全缘叶绿绒蒿谷胱甘肽S-转移酶基因（MiGST）克隆与功能分析

Cloning and Functional Analysis of a Glutathione S-Transferase Gene (MiGST) from Meconopsis integrifolia

摘要

从全缘叶绿绒蒿（Meconopsis integrifolia）中克隆谷胱甘肽S-转移酶基因（MiGST），通过拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化鉴定生物学功能，旨在为全缘叶绿绒蒿不同部位类黄酮开发利用提供理论依据。本研究通过克隆MiGST基因，经生物信息学分析后采用实时荧光定量PCR分析组织表达特性；利用花序浸染法遗传转化拟南芥，采用硝酸铝比色法测定T₁代拟南芥转基因株系中总黄酮含量变化。结果表明：MiGST基因CDS全长702 bp，编码234个氨基酸，其编码蛋白相对分子质量约为25 861.91 Da，理论等电点为5.84；MiGST蛋白与罂粟（Papaver somniferum）中GST蛋白亲缘关系最近；MiGST基因具有组织表达特异性，其中花中表达量最高，茎中表达量最低；过表达MiGST基因拟南芥植株总黄酮含量为野生型的1.27倍。本研究证实，过表达MiGST基因可显著提高转基因拟南芥的总黄酮含量，表明MiGST基因在全缘叶绿绒蒿类黄酮跨膜转运及累积过程中具有重要作用。

Abstract

In the present study， the glutathione S-transferase gene（MiGST） from Meconopsisintegrifolia was cloned， and the biological function through Arabidopsisthaliana transformation was characterized. This study could provide the theoretical basis for flavonoid development and utilization in different tissues of M. integrifolia. The MiGST gene cloned was analyzed by using bioinformatics methods. Then， the tissue expression patterns were examined by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）. Subsequently， A. thaliana was transformed using the floral dip method， and the total flavonoid content in T₁ transgenic lines was determined by the Al（NO₃）₃ colorimetric assay. The results showed that the coding sequence（CDS） of MiGST was 702 bp in length， which encoded a 234-amino acid protein. The protein molecular weight was 25 861.91 Da with a theoretical isoelectric point of 5.84. Phylogenetic analysis showed that MiGST protein was the most closely related with GST protein from Papaver somniferum. Meanwhile， MiGST gene exhibited the tissue-specific expression， with the highest level in flowers and the lowest in stems. Besides， the total flavonoid content within A. thaliana overexpressing MiGST gene was a 1.27-fold of that of the wild-type one. In conclusion， this study confirmed that overexpression of MiGST gene significantly enhanced the total flavonoid content in transgenic A. thaliana， suggesting that MiGST gene played an important role in the transmembrane transport and accumulation of flavonoids in M. integrifolia.

Graphical abstract

关键词

全缘叶绿绒蒿 / 谷胱甘肽转移酶 / 总黄酮 / 组织表达模式

Key words

Meconopsis integrifolia / glutathione S-transferases / total flavonoids / tissue expression pattern

全缘叶绿绒蒿（Meconopsis integrifolia）是罂粟科（Papaveraceae）绿绒蒿属（Meconopsis）的1年生或多年生草本植物^［1-3］，主要分布于海拔2 700~5 100 m的高山草甸^［4-5］，与红花绿绒蒿（M. punicea）、五脉绿绒蒿（M. quintuplinervia）和白花绿绒蒿（M. argemonantha）同作为藏药“欧贝”（藏药名称）类绿绒蒿药材使用^{［1-2，6］}。作为传统濒危藏药植物^［5］，全缘叶绿绒蒿常以花或全草入药，具有清热解毒、消炎止痛等功效，可用于治疗肺炎、肝炎、水肿等病症^{［1-3，7］}，主要药用成分为类黄酮和生物碱^［8-10］。

