白桦BpLUXs基因鉴定与功能验证

Identification and Preliminary Functional Analysis of the BpLUXs Gene in Betula platyphylla Suk.

摘要

光周期（photoperiod）是调控林木季节性生长与生长停止的关键环境因子。在光周期信号感知和转导过程中，生物钟晚间复合体（evening complex，EC）的核心组件-节律失常蛋白（LUX ARRHYTHMO，LUX）在其中发挥重要作用。本研究在白桦（Betula platyphylla）参考基因组中分析得到47个BpLUXs同源基因。生物信息学分析表明，BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18具有典型的Evening Element（EE）顺式作用元件，BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18均具有典型的MYB保守结构域，BpLUX1、BpLUX5具有典型的昼夜节律表达模式。通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除BpLUX1和BpLUX5，成功创制BpLUX1功能缺失突变体bplux1（BpLUX5基因敲除未成功）。表型分析结果表明，在短日照（short-day，SD）条件下，野生型白桦响应短光周期在第19天开始几乎全部停止生长，而bplux1突变体仍保持活跃生长状态，同时，野生型白桦株高未表现出显著性差异，而bplux1突变体株高显著增高，表现出延迟生长停止表型，表明BpLUX1是白桦响应短日照、诱导生长停止的关键基因。转录组分析进一步揭示，在SD条件下，bplux1突变体中脱落酸（abscisic acid，ABA）信号通路中脱落酸受体调控组分1基因BpRCAR1（Regulatory Component of ABA Receptor 1）等11个差异表达基因下调，赤霉素（gibberellin，GA）信号通路中赤霉素不敏感类似物1基因BpRGL1（RGA-Like 1）等7个差异表达基因上调，并且BpLUX1与ABA和GA信号通路中的关键差异表达基因有潜在的结合位点。这表明BpLUX1基因可能通过影响植物激素信号进一步影响白桦生长停止。综上所述，本研究为解析BpLUX1在光周期调控白桦生长停止的过程中发挥功能提供了一定的理论依据。

Abstract

Photoperiod serves as the key environmental cue governing seasonal growth and growth cessation in forest trees. Within the perception and transduction of photoperiodic signals， LUX ARRHYTHMO（LUX）， a core component of the circadian clock Evening Complex（EC）， plays a pivotal role. In the present study， a total of 47 BpLUX homologous genes were identified through genome-wide analysis in the reference genome of Betula platyphylla. Bioinformatic analyses revealed that BpLUX1， BpLUX5， and BpLUX18 harbor typical Evening Element（EE） cis-acting elements. All three genes possessed characteristic MYB conserved domains， while BpLUX1 and BpLUX5 additionally exhibited typical circadian rhythmic expression patterns. Using CRISPR/Cas9-mediated genome editing， loss-of-function mutants for BpLUX1（bplux1） were successfully generated， whereas targeted knockout of BpLUX5 proved unsuccessful. Phenotypic characterization demonstrated that under short-day（SD） conditions， wild-type birch ceased growth almost entirely by day 19 in response to shortened photoperiods， whereas bplux1 mutants remained actively growing. Furthermore， while no significant difference in plant height was observed in wild-type plants， bplux1 mutants displayed significantly increased height， exhibiting a delayed growth cessation phenotype. These findings indicate that BpLUX1 is a key gene mediating short-day responses and growth cessation in birch. Transcriptome analysis further revealed that under SD conditions， eleven differentially expressed genes（DEGs） were down-regulated in bplux1 mutants， including BpRCAR1 （Regulatory Component of ABA Receptor 1） involved in ABA （abscisic acid） signaling， whereas seven DEGs were up-regulated， including BpRGL1（RGA-Like1） associated with GA （gibberellin） signaling. Notably， potential binding sites between BpLUX1 and key DEGs in ABA and GA signaling pathways were identified， suggesting that BpLUX1 may influence growth cessation through modulation of phytohormone signaling. Collectively， this study provides a theoretical basis for understanding the role of BpLUX1 in photoperiod-regulated growth cessation in birch.

