楸树NAC基因家族鉴定及低温胁迫响应关键基因筛选

Identification of NAC Gene Family and Screening of Cold Stress-Responsive Genes in Catalpa bungei

摘要

NAC转录因子（NAM，ATAF，and CUC transcription factors）是植物特有的转录调控因子，广泛参与植物的生长发育及非生物胁迫响应过程。为系统解析楸树（Catalpa bungei）NAC基因家族的分子演化特征及其在低温胁迫下的分子调控机制，本研究基于楸树全基因组测序数据，系统鉴定了楸树NAC基因家族成员，并深度剖析了其理化性质、系统发育拓扑结构、基因结构保守性、启动子顺式作用元件分布特征、低温响应的基因表达模式并进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。结果表明：楸树基因组中共鉴定出65个CbuNAC基因，依据系统发育演化关系可将其划分为4个高度保守的亚家族。染色体定位显示，这些成员非均匀地锚定在16条染色体上，呈现出显著的簇状分布模式。基因结构与保守基序分析表明，同一亚家族成员在内含子/外显子排布及蛋白质Motif组成上表现出高度一致性，这不仅印证了系统发育分类的可靠性，更反映出亚家族内部潜在的功能冗余与进化分化特征。共线性分析证实，片段复制事件是楸树NAC基因家族规模扩张与演化分化的主导力量，而非串联复制。低温胁迫时间序列转录组分析揭示，CbuNAC15、CbuNAC30与CbuNAC36基因在低温胁迫下表达呈显著上调，展现出强烈的且具有时序差异的低温响应特异性。结合WGCNA进一步证实，这3个核心基因不仅协同调控经典的ICE1-CBF抗寒信号通路，还与渗透调节及激素代谢下游效应基因紧密联动。本研究探究了楸树NAC基因家族的基因组学特征，精准锚定了3个极具育种价值的抗寒关键基因，为深入挖掘林木非生物逆境适应性机制及开展分子标记辅助育种提供了坚实的理论支撑与靶标资源。

Abstract

NAC（NAM， ATAF， and CUC） transcription factors are plant-specific transcriptional regulators that play crucial roles in plant growth， development， and responses to abiotic stresses. To systematically characterize the molecular evolutionary features of the NAC gene family in Catalpa bungei and elucidate its regulatory mechanisms under cold stress， NAC gene family members were comprehensively identified based on the whole-genome sequence of C. bungei. Comprehensive analyses were performed， including physicochemical properties， phylogenetic topology， gene structure conservation， cis-acting elements in promoter regions， cold-responsive expression patterns， and weighted gene co-expression network analysis（WGCNA）. The results demonstrated that a total of 65 CbuNAC genes were identified in the C. bungei genome and classified into four highly conserved subfamilies based on phylogenetic analysis. Chromosomal mapping revealed that these genes were unevenly distributed across 16 chromosomes， displaying a distinct clustered distribution pattern. Gene structure and conserved motif analyses indicated that members within the same subfamily exhibited highly similar intron-exon organization and conserved motif composition，which not only supported the reliability of the phylogenetic classification but also implied potential functional redundancy and evolutionary divergence within subfamilies. Collinearity analysis indicated that segmental duplication， rather than tandem duplication， was the predominant driving force for the expansion and evolutionary divergence of the CbuNAC gene family. Time-series transcriptome analysis under cold stress revealed that CbuNAC15， CbuNAC30， and CbuNAC36 were significantly upregulated， exhibiting strong and temporally dynamic responses to low-temperature stress. Furthermore， WGCNA revealed that the three core genes not only coordinately regulated the classical ICE1-CBF cold-signaling pathway but were also closely associated with downstream genes involved in osmotic adjustment and hormone metabolism. In summary， this study systematically characterized the genomic features of the NAC gene family in C. bungei and identified three key candidate genes associated with cold-tolerance， thereby providing valuable theoretical insights and candidate targets for elucidating abiotic stress adaptation mechanisms in woody plants and advancing marker-assisted breeding.