类黄酮是植物中重要的次生代谢产物，不仅参与植物的生长发育与耐逆响应，而且对维持人类健康具有重要作用^［11-13］。类黄酮的生物合成始于苯丙烷代谢途径，受多种关键酶调控^［14］。目前，类黄酮生物合成途径及其关键功能基因已有较多报道^［3］，其中谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GST）是调控植物类黄酮累积的关键酶，具有调节次生代谢、解毒和防御等功能^［15-17］。作为活性产物储存与转运的中枢节点，GST可催化不稳定的类黄酮中间体与还原型谷胱甘肽（GSH）结合，生成稳定的、可转运的谷胱甘肽-类黄酮加合物^［18］。迄今为止，国内外学者已从山新杨（Populus davidiana×P. bolleana）^［19］、水稻（Oryza sativa）^［14］、茶树（Camellia sinensis）^［20］、蓝莓（Vaccinium corymbosum）^［21］、‘美人’梅（Prunus mume‘Meiren’）^［22］等物种中成功克隆到GST基因，较好地解析了序列特征、表达模式及功能作用，为理解植物类黄酮代谢通路的共性与个性提供了重要依据。然而，当前关于全缘叶绿绒蒿类黄酮的研究主要集中于化学成分测定^［23-26］、富集提纯工艺^［6，27］及药理活性研究^［28］等领域，而对类黄酮代谢通路及关键基因功能的研究相对较少^［29］，尤其关于类黄酮累积关键酶基因GST的克隆与功能研究尚属空白。据此，本研究基于全缘叶绿绒蒿花蕾期（S1）、开裂期（S2）和成熟期（S3）花瓣转录组数据，克隆获得MiGST基因，分析其编码蛋白的理化性质、保守结构域及系统进化关系；采用荧光定量PCR解析该基因在不同组织中的表达特性，通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）异源过表达探究生物学功能，旨在揭示MiGST基因在类黄酮转运与累积中的作用，为藏药资源的可持续利用与开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1　材料

全缘叶绿绒蒿于2024年9月采自青海省果洛藏族自治州玛多县（34°20'53.49″N、97°55'51.77″E，海拔4 459 m），冲洗干净后液氮速冻于冰箱中-80 ℃保存；遗传转化所用材料为哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0），保存于青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室；TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit提取试剂盒、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、pMD19-T载体、限制性内切酶KpnⅠ、限制性内切酶BamHⅠ和PrimeSTAR Max DNA Polymerase均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒小提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；pCAMBIA2300载体、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受态细胞购自博瑞德生物科技有限公司；芦丁购自成都康邦生物科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1　 MiGST基因扩增

使用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit提取全缘叶绿绒蒿花的RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser合成相应的cDNA；基于全缘叶绿绒蒿花部的转录组数据筛选MiGST基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物MiGST-F（5'-ATGGCAGGATCGGGAAGTGA-3'）和MiGST-R（5'-TTA GTTTGAAGGAGGAGGTTTAGAT-3'）。以全缘叶绿绒蒿花部的cDNA为模板，运用TaKaRa高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示。反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s、57 ℃退火15 s、72 ℃延伸15 s，运行38个循环；72 ℃终延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化，将2 µL基因胶回收产物与pMD19-T载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；随机挑取单克隆菌落进行PCR验证，阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.2　生物信息学分析

采用SMART工具（http：//smart.embl.de/）预测MiGST基因编码蛋白的保守结构域；通过NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源蛋白序列，利用DNAMAN软件比对氨基酸序列；运用MEGA 12.0软件，采用邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树，Bootstrap值设置为1 000；借助SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在线平台分别预测蛋白的二级与三级结构；利用ExPASy ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析MiGST蛋白的理化特性（如相对分子质量、等电点、分子式等），并经ProtScale（https：//www.expasy.org/resources/protscale）评估其亲疏水性；使用TMHMM服务器（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测蛋白的跨膜结构域；借助SignalP 4.1Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）分析信号肽序列；采用NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在线工具分别分析糖基化与磷酸化位点。

1.2.3　 MiGST基因表达模式分析

提取全缘叶绿绒蒿根、茎、叶和花的RNA（n=3）进行反转录，分别以cDNA为模板，采用GAPDH-F/R作为内参基因（MiGAPDH-F：5'-ACATCATTCC CAGCAGCAC-3'；MiGAPDH-R：5'-TTGCCTTCTTC TCAAGTCTCAC-3'），检测MiGST基因（MiGST-F：5'-ATGGCAGGATCGGGAAGTG-3'；MiGST-R：5'- TTAGTTTGAAGGAGGAGGTTTAGAT-3'）的相对表达量。反应体系为10 μL TB Green Premix Ex Taq、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、0.4 μL正/反引物、2 μL模板cDNA、6.8 μL灭菌水；反应程序为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、58 ℃退火34 s、运行40个循环，每个样品设置3次重复；采用相对定量2^-ΔΔCT方法计算结果。