Graphical abstract

关键词

白桦 / BpLUX / 光周期 / 生长停止

Key words

Betula platyphylla / BpLUX / photoperiod / growth cessation

白桦（Betula platyphylla）为桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）长日照落叶乔木，是桦属中自然分布最广的一种，自喜马拉雅山脉东经青藏高原东、秦岭至中国东北，跨贺兰山、阴山、燕山，北抵大兴安岭、小兴安岭及长白山地，向北至蒙古中部、俄罗斯西伯利亚中东部；东接朝鲜半岛、日本中部以北至俄罗斯的远东地区^［1］。然而，其自然分布区冬季寒冷漫长，春季霜冻频繁，加之生长习性限制，制约了白桦的人工种植范围。温带及寒温带地区的多年生木本植物的生长发育与季节性变化密切相关，通过进化形成了精确的物候适应机制，其中光周期调控的季节性生长停止是保障其越冬存活的关键^［2］。白桦作为我国北方重要的先锋树种，具有重要的生态功能与经济价值，但对短日照诱导的生长停止敏感，限制了其分布范围向低纬度扩张。

林木的生长发育与季节变化高度耦合，其中光周期是最关键的环境信号之一。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，光周期调控开花的分子机制已得到系统阐释，其信号网络由光受体、生物钟及下游基因三部分协同构成^［3］。光受体首先感知光信号并传递至生物钟组分，生物钟振荡器整合光-暗周期信息后，将时序信号输出至下游靶基因，通过调控其表达实现对光周期响应的调控^［3-4］。根据开花所需日照长度不同，植物可分为长日照（long-day，LD）植物，如小麦（Triticum aestivum）；短日照（short-day，SD）植物，如水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、菊花（Chrysanthemum morifolium）、烟草（Nicotiana tabacum）等；以及日中性（day-neutral，DN）植物，如番茄（Solanum lycopersicum）、月季（Rosa chinensis）等^［5-6］。

拟南芥的生物钟分子网络是研究最为深入的系统之一，核心是一个由多重转录-翻译反馈环TTFL（Transcription-Translation Feedback Loop）构成的复杂振荡器。该振荡器的核心组分主要包括早晨表达的生物钟相关联蛋白CCA1（Circadian Clock Associated 1）和晚下胚轴蛋白LHY（Late Elongated Hypocotyl）。CCA1和LHY蛋白能直接结合到傍晚基因CAB表达时序调控基因TOC1（Timing of CAB Expression 1）的启动子上，抑制其表达，从而形成一个核心反馈环^［7］。TOC1（PRR1）是拟南芥伪应答调节因子（Pseudo-Response Regulator，PRR1/TOC1，PRR3，PRR5，PRR7，PRR9）家族成员中的一员，它们在整个昼夜周期中依次表达，其中TOC1在傍晚达到峰值^［8］。研究表明，TOC1本身是一个DNA结合转录因子，能够直接抑制CCA1和LHY的表达，从而形成一个闭环^［9］。此外，PRR9、PRR7和PRR5也被证实是关键的转录抑制因子，它们与TOC1协同作用，在日间依次表达并逐步抑制CCA1/LHY的转录，构成了精细的日间抑制环路^［10］。另一个关键的调控模块是傍晚至夜间发挥作用的ELF3（Early Flowering 3）-早花基因ELF4（Early Flowering 4）-节律失常蛋白（LUX）复合体，即所谓的“晚间复合体”（evening complex，EC）^［11］。该复合体以LUX蛋白为核心DNA结合组分，ELF3为支架蛋白，ELF4则对复合体的稳定性与功能至关重要。ELF4基因被发现同时控制生物钟节律和开花时间^［12］，晚间复合体EC直接靶向并结合包括PRR9在内的多个生物钟基因启动子，抑制其在夜间的表达，从而确保振荡的相位和精度^［13］。

