小黑杨WOX4a启动子克隆及表达活性分析

Cloning and Expression Activity Analysis of the WOX4a Promoter of Populus×xiaohei

摘要

茎作为林木主要的库器官之一，提升其库强（sink strength）对提高木材产量具有重要意义。WOX4属于WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族，其核心功能在于维持维管形成层干细胞的活性并促进其增殖，是调控植物茎与根次生生长的关键因子，在茎的木质部发育过程及根中呈现高表达特征。本研究以小黑杨（Populus×xiaohei）为研究材料，利用RT-qPCR技术分析小黑杨WOX4a基因（PxWOX4a）在不同组织部位的相对表达量；利用GUS染色技术对pPxWOX4a：：GUS转基因植株进行染色，通过观察GUS信号，进一步分析PxWOX4a启动子在不同组织中的表达模式。结果表明：WOX4a基因在小黑杨茎中高表达，通过克隆其上游1 742 bp的启动子及顺式作用元件分析发现，该启动子序列包含G‑box、I‑box、Box4等多个光响应元件。构建pBI121‑pPxWOX4a：：GUS报告载体，转化84K杨（P. alba×P. glandulosa ‘84K’），分子鉴定表明：pPxWOX4a：：GUS已整合到84K杨基因组中。RT‑qPCR表达分析及GUS组织化学染色结果表明，PxWOX4a启动子能驱动GUS基因在84K杨的茎中高表达。上述结果表明：本研究从小黑杨中克隆获得的PxWOX4a启动子，具有驱动外源基因在茎中特异高表达的活性。该启动子的克隆对利用基因工程手段调节杨树等林木茎部组织的库强，进而提高木材产量具有一定的实践意义；同时，为利用茎部特异表达启动子进行木材形成相关基因的功能解析提供了新的途径。

Abstract

The stem， as one of the main storage organs of trees， plays a crucial role in wood production； enhancing its storage capacity（sink strength） is of great significance for increasing wood yield. WOX4 belongs to the WUSCHEL-related homeobox（WOX） transcription factor family and functions in maintaining vascular cambium stem cell activity and promoting cell proliferation， thereby regulating secondary growth in stems and roots. It is highly expressed during xylem development in stems and roots. In this study， RT-qPCR was used to analyze the relative expression levels of the PxWOX4a gene in different tissues. In addition， transgenic plants harboring the pPxWOX4a：：GUS construct were subjected to GUS staining to further analyze the expression pattern of the PxWOX4a promoter. The results showed that WOX4a was highly expressed in the stems of Populus×xiaohei. The upstream 1 742 bp promoter region was cloned， and cis-acting element analysis revealed that it contained multiple light-responsive elements， including G-box， I-box， and Box4. A reporter vector（pBI121-pPxWOX4a：：GUS） was generated and transformed into P. alba×P. glandulosa ‘84K’. Molecular analysis confirmed stable integration of the transgene into the genome. RT-qPCR and GUS histochemical staining demonstrated that the PxWOX4a promoter drove strong expression of the GUS gene in stems. These results indicated that the PxWOX4a promoter cloned from Populus × xiaohei exhibited stem-specific and high activity. It therefore provides a useful tool for stem-targeted genetic engineering to regulate wood formation and improve biomass yield in poplar and other forest trees.

Graphical abstract

关键词

杨树 / 茎 / PxWOX4a启动子 / 启动子活性 / GUS染色

Key words

poplar / stem / PxWOX4a promoter / promoter activity / GUS staining

在植物中，“源”主要指叶片等通过光合作用制造养分的器官；而“库”则包括茎、种子、块根等用于储存光合产物的器官^［1］。木本植物的茎维管系统负责源与库之间的同化物运输^［2］，其不仅是连接源与库的运输通道，更是一个极其重要且容量可观的库。增强木本植物茎的库强，对促进其生长和提高木材产量具有重要意义^［3-4］。

启动子作为位于基因上游的一段DNA序列，能够调控下游基因的转录^［5］。对林木而言，克隆与木材形成密切相关的组织特异性高表达启动子，有助于通过基因工程等手段精准调控与库强相关的基因在特定库组织中的表达，从而定向优化源库关系，对提高木材产量具有重要意义。作为植物特有的转录因子，WOX（WUSCHEL-related homeobox）家族在植物生长发育过程中发挥着关键作用^［6］，主要参与胚胎发育与体胚发生、调控花器官和根系发育、促进愈伤组织的形成与维持，以及干细胞的识别与维持等过程^［7-11］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Solanum lycopersicum）中，WOX4基因在发育阶段的维管束中特异性表达；抑制拟南芥WOX4基因表达后，植株变小，维管束中未分化的基本组织积累，而分化成熟的木质部和韧皮部细胞显著减少。在番茄幼苗中，过表达SlWOX4可导致木质部和韧皮部细胞增殖，表明WOX4基因在调控次生生长中发挥重要作用^［12］。在毛白杨（Populus tomentosa）中，PtoWOX4基因在茎中表达量最高，且主要集中在木质部和韧皮部，影响杨树不定根、茎和叶片维管组织的发育^［13］。目前研究^［14］已证实，WOX4基因在茎中特异性高表达，并主导植物次生生长；该基因能够正向调控树木形成层活动，可作为转基因提高木材产量的可靠候选基因。因此，克隆WOX4启动子并应用于林木基因工程，对于精准调控茎部相关基因的表达、提高库容量具有重要意义。