1.2.4　过表达载体构建及遗传转化

利用SnapGene 8.0软件设计含有BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点的引物（表2），以测序正确的克隆菌液为模板进行PCR扩增；将扩增片段与经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切线性化的pCAMBIA2300质粒通过同源重组法进行连接，构建重组质粒。随后，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR鉴定；经测序正确后获得植物过表达载体pCAMBIA2300-MiGST，将该过表达载体转化至根癌农杆菌GV3101感受态细胞后，采用浸花法侵染拟南芥花序，并通过卡那霉素抗性筛选并结合PCR检测与鉴定，获得阳性转基因拟南芥植株。

1.2.5　转基因拟南芥总黄酮含量测定

剪取正常生长条件（22 ℃，16 h光照/8 h黑暗）下转基因型和野生型拟南芥的根、茎和叶（n=3），经液氮研磨成粉末；以芦丁为标准品，用70%乙醇配制系列标准溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g·L^-1），采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法^［5］测定总黄酮含量，于510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，同法测定样品吸光度，依据标准曲线计算总黄酮含量，每个样品重复测定3次。

1.2.6　数据处理

采用Excel 2021软件进行数据整理，所有试验数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 10.6软件进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验（Student’s t-test），多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1　 MiGST 基因克隆与编码蛋白理化性质分析

以全缘叶绿绒蒿花部cDNA为模板，利用特异性引物MiGST-F/R经PCR扩增获得长度为702 bp的片段（图1），测序结果显示，该片段编码234个氨基酸。基于此，对其编码蛋白理化性质进行了预测分析。MiGST蛋白分子式为C₁₁₈₃H₁₈₂₈N₂₈₈O₃₃₉S₁₁，预测相对分子质量为25 861.91 Da，理论等电点为5.84；蛋白不稳定系数为32.42，表明MiGST为稳定的亲水性蛋白，脂肪系数为80.00（表3）；跨膜域预测结果显示，MiGST蛋白具有明显的跨膜结构，属于跨膜蛋白；MiGST蛋白N端含有2个完整的GST结构域，无信号肽，为非分泌蛋白；对蛋白二级结构预测发现，α-螺旋、不规则卷曲和延伸链占比分别为51.07%、37.77%和11.16%（图2）；MiGST蛋白不含糖基化位点，含有19个丝氨酸（S）、8个苏氨酸（T）和8个酪氨酸（Y）。

2.2　 MiGST蛋白多序列比对与进化分析

从NCBI下载GST同源蛋白序列，并与MiGST蛋白进行BLAST比对。结果表明，全缘叶绿绒蒿中GST蛋白的氨基酸序列与罂粟（Papaver somniferum）的氨基酸序列相似性最高，达95.28%；其次为蔷薇科（Rosaceae）的欧洲甜樱桃（Prunus avium）和梅（Prunus mume）等；与山茱萸科（Cornaceae）的大花四照花（Cornus florida）及杜鹃（Rhododendron simsii）等的相似性较低（图3）。MiGST蛋白N端包含影响催化功能且较为保守的GSH结合位点（G-site），C端包含与特定底物结合、高度可变的共底物结合域（H-site），该结构被认为有助于不同GST蛋白结合不同的催化底物。此外，本研究采用MEGA 12.0构建了全缘叶绿绒蒿MiGST与其他植物同源蛋白的系统进化树，结果显示：MiGST蛋白与罂粟PsGST聚为一支，表明两者亲缘关系较近（图4）。

2.3　 MiGST 基因表达模式分析

全缘叶绿绒蒿不同组织GST基因表达分析结果显示，MiGST基因在根、茎、叶和花中均有表达，其中茎中表达量最低，因此以茎为校准组，花中表达量最高，根和叶中表达量介于两者之间，表明MiGST基因具有组织表达特异性（图5A）。同时，全缘叶绿绒蒿不同组织总黄酮含量测定结果表明，花中总黄酮含量最高（图5B）。