近年来，随着研究的深入，LUX基因的功能被发现已超越基础生物钟调控，广泛参与温度应答、光周期开花、非生物胁迫响应及生长发育等多个过程，且其功能在不同物种中既具有保守性又存在特异性分化。光周期作为环境信号，通过调控LUX基因的表达节律、蛋白稳定性和复合体组装，将日照长度信息转换为内源生物钟信号，进而精确控制植物的开花时间和其他季节性生理过程^［14］。在拟南芥中，LUX的研究最为系统。它不仅是核心时钟振荡器的重要元件，还介导生物钟与防御反应^［15］。此外，LUX还能通过Jumonji结构域蛋白5（Jumonji domain-containing 5，JMJD5）基因和Jumonji结构域蛋白30（Jumonji domain-containing protein 30，JMJ30）基因的作用来实现时钟的温度补偿，确保生物钟在不同温度下的稳定性^［16］。在低温胁迫响应中，LUX受CBF1的转录调控，将低温信号输入生物钟，并与茉莉酸代谢途径协同调控植物的耐冷性^［17-18］。LUX还通过PRR9正调控红光超敏感蛋白ORE1（Oversensitive to Red Light 1）基因表达，从而参与叶片衰老的昼夜控制^［19］。在水稻中，OsLUX功能研究已取得了显著进展，它通过招募OsELF3-1和OsELF4s形成夜间复合物，直接抑制关键基因抽穗期调控基因Hd1（HeadingG Date 1）和穗粒数量、株高和抽穗期调控基因Ghd7（Grain Number，Plant Height and Heading Date 7）的表达，从而调控光周期依赖的抽穗期^［20-21］。OsLUX同样与ELF3a和ELF4a互作，协调营养生长与光周期开花^［22］。在其他物种中，LUX功能也表现出不同的调控模式，在大豆中GmLUX被证实是调控生育期的重要因子^［23］；在茶树（Camellia sinensis）中LUX则整合CBF通路与茉莉酸代谢，以增强植株耐寒性^［18］。

本研究通过生物信息学和转录组学分析鉴定到白桦生物钟BpLUX1基因，使用白桦遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术对BpLUX1基因进行靶向敲除并获得突变体，为进一步探究光信号与白桦bplux1突变体之间的关系，设置不同光照周期进行处理，初步研究表明：BpLUX1基因对光周期的响应可能通过调控植物激素通路，进而影响白桦生长停止过程。该研究为白桦跨纬度种植提供理论依据和实践指导，对白桦分子育种和重要性状遗传改良具有重要意义。

1 材料与方法

1.1　试验材料

本研究所使用的白桦种子来源于东北林业大学白桦强化种子园，所用植物材料为生长室条件下培养的白桦野生型DL-1。通过白桦遗传转化方法获得转基因编辑株系，后续采用3月龄的转基因编辑株系为试验材料，每个株系设置3个生物学重复。

1.2　试验方法

1.2.1　白桦BpLUXs基因家族查找及鉴定

在TAIR-Home（https：//www.arabidopsis.org/）网站查询拟南芥AtLUX的基因号及蛋白质序列在白桦蛋白质数据库里进行蛋白同源序列比对。使用EXpasy（https：//web.expasy.org/protparam）网站对BpLUXs同源基因的氨基酸数量、等电位点、相对分子质量进行预测分析，通过Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLoc-2）网站对BpLUXs同源基因的亚细胞定位进行预测。

1.2.2　白桦BpLUXs系统发育树构建

在NCBI数据库中下载拟南芥、欧洲榛（Corylus avellana）、欧洲桤木（Alnus glutinosa）、银中杨（Populus alba×berolinensis）等物种LUX蛋白的氨基酸序列，使用MEGA-X软件与白桦BpLUXs氨基酸序列，构建系统发育进化树。

1.2.3　白桦BpLUXs基因顺式作用元件预测

使用TB tools软件提取BpLUXs基因起始密码子上游2 000 bp为启动子序列，利用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站对BpLUXs基因启动子顺式作用元件进行预测分析。

1.2.4　白桦BpLUXs基因保守结构域分析

使用Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe）网站查询并下载拟南芥AtLUX的CDS序列、基因DNA序列和氨基酸序列及白桦BpLUXs的CDS序列、基因DNA序列和氨基酸序列，利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.）网站进行保守结构域分析。