Graphical abstract

关键词

楸树 / NAC基因家族 / 低温胁迫 / 表达模式 / 基因鉴定

Key words

Catalpa bungei / NAC gene family / low-temperature stress / expression pattern / gene identification

楸树（Catalpa bungei）属紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa），为典型落叶乔木，树干通直挺拔、木材材质坚韧优良，在用材林培育、园林绿化及生态修复领域均具有极高的经济与生态价值^［1］。楸树原产于中国，生态适应性呈现明显的气候依赖性，其天然分布区高度集中于气候相对温和的华北、华中及华东地区（年平均气温需维持在10~15 ℃），对低温胁迫的生理敏感性已成为限制楸树向高纬度及干冷地区引种扩繁的核心瓶颈^［2-3］。因此，从基因组层面深度挖掘并解析楸树的抗寒关键基因，不仅是阐明木本植物逆境适应机制的重大科学前沿问题，更是突破楸树适生区限制、实现林木精准遗传改良的重要途径。

在植物应对复杂多变环境的庞大分子网络中，转录因子（transcription factors）是介导遗传信息传递与功能执行的核心调控因子，通过特异性识别并结合靶基因启动子区域的顺式调控元件，精准激活或抑制靶基因转录，进而调控植物生长发育、代谢调控及逆境适应等一系列生命活动。NAC（NAM-ATAF-CUC）基因家族作为植物界规模最大且特有的转录因子家族之一，在介导非生物胁迫信号转导中发挥着不可替代的作用^［4］。NAC蛋白的分子结构呈现出典型的“保守-可变”二元异质性特征：其N端包含一个由大约150个氨基酸组成的高度保守结构域（可细分为A至E共5个亚区），负责特异性结合下游靶标基因启动子区域的顺式调控元件并介导蛋白二聚化；而其C端则为高度可变的转录调控区，这种结构上的高度多样性赋予了NAC成员在激活或抑制不同下游抗逆通路时的功能特异性^［5-6］。

NAC基因家族成员在植物低温胁迫响应中的生物学功能已被广泛报道。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtNAC056基因可激活CBF信号通路相关基因的表达，显著增强植株对低温胁迫的耐受性^［7］。在大豆（Glycine max）中，GmNAC20基因被报道具备抗冻功能，在植株的低温逆境适应中发挥着关键调控作用^［8-11］。在水稻（Oryza sativa）中，OsNAC5可与OsbZIP79（碱性亮氨酸拉链转录因子）形成蛋白复合物，在MOC1（调控因子）的促进下共同调节OsDREB1G（脱水响应元件结合蛋白）的转录水平，从而提升水稻的抗寒能力^［12］。在茶树（Camellia sinensis）中，鉴定出的CsNAC79和CsNAC9基因能够被低温等多种非生物胁迫显著诱导并上调表达，参与植物的早期逆境信号响应^［13］。在狗枣猕猴桃（Actinidia kolomikta）中，低温响应基因AkNAC2能够直接结合并上调CBF通路关键基因的表达水平，通过降低细胞氧化胁迫损伤来正向调控抗寒性^［14］。此外，NAC转录因子在木本植物维持细胞内环境稳态方面表现出多重保护功能。例如，在常绿阔叶乔木黑壳楠（Lindera megaphylla）中，过表达LmNAC19能够显著提高植株在低温胁迫下的存活率，其机制在于减轻光系统损伤和降低丙二醛（MDA）的积累，同时促进脯氨酸和可溶性蛋白的大量合成，并增强过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性^［15］。同样，在水曲柳（Fraxinus mandshurica）中，FmNAC5和FmNAC36的过表达显著抑制了低温引起的相对电导率上升，提高抗氧化酶活性，并维持下游靶抗逆基因的高水平表达，从而大幅增强植株的耐低温能力^［16］。这些研究表明，NAC转录因子能够通过直接激活ICE1-CBF-COR级联通路、诱导渗透调节物质的高效合成，以及重塑活性氧（ROS）清除系统的稳态，构建起一道复杂而坚固的抗寒防御体系。

楸树作为我国极具经济与生态价值的优良乡土阔叶树种，NAC转录因子在其响应低温逆境过程中的调控机制尚未被完全阐明。目前，楸树的全基因组测序工作已经完成，为在全基因组水平上筛选和鉴定楸树NAC基因家族成员提供了坚实的数据支持。鉴于低温胁迫是限制楸树向高纬度及干冷地区引种扩繁的关键限制因素，解析楸树NAC家族成员，并探究它们在低温胁迫下的表达模式，对于从转录调控层面理解楸树的抗寒防御网络至关重要。因此，本研究对楸树NAC基因家族成员进行系统鉴定，并对其蛋白质理化性质、系统发育、染色体定位、基因结构和启动子顺式作用元件进行了深度剖析，并结合时间序列转录组数据与加权基因共表达网络分析（WGCNA）着重探究其在低温胁迫过程中的表达特性及共表达调控关系，旨在为揭示NAC转录因子调控楸树冷适应的分子机制提供参考。

