包括株高、叶片数量、叶面积、花葶高、花葶数量、花朵直径及地径等，系统比较二倍体与四倍体植株的形态差异^［26］。

1.5　气孔性状观测

选取充分展开的成熟叶片，用镊子撕取下表皮，平铺于洁净载玻片上，滴加蒸馏水，覆盖盖玻片，制备临时装片。于显微镜下随机选取3个视野，测量保卫细胞长度与宽度，统计气孔数目，计算气孔密度。

1.6　数据处理

试验数据以均值±标准差（mean±SD）表示，所有处理设置3次重复（n=3）。使用Microsoft Excel 2019整理数据，使用IBM SPSS Statistics 27.0进行统计分析，使用Origin 2024作图。使用Adobe Photoshop 2020与ImageJ 1.54处理图片，使用BD Accuri C6 Plus配套分析软件处理流式细胞仪数据。

2 结果与分析

2.1　秋水仙素处理对种子发芽率和幼苗死亡率的影响

2.1.1　发芽率

统计分析结果如图2所示，对照组发芽率显著高于其他处理组，说明秋水仙素处理对陕西羽叶报春种子萌发具有抑制作用。同时，综合浸泡时间和浸泡质量浓度分析表明，在0.02 g·L^-1秋水仙素浸泡24 h时种子发芽率最高，为（77.67±3.51）%，显著高于其他处理组（P<0.05）；其他处理组之间未发现显著性差异（P>0.05）。

对秋水仙素质量浓度与浸泡时间进行双因素方差分析，结果如表3所示。秋水仙素质量浓度与浸泡时间对种子发芽率的影响均达到显著水平（P<0.001）；二者交互作用也达显著水平（P<0.001），表明2个因素共同调控种子发芽率。相较于浸泡时间，秋水仙素质量浓度对种子发芽率的影响更为显著。这表明：在秋水仙素诱导中，秋水仙素质量浓度对种子发芽的影响大于浸泡时间。

2.1.2　死亡率

由图3可知，对照组及0.10、0.02 g·L^-1秋水仙素处理组幼苗死亡率均随浸泡时间延长而升高。0.05 g·L^-1秋水仙素48 h处理组幼苗死亡率较12 h处理组也有所升高。这表明：延长秋水仙素浸泡时间导致幼苗死亡率升高。相同浸泡时间下，各秋水仙素处理组幼苗死亡率都显著高于对照组（P<0.05），进一步证实秋水仙素处理对陕西羽叶报春幼苗的毒害效应。当浸泡时间为24 h，0.05 g·L^-1秋水仙素处理组幼苗死亡率（（2.16±0.93）%）显著低于其他处理组（P<0.05）。

对秋水仙素质量浓度与浸泡时间进行双因素方差分析，结果如表4所示。秋水仙素质量浓度与浸泡时间对幼苗死亡率的影响均达到显著水平（P<0.001），且二者交互作用也达显著水平（P<0.001），表明2个因素共同调控幼苗死亡率。表4中F表明，二者对幼苗死亡率的影响程度相近。

2.2　四倍体鉴定结果

2.2.1　流式细胞术倍性鉴定结果

采用流式细胞术对秋水仙素处理后存活植株进行倍性鉴定。相对荧光强度直方图（图4）显示，疑似四倍体样品（图4B）相对荧光强度的主峰位置约为二倍体对照（图4A）的2.0倍，表明其核DNA相对含量加倍，符合四倍体特征。

2.2.2　染色体数量鉴定结果

为进一步确证流式细胞术筛选的疑似四倍体植株，采用根尖压片法进行染色体计数。观察结果如图5所示，二倍体植株根尖细胞染色体数为24条（2n=2x=24，图5A），而疑似四倍体植株染色体数为48条（2n=4x=48，图5B），证实其为四倍体。