1.2.5　白桦BpLUXs基因转录组表达模式分析

使用2022年9月于东北林业大学一天内不同时刻（03：00、06：00、12：00、15：00）采集自然条件下生长的白桦野生型DL-1独立植株的顶芽，通过康为世纪Omini Plant RNA Kit（DNaseⅠ）植物RNA提取试剂盒，提取顶芽总RNA。随后在Illumina测序平台进行双末端（Paire-end，PE）测序，得到的原始数据使用FastQC进行处理评估，然后使用HTseq和Stringtie工具，生成原始Reads Count和FPKM值^［24］。基于上述转录组测序分析，使用DEseq2（版本1.48.1）中位数比值法进行差异表达基因筛选。设定P<0.05，\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{d}\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{a}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{e}\right|>\mathrm{1}，筛选同时满足P<0.05和\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{d}\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{a}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{e}\right|>\mathrm{1}条件的差异表达基因以进行下一步分析^［25］。

1.2.6　白桦BpLUXs基因表达模式鉴定

在植物生长室长日照条件下，分别于早晨（M，开灯后30 min，07：30）、午后（N，15：00）和夜间（E，关灯前30 min，22：30）3个特征时刻，采集白桦野生型DL-1幼苗的顶芽，使用康为世纪Omini Plant RNA Kit（DNase Ⅰ）植物RNA提取试剂盒，提取顶芽总RNA，使用Takara PrimeScript^TM RT reagent Kit试剂盒进行cDNA反转录。根据cDNA序列信息进行引物设计（表1），内参基因选择BpTubulin基因，以cDNA为模板进行qRT-PCR，使用{\mathrm{2}}^{-∆∆\mathrm{C}\mathrm{t}}公式计算基因的相对表达量^［26］。

1.2.7　白桦基因编辑载体构建及突变位点鉴定

将根据基因编辑引物设计原则设计的引物（表2）进行引物二聚化，使用T4连接酶将引物二聚化产物与线性化的pSC1-U6-2载体连接。载体构建成功后，使用农杆菌介导的白桦合子胚遗传转化方法获得转基因编辑材料^［27］，以草铵膦（basta）为筛选剂，选择培养转基因材料。取转基因株系幼苗叶片进行基因编辑阳性鉴定及突变位点检测，鉴定及检测引物如表2。

1.2.8　RNA测序采样与生物信息学分析

对植物生长室长日照（LD，16 h光照/8 h黑暗）和短日照（SD，8 h光照/16 h黑暗）培养4周的白桦bplux1突变体与白桦野生型DL-1，在每种株系3株独立植株上采集顶芽。使用康为世纪Omini Plant RNA Kit（DNaseⅠ）植物RNA提取试剂盒，提取顶芽总RNA。测序方法参考1.2.5。使用TB tools软件进行差异表达基因分析并进行可视化处理，使用基迪奥在线网站（https：//www.omicshare.com/）进行KEGG富集分析。通过Plant PAN网站（https：//plantpan.itps.ncku.edu.tw/plantpan4/index.）进行结合位点预测。

2 结果与分析

2.1　白桦 BpLUXs 基因分析

2.1.1　白桦BpLUXs基因鉴定结果

本研究通过蛋白同源序列比对筛选，共获得47个白桦BpLUXs候选基因，按照比对相似度依次命名为BpLUX1~BpLUX47，具体信息见表3。这些基因的蛋白相似度分布于32.91%~63.24%，表明该基因家族在白桦基因组中存在一定程度的扩张与功能分化。

2.1.2　白桦BpLUXs系统发育进化树分析

为进一步探究BpLUXs家族的系统进化关系，通过构建系统发育进化树，分析拟南芥、欧洲榛、欧洲桤木、银中杨等物种LUX蛋白的氨基酸序列与白桦BpLUXs氨基酸序列（图1A）。系统发育进化树分析结果表明，白桦BpLUXs家族主要聚类为4个亚群（图1A~D），每个群组都聚集不同数量的BpLUX。在群组A中聚集4个BpLUXs；在群组B中聚集8个BpLUXs；在群组C中包含数量最多的成员，共聚集28个BpLUXs，并且它们与欧洲桤木聚于同一群组；在群组D中聚集6个BpLUXs，在这个群组中聚集的物种最多，其中BpLUX1与拟南芥和杨树亲缘关系较近。