1 研究方法

1.1　楸树NAC基因家族的鉴定

以TAIR数据库中拟南芥NAC蛋白序列为参考，利用TBtools-Ⅱ（v2.400）对楸树全基因组蛋白进行BlastP同源比对（e-value≤1×10^-5）。其次，基于NAC核心结构域（PF02365）的HMM模型对全基因组进行扫描检索。提取上述2种方法获取的交集序列，并将其导入InterPro数据库（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）进行结构域验证。在剔除缺失的完整NAC domain序列后，最终确立了准确的楸树NAC基因家族成员。

1.2　楸树NAC基因家族系统发育树的构建

基于获取的楸树NAC蛋白氨基酸序列，利用TBtools-Ⅱ 2.4的“One Step Build a ML Tree”模块（内置Muscle多序列比对、trimAl序列修剪及IQ-TREE建树工具）构建最大似然（maximum likelihood，ML）系统发育树。建树参数设定：采用UltraFast Bootstrap方法，自展重复次数设为5 000，其余保持默认设置。将生成的Newick格式进化树文件导入iTOL在线平台（https：//itol.embl.de/）进行拓扑结构可视化（树布局设为Cladogram），并利用Adobe Illustrator软件进行后期排版与美化。

1.3　楸树NAC基因家族蛋白理化性质

提取楸树NAC基因家族各成员的氨基酸序列，借助ExPASy在线服务器的ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）对其理化性质进行系统预测。分析的理化参数主要涵盖：编码区序列长度、氨基酸残基数、蛋白质相对分子质量（molecular weight，Mw）以及理论等电点（theoretical isoelectric point，pI）等。

1.4　楸树NAC基因家族的保守结构域及基因结构分析

利用MEME在线程序（https：//meme-suite.org/meme/）预测楸树NAC蛋白的保守基序（Motifs），并结合Pfam数据库（https：//pfam.xfam.org/）获取的NAC核心结构域（PF02365）注释信息及全基因组GFF3注释文件中的基因结构数据。依托TBtools-Ⅱ的“Gene Structure View（Advanced）”模块，将上述数据与ML系统发育树（展示Bootstrap检验值，Cladogram布局）进行关联整合。同步呈现保守基序分布、NAC结构域定位及基因外显子/内含子结构（UTR，CDS）特征，最后经Adobe Illustrator软件处理完成多维度特征的可视化。

1.5　楸树NAC基因家族的顺式作用元件预测与可视化

提取楸树NAC基因起始密码子上游的启动子序列，提交至PlantCARE在线数据库（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测。借助TBtools-Ⅱ的“Simple PlantCARE Classify”功能对预测结果进行冗余过滤与功能分类注释。随后，提取基因与顺式作用元件的关联频率数据，利用TBtools-Ⅱ的“HeatMap Illustrator”模块绘制分布热图，并与基因系统发育树及元件功能分组进行联合呈现，以解析顺式作用元件分布与系统演化关系的协同特征。

1.6　楸树NAC基因家族染色体定位

基于楸树全基因组注释文件，利用TBtools-Ⅱ的“Gene Location Visualize from GTF/GFF”模块对NAC基因在各条染色体上的物理位置进行提取与可视化。同时，结合“Gene Density Profile”功能计算染色体的基因密度分布。综合上述结果，分析CbuNAC基因在染色体上的空间分布特征及潜在的基因簇（gene cluster）现象，并对生成的定位图谱进行排版美化。

1.7　楸树NAC基因家族种内及种间共线性分析

下载毛果杨（Populus trichocarpa）与拟南芥的全基因组序列及GFF3注释文件，依托TBtools-Ⅱ的“One Step MC ScanX-SuperFast”模块开展共线性分析。在种内分析中，利用“GXF Gene Position & Info. Extract”和“Table Row Manipulate”工具提取楸树染色体长度及NAC基因位置信息，并通过“Advanced Circos”模块绘制楸树染色体水平的NAC基因共线性图谱。在种间分析中，采用“Text Merge for MCScanX”工具合并物种间的基因关联与注释文件，结合“Multiple Synteny Plot”模块高亮显示楸树与毛果杨、拟南芥间的NAC基因同源共线性关系，最终构建种内与种间的共线性图谱。