2.4　转基因拟南芥总黄酮含量分析

RT-qPCR结果表明，转基因拟南芥中MiGST基因的相对表达量为野生型的13.57倍（图6），表明MiGST基因在转基因拟南芥中成功实现过表达。以芦丁质量浓度为X轴、吸光度为Y轴绘制芦丁标准曲线（图7A），计算转MiGST基因拟南芥的总黄酮含量。结果表明，转MiGST基因拟南芥的总黄酮质量分数为2.53 mg·g^-1，是野生型的1.27倍（图7B），且差异显著（P<0.05），说明过表达MiGST基因可显著提高拟南芥的总黄酮含量。

3 讨论

谷胱甘肽转移酶是一类保守的多功能酶家族，广泛参与植物次生代谢过程，调控植物对环境胁迫的响应^［15-17］。先前研究^［30］表明，植物中GSTs可根据底物特异性、一级结构、免疫学特性及序列相关性等划分为多个亚家族，主要包括phi（F）、theta（T）、tau（U）、zeta（Z）、lambda（L）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和四氯氢醌脱卤酶（TCHQD）。GST可将植物中的类黄酮转运至液泡膜，随后由液泡膜上的ABCC、MATE或BTL膜转运蛋白将其转移至液泡腔中储存^［18］。本研究从全缘叶绿绒蒿中成功克隆获得一个CDS全长为702 bp的MiGST基因，编码234个氨基酸，与先前报道的GST蛋白^［19-24］具有较高的同源性，表明植物GST家族在进化过程中高度保守；系统进化分析显示，MiGST蛋白与罂粟科罂粟的同源蛋白亲缘关系较近，进一步支持GST基因家族在近缘物种中的保守性，可用于近缘科属的界定分析。ProtParam分析预测MiGST蛋白为稳定的亲水蛋白，与黄颖等^［19］对山新杨的研究结果相似。

为了阐明全缘叶绿绒蒿中MiGST基因的表达模式，本研究采用RT-qPCR技术分析了根、茎、叶和花中MiGST的表达量。结果显示，花中表达量最高，其次为根和叶，茎中表达量最低；同时，全缘叶绿绒蒿不同组织中总黄酮含量的测定表明，花中总黄酮含量最高，茎中最低，说明全缘叶绿绒蒿中总黄酮含量与MiGST基因表达量密切相关，揭示花部应为全缘叶绿绒蒿的主要药用部位，这与先前学者^［5-6］的研究结论一致。张永艳等^［21］发现蓝莓中过表达VcGSTFs基因可促进类黄酮的合成与转运；尹雨钦等^［31］通过沉默不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）中BcGSTF6基因，发现叶片中花青素含量显著降低；Dixon等^［32］发现胁迫诱导条件下小麦（Triticum aestivum）中GSTL1基因参与黄酮醇调节；周麟等^［33］克隆获得MiUGT79B1和MpUGT79B1基因，发现其通过糖基化修饰增强类黄酮稳定性，表达量与总黄酮含量呈正相关。本研究通过异源过表达全缘叶绿绒蒿MiGST基因，显著提高了转基因拟南芥的总黄酮含量，表明MiGST基因过表达可促进类黄酮化合物的跨膜转运，进而增强其在细胞内的有效累积。因此，本研究认为全缘叶绿绒蒿中类黄酮的合成与积累是一个涉及合成、转运及区域化储存的多级调控、多机制协同的复杂网络过程。

4 结论

本研究从全缘叶绿绒蒿中克隆获得一个类黄酮合成相关基因MiGST，MiGST蛋白与罂粟的GST蛋白亲缘关系较近；MiGST基因具有组织表达特异性，在花中表达量最高；全缘叶绿绒蒿花中总黄酮含量亦最高；过表达MiGST基因可显著提高转基因拟南芥中的总黄酮含量，且总黄酮含量与MiGST基因表达量呈正相关，表明MiGST基因在全缘叶绿绒蒿类黄酮化合物的转运与累积中发挥重要作用。

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基金资助

青海省中央引导地方科技发展资金计划项目(2025ZY005)