2.1.3　白桦BpLUXs顺式作用元件分析

此前有研究^［13］表明，由ELF3、ELF4、LUX基因共同组成的EC启动子区域具有晚间因素EE元件，并且EE元件是晚间基因标志性的顺式作用元件。因此，本研究比对了白桦BpLUXs基因家族启动子区域的EE元件（图1B），结果表明：BpLUX1启动子区域具有2个EE元件，BpLUX5、BpLUX18启动子区域具有1个EE元件。由此推测，BpLUX1、BpLUX5、BpLUX18可能具有与生物钟基因LUX相似的参与光周期信号感知与节律调控的功能。

2.1.4　白桦BpLUXs保守结构域分析

为了进一步验证BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18蛋白在进化上具有功能保守性，对拟南芥AtLUX与白桦BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18蛋白质结构进行预测（图1C），预测结果表明：拟南芥AtLUX的144~197位氨基酸为MYB保守结构域，60~229位氨基酸为PLN-golden2L转录因子；白桦BpLUX1的149~202位氨基酸为MYB保守结构域和SANT保守结构域，74~235位氨基酸为PLN-golden2L转录因子；白桦BpLUX5的203~256位氨基酸为MYB保守结构域和SANT保守结构域，201~291位氨基酸为PLN-golden2L转录因子，17~138位氨基酸为CheY保守结构域，20~134位氨基酸为REC保守结构域；白桦BpLUX18的50~106位氨基酸为MYB保守结构域和SANT保守结构域，50~103位氨基酸为PLN-golden2L转录因子，147~192位氨基酸为Myb CC型转录因子。分析发现，AtLUX、BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18具有同样的MYB保守结构域、SANT保守结构域和PLN-golden2L转录因子，这说明拟南芥AtLUX蛋白与白桦BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18蛋白在进化中可能具有功能保守性，为其参与生物钟转录调控网络提供了结构基础。

2.1.5　白桦BpLUXs转录组表达模式分析

为了验证候选BpLUXs基因的昼夜节律表达特性，本研究使用一天内不同时刻（03：00、06：00、12：00、15：00）取样的白桦野生型DL-1顶芽进行转录组测序分析（图1D）。分析结果表明，白桦BpLUX1和BpLUX5在15：00和03：00呈现表达量上调，在其余时刻表达水平较低，而BpLUX18表现出节律失调的表达模式。BpLUX1和BpLUX5这一表达模式与拟南芥中AtLUX作为生物钟晚间基因的表达特征高度吻合。

2.2　白桦 BpLUXs 表达模式鉴定结果

为了更精确的验证BpLUX1、BpLUX5和BpLUX18的表达模式，本研究分析BpLUXs在一天中的节律表达模式（图2）。结果表明，BpLUX1和BpLUX5的表达量均在夜间达到峰值，在其他时间表达量相对较低，BpLUX1和BpLUX5的表达模式符合生物钟晚间基因的典型节律表达模式，而BpLUX18的表达模式不符合该节律表达模式。上述系统发育进化树分析、顺式作用元件分析、转录组分析和保守结构域分析结果表明，BpLUX1和BpLUX5很可能为白桦生物钟LUX基因，可能作为白桦EC复合体的核心参与生物钟调控网络。

2.3　白桦 bplux1 突变体的获得与鉴定结果

为了探究白桦BpLUXs基因在白桦生长发育中的作用，利用CRISPR/Cas9技术对白桦中具有昼夜节律表达模式的BpLUX1和BpLUX5基因进行了基因编辑，根据基因编辑靶点设计原则各设计了2个sgRNA（图3A）。采用农杆菌（Agrobacterium）介导的白桦合子胚遗传转化方法对白桦DL-1野生型成熟合子胚进行遗传转化，经过共培养、选择培养、分化培养、继代培养、生根培养、移土培养6个阶段（图3B），提取叶片基因组DNA进行转基因阳性鉴定及序列检测（图3C、3D），得到bplux1突变体，但未获得bplux5突变体。测序结果表明，bplux1突变体检测到2种突变类型，一种在DNA序列111 bp处有41 bp缺失，另一种在DNA序列591 bp处有3 bp缺失（图3E）。2种编辑类型共获得98株bplux1突变体。