1.8　楸树NAC基因在低温胁迫下的表达模式分析方法

选取长势健壮且高度一致的楸树组培苗为试验材料，于人工气候室进行标准化培养（温度（25±2） ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗）。挑选发育一致（具4~6片完全展开叶，株高约15 cm）的植株转入4 ℃人工气候箱中进行低温胁迫处理。分别于处理后0（常温对照）、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h采集叶片样品，每个时间点设置3个生物学重复。经RNA-seq高通量测序计算各NAC基因的FPKM值。为降低数据偏态和稳定方差，对FPKM值进行Log₂（FPKM+1）归一化处理。随后利用TBtools-II的“Heatmap Plot”模块绘制表达量热图并进行层级聚类分析图谱。

1.9　楸树低温胁迫下NAC基因共表达网络构建与可视化

基于低温胁迫转录组基因表达矩阵，剔除低表达基因（在90%以上样本中表达量<1）并通过绝对中位差（MAD）法筛选出Top 5 000的高变异基因进行数据预处理。利用TBtools-Ⅱ的WGCNA插件，以无尺度拓扑拟合指数R²≥0.8为标准筛选最优软阈值，构建基因共表达模块。通过模块-性状关联分析鉴定与低温响应高度相关的核心模块，并基于模块内连通度（kME）和基因显著性（GS）筛选核心Hub基因。重点聚焦前期筛选出的关键抗寒候选基因（CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36），提取其在共表达网络中的关联基因对。最终将分析结果导入Cytoscape软件进行网络拓扑结构的可视化优化。

2 结果与分析

2.1　楸树NAC基因家族成员全基因组鉴定及蛋白理化性质分析

基于楸树全基因组数据，本研究共鉴定出65个包含保守NAC结构域的基因家族成员，依据其染色体位置分别命名为CbuNAC01到CbuNAC65（附表1，见本刊官网补充材料。下同）。蛋白理化性质分析（图1）表明，65个CbuNAC蛋白的氨基酸残基数介于163~589，且72.3%的成员相对分子质量集中于25~45 kDa，符合核转运蛋白的基础构象特征。理论等电点（pI）介于4.64~9.74，呈现出酸碱性蛋白均衡分布的电荷异质性。不稳定系数评估显示，78.5%的成员不稳定系数大于40（介于26.47~64.89），表现为不稳定蛋白。此外，所有成员的总平均亲水性（GRAVY）均小于0，脂肪族指数适中（48.40~76.61），证实该家族成员均为亲水性蛋白。这些理化参数的显著跨度，直观反映了楸树NAC家族在长期演化中形成了高度的蛋白质结构多样性。

2.2　楸树NAC基因家族系统发育分析

为阐明楸树NAC基因家族的系统演化与分化特征，本研究基于65个CbuNAC蛋白的氨基酸序列构建了最大似然（ML）系统发育树（图2）。拓扑结构显示，楸树NAC家族成员可清晰聚类为4个独立的进化亚家族（Group 1~Group 4），且多数关键分支的自展值（Bootstrap value）大于70%，部分核心节点高达100%，充分证实了该分组模式的统计学可靠性。从成员分布来看，Group 1和Group 4规模最大，各包含21个成员；Group 3包含14个成员；Group 2规模最小，仅含9个成员。进一步分析发现，各亚家族在演化模式上表现出显著的异质性：Group 1和Group 4内部的亚支分化复杂，尤其是Group 4的分支长度差异显著，表现出明显的进化速率异质性；Group 2聚类最为紧凑且节点支持率极高，表现出极强的演化保守性；而Group 3则处于系统发育树的相对居中位置。整体而言，楸树NAC基因家族的4个主要分支展现出明确的系统分异特征，这不仅反映了该家族在进化过程中的扩张与功能分化，也为后续靶向解析不同亚家族的特定生物学功能提供了坚实的分子分类学依据。