2.3　四倍体诱导率

2.3.1　种子处理组

由图6可知，不同秋水仙素质量浓度下，四倍体诱导率随浸泡时间的变化趋势存在差异。0.02 g·L^-1秋水仙素处理下，四倍体诱导率随浸泡时间延长总体呈上升趋势；0.10 g·L^-1秋水仙素处理下呈下降趋势；0.05 g·L^-1秋水仙素处理下呈先上升后下降趋势，其中24 h处理组四倍体诱导率达（30.12±4.02）%，显著高于其他组（P<0.05）。相同浸泡时间下，四倍体诱导率同样存在差异。浸泡12 h时，诱导率随秋水仙素质量浓度升高呈上升趋势；浸泡24 h与48 h时，呈先上升后下降趋势，在0.05 g·L^-1秋水仙素处理下达到峰值。综合浸泡时间和秋水仙素质量浓度分析表明，本试验范围内0.05 g·L^-1秋水仙素处理24 h诱导效果最佳。

对秋水仙素浸泡时间与质量浓度进行双因素方差分析，结果如表5所示。秋水仙素质量浓度与浸泡时间对诱导率的影响均达到显著水平（P<0.001），且交互作用显著（P<0.001）。表5中F显示，相较于质量浓度，浸泡时间对诱导率的影响更为显著，表明控制浸泡时间对多倍体诱导效果的影响大于质量浓度的影响。

2.3.2　生长点处理组

如表6所示，0.05 g·L^-1秋水仙素处理的四倍体诱导率较高，可达到（40.00±10.00）%，显著高于0.10 g·L^-1秋水仙素处理（P<0.05）；与0.02 g·L^-1秋水仙素处理相比差异未达到显著水平（P>0.05），但诱导率数值仍略高。如表7所示，不同质量浓度秋水仙素处理对植株死亡率的影响未达到显著水平（P>0.05），表明在本试验条件下，生长点滴加处理对幼苗存活影响较小。相比之下，秋水仙素处理质量浓度对四倍体诱导率的影响达到显著水平（P<0.05），说明秋水仙素可有效诱导生长点材料发生倍性变异。

2.4　陕西羽叶报春二倍体与四倍体形态及细胞学差异

2.4.1　形态变化

种子处理组和生长点处理组经120 d培养后，所有存活植株经过流式细胞术判定倍性，观察发现四倍体与二倍体的形态存在差异（图7）。对植株叶面积、叶片数量、花葶高、花葶数量、花朵数量、花朵直径及地径进行测定，结果如表8所示。种子处理组，四倍体植株除地径外，其余指标均显著高于二倍体（P<0.001）。开花前，株高动态变化如图8所示，四倍体植株生长速率较快，处理70 d时株高高于二倍体，表明其生长势更强。

2.4.2　细胞变化

对四倍体和二倍体植株进行气孔观察（图9），并统计分析气孔特征（表9）。结果表明，四倍体植株保卫细胞长、宽均显著高于二倍体植株（P<0.001）；气孔密度显著低于二倍体。

3 讨论

本研究以种子和幼苗生长点为起始材料，系统优化了秋水仙素诱导陕西羽叶报春多倍体的参数条件。结果表明，不同材料类型的诱导效应存在显著差异。种子浸泡处理中，秋水仙素质量浓度、处理时间及其交互作用对种子发芽率、植株死亡率及四倍体诱导率均有显著影响（P<0.05），但幼苗生长点棉球滴加处理在试验质量浓度范围内对成苗存活的影响相对较小。这表明种子和分生组织对秋水仙素的敏感性及耐受阈值存在差异，需针对不同起始材料优化诱导方案^［27］。综合各项指标，本研究确定种子诱导最优条件为0.05 g·L^-1秋水仙素处理24 h，可在保持极低死亡率（约2%）的同时获得约30%的四倍体诱导率；幼苗生长点以0.05 g·L^-1秋水仙素处理48 h可获得更高的四倍体诱导率（约40%），且对植株生长影响较小。该结果与其他物种的研究结果一致，例如，欧芹（Petroselinum crispum）比较试验^［28］表明，茎尖分生组织诱导成功率显著高于种子处理；以紫毛兜兰（Paphiopedilum villosum）芽尖等分生组织为外植体，可在严格控制损伤程度、保证成活率的前提下，诱导获得四倍体植株^［29］。为确保不同处理条件下变异植株倍性判定的准确性，同时兼顾大规模样本筛选效率，本研究采用流式细胞术快速筛查全部存活植株，并结合根尖染色体计数确证倍性^{［23，30］}。基于双重鉴定策略，本研究进一步证实了流式细胞术与染色体计数在多倍体鉴定中的可靠性，并构建了完善的多倍体鉴定流程。该高效诱导与鉴定体系为报春花属植物多倍体育种奠定了技术基础。