2.4　白桦 bplux1 突变体表型统计分析

为了探究BpLUX1基因在白桦光周期响应中的作用，本研究对白桦bplux1突变体和白桦野生型DL-1设置2种不同光周期条件（LD，16 h光照/8 h黑暗；SD，8 h光照/16 h黑暗），进行为期30 d的表型观察，结果表明：转基因株系和野生型的表型存在差异（图4A）。表型监测结果显示，白桦野生型DL-1表现为光周期敏感型，在短光周期诱导下，响应短日照信号并停止生长。而白桦bplux1突变体保持活跃生长。此外，通过30 d的连续观察和生长停止比例的统计（图4B），发现SD条件下的白桦野生型DL-1在第19天后开始几乎全部生长停止，而LD处理未能诱导生长停止。相应地，在SD条件下处理30 d后，白桦野生型DL-1植株顶芽停止生长，而白桦bplux1突变体植株的顶芽保持活跃生长状态。同时，在SD处理下第1天与第30天对比，bplux1突变体株高显著增高，而白桦野生型株高没有显著性差异（图4C、4D）。以上研究结果证明，白桦对短光周期具有敏感性，并且短光周期可以诱导白桦野生型DL-1生长停止，然而白桦BpLUX1功能缺失突变体bplux1对光周期不敏感，表现出延迟生长停止的表型。

2.5　白桦 bplux1 突变体转录组测序与分析

为了明确白桦响应光周期的变化，从全基因组层面揭示BpLUX1基因调控白桦光周期响应的分子网络。本研究对LD和SD条件下生长的白桦DL-1野生型和bplux1突变体的顶芽进行了转录组测序与分析，在“野生型LD vs突变体LD”比较组中共鉴定到2 059个差异表达基因，“野生型SD vs突变体SD”比较组中共鉴定到6 558个差异表达基因，其中在2个比较组中共同出现的差异表达基因有2 393个（图5A）。对延迟生长停止表型相关的SD组的6 588个差异表达基因进行分析，其中2 648个差异表达基因上调，3 940个差异表达基因下调（图5B）。对上述6 588个差异表达基因进行KEGG富集分析（图5C），结果显示：差异表达基因主要富集在核糖体、卟啉代谢、次级代谢产物的生物合成、脂肪酸代谢、代谢途径和植物激素信号转导等通路。