2.3　楸树NAC基因家族的基序预测与基因结构分析

系统发育与结构特征联合分析表明，楸树NAC基因家族65个成员的演化分支与结构特征存在高度协同性（图3A）。基序分析结果（图3B）显示，同一进化分支内成员的基序组成与排列模式高度一致。其中，Motif 1~6和Motif 9广泛分布于绝大多数成员中，且位置极度保守；结合Pfam结构域注释（图3C）证实，这些核心基序共同构成了该家族保守的N端DNA结合结构域（NAC domain）。相比之下，少数成员（如CbuNAC40、CbuNAC11和CbuNAC43等）在C端呈现出特异的基序组合与结构重排，表现出局部的结构分化特征。基因结构分析（图3D）进一步显示，大多数CbuNAC基因具备保守的外显子-内含子排布模式，其典型特征为包含3个外显子与2个内含子。同时，部分基因发生了内含子丢失或获得事件：少数成员完全缺失内含子，而个别基因（如CbuNAC47）的外显子数目则显著扩张，最高达7个。这种在整体保守框架下的局部变异，构成了该家族结构多样性的分子基础。

2.4　楸树NAC基因家族启动子顺势作用元件分析

在楸树65个CbuNAC基因的启动子区域中共鉴定出1 223个顺式作用元件（图4）。根据功能注释，这些元件可划分为4大类：环境响应类（552个）、激素信号响应类（490个）、转录因子结合位点（147个）与组织发育相关类（34个）。具体而言，环境响应类元件主要包括光响应基序（如AE-box、ATC、GATA等）和低温响应元件（LTR）；激素响应类涵盖脱落酸响应（ABRE）、生长素响应及水杨酸响应等元件；转录因子结合位点主要包含MYB结合位点；组织发育类则涉及与胚乳发育及分生组织表达相关的元件。元件分布特征（图4）显示，多数CbuNAC启动子中环境响应类元件占比最高，激素响应类次之。其中，环境响应相关的G-box、脱落酸响应相关的ABRE及低温响应相关的LTR元件分布较为集中。针对特定元件的定量分析表明，CbuNAC15、CbuNAC30、CbuNAC36、CbuNAC45和CbuNAC56共5个基因的启动子区均包含6个LTR低温响应元件。此外，CbuNAC15和CbuNAC36的启动子区分别含有13个和11个ABRE元件，为该家族中ABRE数量最高的2个成员，呈现出LTR与ABRE元件双重高富集的特征。这一特征直接将上述成员定位于环境与激素信号交汇响应的核心节点，反映出该家族在调控网络中的重要地位。

2.5　楸树NAC基因家族染色体定位分析

染色体定位结果（图5）表明，楸树65个CbuNAC基因在基因组中呈现出显著的非均匀分布特征。具体而言，除CbuNAC56~CbuNAC65共10个成员定位于未锚定的Scaffolds外，其余55个基因不规则地散布于各染色体（连锁群）中。其中，第2组富集的CbuNAC基因最多，达9个（CbuNAC09~CbuNAC17）；而第4、第9、第12、第15和第18组均仅分布1个基因。这种密度的极端差异，直观反映了该基因家族在染色体水平上存在明显的区域性聚集现象。进一步的基因组内复制事件筛查鉴定出，该家族中共发生6次串联复制事件。这6对串联复制基因（CbuNAC04/CbuNAC05、CbuNAC06/CbuNAC07、CbuNAC14/CbuNAC15、CbuNAC22/CbuNAC23、CbuNAC31/CbuNAC32及CbuNAC62/CbuNAC63）均紧密连锁于对应的染色体或Scaffolds上。这一结构特征表明，串联复制事件导致了少数CbuNAC基因的物理成簇分布，表现为该家族局部的小规模扩张特征。

2.6　楸树NAC基因家族种内共线性分析

种内共线性分析结果（图6）表明，片段重复是驱动楸树NAC基因家族规模扩张的核心机制。在鉴定的65个CbuNAC成员中，共检测到31个发生共线性的重复基因，对应18对家族内部片段重复事件。进一步分析重复模式发现，该家族存在明显的跨染色体/支架的扩散特征：CbuNAC04、CbuNAC24与CbuNAC59构成一组具有高度序列相似性的重复片段，分别定位于0号染色体、3号染色体及Scaffold198；类似的跨区域复制现象亦见于CbuNAC08/37/65及CbuNAC02/51/28等多基因重复组。这种跨基因组区域的重复分布模式，反映了非同源重组或转座驱动的基因组异地复制特征，证实了片段重复是楸树NAC基因家族实现遗传物质倍增与功能演化的主要途径。