多倍体植株与二倍体植株相比通常表现出巨大化表型特征（Gigas效应）^［31］。本研究中，陕西羽叶报春四倍体表现出典型的巨大化变异。其营养生长指标如叶片数量、单叶面积及基部茎粗均较二倍体显著增加（P<0.001），生殖生长方面，单株花序数量、花朵数量及花径也显著高于二倍体（P<0.001）。这些形态性状的提升表明，染色体加倍有效增强了植株物质积累能力与结构发育潜力，使四倍体个体具有更优的生长势与观赏价值。类似的多倍体巨大化效应在其他园艺植物中已有广泛报道，例如四倍体兜兰较二倍体表现出叶片、气孔等组织细胞尺寸增大和器官膨大^［29］。这类巨大化现象往往与细胞体积增大、细胞周期调控改变和组织水平细胞增殖有关。已有研究^［32］表明，倍性变化通过影响细胞扩张与细胞增殖过程，改变细胞、组织与器官的结构比例关系，使多倍体植株表现出更强的细胞储存能力，但可能降低结构稳定性。从调控层面来看，倍性加倍可通过基因剂量效应引发转录组快速响应，并伴随表观遗传的重新编程（如DNA甲基化修饰变化），导致多倍体表型差异^［33-34］。基于上述分子机制证据，可推测本研究获得四倍体材料的形态优势是多层级调控的综合结果。另一方面，多倍体常伴随代谢物谱变化。部分研究观察到四倍体次生代谢成分及抗氧化能力提升，例如，金银花（Lonicera japonica）四倍体叶片酚类物质含量及抗氧化酶活性均高于二倍体^［35］。由此推测，陕西羽叶报春四倍体材料可能具有更优的生理适应性，例如抗逆性提高或次生代谢产物富集，有待进一步功能性试验验证。

气孔特征变化是多倍体细胞学效应的重要表现之一。本研究发现，四倍体植株气孔保卫细胞长度和宽度显著大于二倍体，而单位面积气孔数量显著降低。许多其他植物的多倍体中均观察到气孔增大、密度降低的现象，如甘牛至（Origanum majorana）^［36］、桑树（Morus spp.）^［37］、纹瓣兰（Cymbidium aloifolium）^［38］。该现象常被用作鉴别二倍体与四倍体的早期判定依据^［39］。气孔特征与功能性状密切相关^［40］。较大的气孔孔径有利于在适宜光照和水分条件下提升叶片CO₂扩散与同化速率，而较低的气孔密度可减少蒸腾水分损失。这种双向调节有助于提高水分利用效率及抗旱能力，并对光合效率产生正向作用^［41-42］。因此，后续可测定陕西羽叶报春四倍体气体交换参数、叶片水势及脱落酸含量等指标，进一步验证气孔表型变化对光合作用及蒸腾现象的优化效应。

4 结论

本研究建立了陕西羽叶报春秋水仙素诱导的可重复技术体系，构建了全部存活植株流式细胞术快速筛查结合根尖染色体计数确证的倍性鉴定流程。比较两类起始材料结果表明，幼苗生长点处理四倍体诱导效率更高，可达到（40.00±10.00）%，且对植株损伤较小，技术可控性更强。种子浸泡处理在平衡幼苗成活率与四倍体诱导率的条件下，同样可获得稳定四倍体材料。倍性鉴定结果显示，陕西羽叶报春二倍体染色体数为2n=2x=24，诱导四倍体染色体数为2n=4x=48。四倍体在形态与细胞学指标上表现出显著且符合多倍体规律的差异，可作为早期鉴定与育种筛选的依据。综上，秋水仙素可有效诱导陕西羽叶报春四倍体，该诱导体系与所获材料为多倍体育种与种质创新提供了技术支撑。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32371953)

大学生创新创业训练计划项目(XN2025024023)