植物激素是芽休眠诱导、维持和解除过程中重要的内源性调节因子之一，并且存在多激素协同促进或拮抗作用^［28］。进一步分析发现，这些差异表达基因可能参与赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）信号通路的调控（图5D）。在GA信号通路中有部分差异表达基因在SD条件下的bplux1突变体中表达上调，其中包括赤霉素不敏感类似物1基因（BpRGL1，RGA-Like1）、光敏色素A信号转导1基因（BpPAT1，Phytochrome a Signal Transduction 1）、内皮层无淀粉质体1基因（BpEAL1，Endodermal-Amyloplast Less 1）、稻草人类似物3基因（BpSCL3，Scarecrow-Like 3）、光敏色素互作因子1基因（BpPIF1，Phytochrome-Interacting Factor 1）、BES1互作MYC类似物1基因（BpBIM1，BES1-Interacting MYC-Like1）、光敏色素互作因子3基因（BpPIF3，Phytochrome-Interacting Factor 3）；在ABA激素信号通路中大部分差异表达基因在SD条件下的bplux1突变体中下调，其中包括脱落酸受体调控组分1基因（BpRCAR1，Regulatory Component of ABA Receptor 1）、脱落酸受体调控组分3基因（BpRCAR3，Regulatory Component of ABA Receptor 3）、脱落酸不敏感1基因（BpABI1，ABA Insensitive 1）、脱落酸不敏感2基因（BpABI2，ABA Insensitive 2），AKT1互作蛋白磷酸酶1基因（BpAIP1，AKT1 Interacting Protein Phosphatase 1）、蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2-6基因（BpSNRK2-6，Sucrose Nonfermenting 1-Related Protein Kinase 2-6）、蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2-3基因（BpSNRK2-3，Sucrose Nonfermenting 1-Related Protein Kinase 2-3）、脱落酸响应元件结合因子3基因（BpABF3，Abscisic Acid Responsive Elements-Binding Factor 3）、脱落酸响应元件结合蛋白3基因（BpAREB3，ABA-Responsive Element Binding Protein 3）、开花位点D基因（BpFD）、亮氨酸拉链基序蛋白53基因（BpBZIP53， Basic Region/Leucine Zipper Motif 53）（图5E）。上述结果表明，BpLUX1可能通过上调GA信号通路中关键差异表达基因来促进突变体生长，同时通过下调ABA信号通路中关键差异表达基因来抑制生长停止，从而协同调控白桦光周期响应的生长停止过程。为进一步探究BpLUX1通过参与GA和ABA信号通路参与芽生长停止表型的调控，对ABA和GA信号通路中的差异表达基因启动子区域进行了结合位点预测分析（图5F）。结果表明，ABA信号通路的BpABF3、BpABI1、BpABI2、BpAIP1、BpRCAR3、BpBZIP53、BpFD、BpRCAR3的启动子区域可能具有与BpLUX1蛋白结合的位点（图5F-a）；BpSNRK2-3的启动子区域可能具有与BpLUX1蛋白结合的位点（图5F-b）；BpSNRK2-6的启动子区域可能具有与BpLUX1蛋白结合的位点（图5F-c）。而BpRGL1、BpPAT1、BpSCL3、BpPIF1、BpBIM1和BpPIF3等GA信号通路关键基因的启动子区域同样可能具有与BpLUX1蛋白结合的位点（图5F-d，e）。上述结果表明，这些基因可能作为BpLUX1蛋白潜在的直接下游靶基因，使得BpLUX1在转录水平上调控其表达，进而整合ABA和GA信号通路，调控白桦生长停止过程。

3 讨论

白桦是我国重要林业资源，作为北方重要的先锋树种，具有较高的生态和经济价值。白桦分布范围受限于光周期和温度，季节性生长停止是其适应寒冷的关键策略。目前关于白桦光周期调控生长停止的分子机制研究仍然有限，尤其是生物钟关键基因（如LUX）在该过程中的功能鲜有报道。

本研究在白桦基因组中鉴定到47个生物钟晚间基因BpLUXs。通过生物信息学，特别是顺式作用元件分析，筛选出BpLUX1、BpLUX5、BpLUX18具有EE顺式作用元件，这是生物钟晚间因子标志性的顺式作用元件^［17］。白桦BpLUX1、BpLUX5、BpLUX18基因编码的蛋白含有典型的MYB保守结构域，与拟南芥AtLUX在结构上高度一致（图1A）^［29］。转录组数据分析结果表明，BpLUX1、BpLUX5具有节律表达模式（图1D）。进一步通过qRT-PCR验证发现，BpLUX1、BpLUX5的表达呈现出与拟南芥研究中LUX作为生物钟晚间基因一致的昼夜节律变化，在黄昏至夜间早期表达量显著升高^{［11，30］}。上述生物信息学与表达模式分析为本研究奠定了基础。然而，本研究尚未通过试验验证BpLUX1是否与ELF3、ELF4在白桦中形成“EC复合体”，其在白桦生物钟调控网络中的具体位置有待进一步研究。BpLUX18虽然与BpLUX1和BpLUX5有相同的MYB保守结构域和EE顺式作用元件，但没有表现出与其相同的昼夜节律表达模式，可能是BpLUX18仅作为被生物钟基因调控的MYB转录因子，而不是生物钟核心振荡器的成员。