2.7　楸树NAC基因家族种间共线性分析

为解析楸树NAC基因家族的跨物种演化特征，本研究构建了楸树与木本模式植物毛果杨、草本模式植物拟南芥的种间共线性图谱（图7）。全基因组层面的共线性分析显示，楸树与毛果杨的共线性同源基因对达27 660对，而与拟南芥的共线性同源基因对为15 799对。在NAC基因家族层面，楸树与毛果杨共鉴定出144对共线性同源基因，与拟南芥仅存在68对。数据对比证实，无论是全基因组水平还是特定基因家族层面，楸树与木本物种毛果杨的共线性同源基因对数量均显著多于草本物种拟南芥。这一结果直观反映出楸树与同为木本植物的毛果杨之间具有更高的基因组共线性水平与演化保守性。

2.8　楸树NAC基因家族低温胁迫下的表达模式分析

基于转录组测序数据，本研究系统分析了65个CbuNAC基因在不同时长低温胁迫（4 ℃）处理下的表达动态。表达量热图与层级聚类结果（图8）表明，65个成员的低温响应模式可明确划分为3大类：32个成员在各胁迫时间点的表达量均无显著波动，表现为低温不敏感特征；5个成员在胁迫过程中表达量呈现显著下调；其余28个成员的表达量随胁迫时间的延长呈现显著上调趋势。数据对比表明，CbuNAC基因家族在响应低温胁迫时以上调表达模式为主。在上调表达的成员中，CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36的响应最为剧烈，且在时间维度上呈现出显著差异化的动态表达特征。具体而言，CbuNAC15表现为“延迟激活-持续上调”模式：其转录水平在胁迫初期（0~6 h）无显著变化，6 h后显著升高，于24~48 h维持在表达平台期，随后再次上调并于72 h达到最高峰。CbuNAC30呈现“短期延迟-快速达峰”特征：胁迫前3 h表达量无显著波动，3 h后急剧上调，并于48 h达到表达最大值。CbuNAC36则表现为“稳步累积-后期激增”模式：在胁迫前12 h内表达量呈缓慢上升趋势，12 h后转录水平显著跃升，最终于72 h达到表达峰值。上述动态表达数据证实，CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36具有强烈的时序特异性响应特征，为该家族响应低温胁迫的核心靶点基因。

2.9　楸树NAC基因家族共表达网络分析

为解析楸树CbuNAC在低温胁迫下的共表达调控关系，本研究以CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36为核心构建了加权基因共表达网络。分析共识别出70个共表达模块，其中24个模块与上述靶基因呈现高相关性。模块-基因相关性分析（图9D）显示，多数模块与这3个靶基因呈正相关。具体而言，MEwhite模块与CbuNAC15的正相关性最高，MEdarkolivegreen模块与CbuNAC30的正相关性最高，而MEorange模块与CbuNAC36的正相关性最高。对上述高相关性模块内的基因进行功能注释与富集分析（图9E、9F、9G），鉴定出大量参与关键生物学过程的共表达基因。这些基因主要包括：响应非生物胁迫的转录因子（如ERF053、HAT22、WRKY19），参与胁迫保护与蛋白稳态的基因（如PYL8、LEA5、ATJ8），以及参与代谢与激素合成的关键酶基因（如ACO2、FBA、NCED1等）。以CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36为中心的共表达网络（图9H、9I、9J）显示，这3个核心基因与大量已知的低温胁迫响应基因在拓扑结构上存在紧密的连通互作关系。该共表达网络中富集的关键互作基因（Hub genes）包括HAT22、TPS11、ACA1、ERD10、PYL8、MED37C、LEA5、ABCF1、GTE9、PAO2、PCAS-2、CbuC3H32、CbuNAC05及HSF30等。这一网络拓扑特征，直观展现了CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36与众多抗逆下游效应基因及代谢酶基因在转录水平上的高度协同共表达模式。

3 讨论

3.1　楸树NAC基因家族进化保守性与特异性

NAC基因家族是植物界规模最大且特有的转录因子家族之一，在调控植物生长发育及逆境适应中发挥着不可替代的作用。本研究在楸树基因组中共鉴定出65个CbuNAC基因家族成员。与其他植物相比，NAC基因的数量在不同物种间存在显著的种间差异：楸树NAC家族的规模大于牡丹（Paeonia suffruticosa，48个）、大豆（G. max，54个）和黑麦草（Lolium perenne，72个），但远少于拟南芥（A. thaliana，117个）、水稻（O. sativa，151个）及同为林木的毛白杨（Populus tomentosa，270个）^［17-22］。这种家族成员数量上的显著分化，不仅与物种基因组大小和倍性相关，更深刻反映了该家族在不同植物谱系中经历了独立且特异的基因组演化轨迹。在蛋白质结构演化×方面，所有CbuNAC蛋白均包含典型的NAC核心结构域，证实了该家族在基础拓扑结构上的高度保守性。然而，基序（Motif）分析显示，同一亚家族内的成员结构特征高度一致，而亚家族间的差异主要源于特定保守基序的缺失或重排。例如，CbuNAC22与CbuNAC23缺失了构成N端DNA结合区的Motif 2、3和9，CbuNAC56与CbuNAC58则丢失了Motif 2和9。这种关键基序的自然丢失，表明部分成员在长期进化压力下发生了结构域的退化或演化分化。

3.2　顺式作用元件对 CbuNAC 关键基因低温表达模式的调控

基因转录表达的时序动态是其启动子顺式作用元件与上游信号网络互作的直观体现。本研究中，3个低温响应核心基因（CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36）启动子区均富集了6个LTR低温响应元件，这为其受冷胁迫特异性激活奠定了坚实的结构基础。然而，转录组时序数据揭示这3个基因在冷胁迫下呈现出显著的表达时间分化，这种时序特异性与其启动子上其他元件的差异化组合密切相关。顺式元件预测表明，CbuNAC15和CbuNAC36含有该家族丰度最高的脱落酸（ABA）响应元件（ABRE，分别为13和11个）。在植物逆境生理中，内源ABA的大量生物合成与信号累积通常存在一定的时间滞后性^［23-24］。这与二者在胁迫中后期持续上调直至72 h达到峰值的“迟发-持续型”转录动态高度契合，暗示CbuNAC15和CbuNAC36基因可能主要受ABA依赖型信号通路驱动，通过调控中长期的生理稳态参与楸树深度冷适应机制的建立。相比之下，CbuNAC30则表现为短期延迟后的快速响应（于胁迫48 h达峰）。这种更为敏锐的早中期表达特征，表明其更主要受ABA非依赖型通路（如由LTR直接介导的早期冷信号互作）的激活，在早期冷胁迫信号的级联传导中发挥关键的激活作用。此外，这些核心基因普遍含有MYB类转录因子结合位点及光响应元件（如G-box），表明其具备整合秋季短日照（光周期信号）与环境降温（温度信号）的双重感知能力，并能与上游调控因子形成复杂的转录级联网络。总体而言，这种由启动子结构异质性决定的“早期敏锐响应（CbuNAC30）”与“后期持续响应（CbuNAC15/36）”的时序分工作用，不仅优化了楸树在逆境下的能量分配策略，更为其构筑了精细且多层级的冷胁迫防御体系。

3.3　 WGCNA共表达网络揭示的 CbuNAC 抗寒多重调控级联机制

已有研究^［14-16］表明，NAC转录因子在林木低温逆境响应中扮演着核心枢纽角色。在狗枣猕猴桃、水曲柳等耐寒树种中，NAC蛋白主要通过3条核心路径正向调控耐寒性：一是靶向结合CBF（C-repeat binding factor）或ICE1等上游开关基因的启动子，激活经典的CBF-COR抗寒级联通路^［14］；二是上调可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质的生物合成，以维持细胞渗透势与膜结构稳定；三是激活超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶系统，清除过量活性氧（ROS）以缓解膜脂过氧化损伤。本研究构建的加权基因共表达网络，系统映射了楸树核心靶点基因（CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36）介导的深层防御网络，证实其在上述多条抗寒通路中发挥着高度协同的调控作用。