通过CRISPR/Cas9技术成功创制并获得BpLUX1功能缺失突变体bplux1。表型分析结果表明，bplux1在SD条件下顶芽保持活跃生长，而野生型则响应短光周期信号进入生长停止状态（图3）。这一结果表明，在白桦中BpLUX1基因可能是响应短日照信号、触发顶芽生长停止的关键基因。在木本植物中，光周期诱导的生长停止是适应温带及寒温带寒冷环境的重要策略^［31］，本研究在白桦中证实BpLUX1基因在此过程中的重要性，有望创制对光周期不敏感的白桦种质。目前，本研究仅在短光周期诱导的白桦生长停止过程中的bplux1突变体表型进行了分析。有研究表明，部分生物钟基因，如LHY的表达下调，会同时延迟杂交白杨的生长停止与生长起始^［32］；过表达RVE1基因不仅延迟了杨树的生长停止，同时也促进了芽的萌发^［33］。在未来研究中，深入分析bplux1突变体生长停止过程，可以更全面地探究BpLUX1与光周期调控生长停止的关系。

对SD条件下培养的野生型和bplux1突变体进行转录组分析，结果表明：差异表达基因显著富集于植物激素信号转导通路（图4C）。ABA和GAs是目前研究最多的关于植物生长停止的激素通路。ABA和GAs拮抗调节植物芽休眠的诱导^［34］。在许多木本植物中，GA含量的动态变化与ABA含量呈负相关，在休眠诱导时降低^［35-36］。有研究^［37］表明，过表达GA代谢关键酶GA2ox会加速杂交杨树芽生长停止。有研究^［38-39］表明，GAs在SD条件下诱导杨树生长停止，与开花因子FT2协同作用，或独立起作用。本研究中，在SD条件下bplux1突变体中有部分差异表达基因在GA信号通路中表达上调，说明BpLUX1基因可能通过调控GA信号通路影响白桦生长停止。在杂交杨树的研究^［40］中，ABA关键信号基因ABI1的显性负等位基因abi1-1的在茎尖的表达，使ABA含量降低，导致胞间连丝无法正常关闭，茎尖分生组织无法隔绝生长促进信号，进而导致杂交杨树无法建立休眠。在牡丹（Paeonia×suffruticosa）芽中ABA表达水平下降，会促进芽生长起始^［41］；在杂交白杨茎尖分生组织中ELF3蛋白下游激素ABA上调促进其生长停止，ABA下调导致其无法生长停止^［2，42］。本研究中，在SD条件下bplux1突变体中大部分差异表达基因在ABA信号通路中表达下调，说明BpLUX1基因可能通过调控ABA信号通路使白桦延迟生长停止。在bplux1突变体中，ABA信号通路中差异表达基因表达下调，而GA信号通路中差异表达基因表达上调。这与模式植物特别是杂交杨树、拟南芥中ABA缺陷导致休眠建立失败，以及GA促进芽萌发等研究结果^{［2，43-48］}一致。这说明木本植物通过拮抗或协同调控激素信号来影响植物生长停止。然而，与模式植物拟南芥中LUX主要参与生物钟核心振荡器调控不同^［49］，白桦BpLUX1可能更侧重于整合激素信号网络介导生长停止。转录组分析仅揭示了BpLUX1基因可能通过激素信号通路影响白桦生长停止，激素通路中的关键差异表达基因与BpLUX1结合的具体功能与表型还需通过遗传学试验验证。未来，可以通过体内、体外互作试验验证BpLUX1与下游靶基因的调控关系，以全面解析BpLUX1基因调控白桦光周期响应的分子网络。

本研究虽然揭示了BpLUX1在白桦光周期响应中的功能，但表型统计分析主要是在人工控制的光周期条件下进行的。通过不同光周期处理发现，bplux1突变体有延迟生长停止表型。为了评估白桦跨纬度引种的适应性，未来研究还需要进一步在田间自然环境下观测bplux1突变体对环境信号的响应。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(32401540)

中国博士后科学基金第75批面上项目(2024M750382)