首先，共表达网络揭示了CbuNAC基因与经典CBF-COR通路的潜在交汇互作。网络中高度富集了WRKY19、MYB4及HAT22等关键转录因子。在拟南芥、苹果（Malus domestica）、玉米（Zea mays）、山荆子（Malus baccata）等植物的研究^［25-29］中，这些基因被证实能够通过靶向结合ICE1或直接作用于CBF启动子来调控ICE1-CBF-COR级联通路。这表明CbuNAC基因并非呈现孤立的线性调控，而是通过与这些转录因子的共表达，作为平行或上游调控节点深度融入并协同激活ICE1-CBF信号传导网络。其次，模块分析精准锚定了多个渗透调节与细胞保护相关的下游效应基因，如LEA5（晚期胚胎发育丰富蛋白基因）、ERD10（早期脱水响应基因）及TPS11（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）。低温常导致植物细胞间隙结冰及胞内脱水，而LEA5与ERD10基因编码的极性亲水蛋白可通过形成水化层维持细胞渗透平衡，防止关键代谢酶因脱水发生不可逆的构象改变与凝集^［30-31］。同时，TPS11催化合成的海藻糖（Trehalose）能替代水分子与膜脂形成氢键，以维持细胞膜的物理流动性^［32］。这些效应基因在加权基因共表达网络中受CbuNAC基因诱导发生显著的共表达聚类，从转录层面阐释了楸树通过积累亲水蛋白与寡糖以维持膜系统稳定的分子逻辑。最后，网络拓扑结构进一步确立了ABA信号通路在楸树抗寒网络中的中枢地位。共表达网络中显著富集了ABA合成限速酶基因NCED1及受体基因PYL8，这一结果与前文CbuNAC启动子区高度富集ABRE元件的结论形成了严密的相互印证，证实CbuNAC基因深度参与了ABA依赖型的抗寒调控途径^［33-34］。更为重要的是，楸树CCCH型锌指蛋白家族的核心成员CbuC3H32（ZFWD1）在网络中作为关键中枢节点（Hub gene）与CbuNAC36呈现极其紧密的连通关系^［35］。这一发现首次在分子水平上揭示了楸树NAC转录因子与锌指蛋白在冷胁迫下的跨家族协同调控关系，表明木本植物在漫长演化过程中为抵御极端低温而进化出的多层级、高维度的基因防御网络体系。

3.4　楸树耐寒分子育种的应用展望

楸树作为我国珍贵的乡土阔叶树种，其天然耐寒性较弱，在一定程度上限制了其在北方高纬度地区的引种与推广应用。本研究系统鉴定的CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36基因展现出强烈的低温时序表达特异性，可作为评估楸树耐寒性分化的核心功能靶点。在现代林木分子育种实践中，一方面，可将这3个关键基因的转录响应模式或其关键序列变异开发为功能性分子标记，为楸树耐寒性状的分子标记辅助选择（MAS）提供可靠靶标，从而显著提升育种效率；另一方面，基于本研究解析的加权基因共表达调控网络，未来可借助CRISPR/Cas9等精准基因编辑技术，对上述基因启动子区的LTR或ABRE等关键顺式作用元件进行靶向修饰，以重塑其转录调控活性；或通过基因工程手段直接干预其转录丰度，进而驱动下游LEA5、ERD10及抗氧化系统相关效应基因的级联协同表达。此外，深入探讨CbuNAC基因与CCCH锌指蛋白等其他抗逆转录因子的联合调控机制，不仅有助于完善木本植物冷适应复杂机制的理论框架，更为楸树抗寒新品种的定向遗传改良提供了重要的分子靶标与调控策略。

4 结论

本研究在全基因组水平上系统鉴定了65个楸树CbuNAC基因家族成员。系统发育与结构特征联合分析表明，该家族可清晰划分为4个演化分支，各亚家族内部在基因结构与保守基序组成上展现出高度的演化保守性；共线性分析证实，片段复制是驱动楸树NAC基因家族规模扩张与功能分化的主导力量。进一步结合低温胁迫转录组时序数据与WGCNA，精准锁定了CbuNAC15、CbuNAC30和CbuNAC36这3个具有强烈响应特异性的核心抗寒靶点基因，并揭示了其与下游功能效应基因协同介导的抗寒多重调控级联机制。本研究不仅从全基因组层面阐明了楸树NAC家族的系统演化特征，更从分子网络维度揭示了其在低温逆境响应中的潜在调控关系，为后续楸树高抗寒优良品种的分子育种改良与生态适应性拓展提供了关键的基因资源与坚实的理论支撑。

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