小黑杨（Populus × xiaohei）是由中国林业科学院林业研究所通过人工杂交培育而成^［15］。多年实践表明，小黑杨是一种速生、丰产、抗逆的优质树种，是北方沙漠和干旱地区的优良速生绿化树种。

本研究采用实时荧光定量PCR技术对小黑杨WOX4a基因（PxWOX4a）的表达模式进行分析，发现PxWOX4a在根、茎、叶中均有表达，但在茎进入次生生长的下部（第5~8茎节）表达量最高。因此，本研究克隆了PxWOX4a启动子，构建了pBI121-pPxWOX4a：：GUS植物表达载体并转化84K杨（Populus alba×Populus glandulosa ‘84K’），成功获得转基因植株。GUS组织化学染色和组织切片分析表明，PxWOX4a启动子在转基因植株茎部具有较高活性。该特性为通过基因工程手段特异性提高树木木质部库强提供了重要的启动子资源。

1 材料与方法

1.1　植物材料

小黑杨和84K杨无菌组培苗由东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室提供并扩繁。培养温度为（25±1） ℃、光周期为16 h/8 h（光照/黑暗）。

1.2　 PxWOX4a 启动子顺式作用元件预测和分析

从东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室提供的小黑杨数据库中获取PxWOX4a转录起始位点上游2 000 bp序列。使用PlantCARE服务平台（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件的预测和分析，并使用TBtools对顺式作用元件进行可视化。

1.3　 PxWOX4a 组织表达特异性分析

选取培养至60 d且长势一致的野生型小黑杨土培苗，从植株不同部位取样，分别为茎上部（第1~4茎节）、茎下部（第5~8茎节）、叶片及根部。取样原则如下：将每3株长势相近、生长状态一致且健康的苗木混合为1个生物学样本。各部位样本经液氮速冻后，采用CTAB法提取小黑杨4个组织部位的RNA，并反转录为cDNA（反转录试剂盒，Takara公司，日本）。以小黑杨Actin作为内参基因，进行RT-qPCR，定量引物信息见附表1（见本刊官网补充材料，下同）。采用2^-∆∆CT法对定量结果进行分析，上述试验均进行3次生物学重复。

1.4　 PxWOX4a 启动子克隆

利用高效植物基因组DNA提取试剂盒（北京擎科生物科技股份有限公司，中国）提取小黑杨的总DNA。根据获得的PxWOX4a启动子序列设计特异性克隆引物（附表2），采用KOD高保真聚合酶（上海东洋纺生物科技有限公司，中国）进行PCR扩增。使用DNA凝胶回收试剂盒（北京擎科生物科技股份有限公司，中国）回收目的片段，并将其连接至Zero TOPO-Blunt载体中，随后转化至DH5α大肠杆菌（Escherichia coli）。对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆质粒送至哈尔滨生工生物技术有限公司进行测序。

1.5　 GUS报告基因载体构建及遗传转化

1.5.1　GUS报告基因载体构建

根据pBI121-GUS载体序列设计同源重组引物（附表3），以PxWOX4a启动子为模板，采用KOD高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。选用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶对pBI121-GUS载体进行双酶切。利用Biosharp公司无缝克隆试剂盒（Biosharp，中国），将线性化的pBI121-GUS载体与带有同源臂的PxWOX4a启动子片段进行重组，获得pBI121-pPxWOX4a：：GUS重组质粒。将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌，通过菌落PCR对单克隆进行初步验证，筛选所得阳性克隆质粒送至哈尔滨生工生物技术有限公司进行测序验证。选取测序正确的质粒转化至GV3101农杆菌（Agrobacterium），验证目的元件并保存菌种。

1.5.2　遗传转化84K杨及阳性植株检测

1.5.2.1 培养基配制

（1）分化培养基：MS、2%蔗糖、0.5 mg·L^-1 1-萘乙酸（NAA）、0.5 mg·L^-1 6-苄基腺嘌呤（6-BA）、0.55%琼脂，pH=5.7；121 ℃灭菌20 min。

（2）抽茎培养基：MS、2%蔗糖、0.5 mg·L^-1 NAA、0.1 mg·L^-1 6-BA、0.55%琼脂，pH=5.7；121 ℃灭菌20 min。

（3）生根培养基：1/2 MS、2%蔗糖、0.2 mg·L^-1 吲哚-3-丁酸（IBA）、0.55%琼脂，pH=5.7；121 ℃灭菌20 min。

（4）共培养培养基：分化培养基灭菌后，在超净工作台中添加50 mg·L^-1乙酰丁香酮（AS）。

（5）筛选分化培养基：分化培养基灭菌后，在超净工作台中添加30 mg·L^-1卡那霉素（Kan）、 30 mg·L^-1头孢霉素（Cef）、30 mg·L^-1特美汀（Tim）。

（6）筛选抽茎培养基：抽茎培养基灭菌后，在超净工作台中添加30 mg·L^-1 Kan、30 mg·L^-1 Cef、30 mg·L^-1 Tim。

（7）筛选生根培养基：生根培养基灭菌后，在超净工作台中添加30 mg·L^-1 Kan、30 mg·L^-1 Cef、30 mg·L^-1 Tim。

（8）液体LB培养基：5 g·L^-1酵母提取物、10 g·L^-1 NaCl、10 g·L^-1胰蛋白胨，pH=7.0；121 ℃灭菌20 min。

（9）固体LB培养基：5 g·L^-1酵母提取物、10 g·L^-1 NaCl、10 g·L^-1胰蛋白胨、1.5%琼脂粉，pH=7.0；121 ℃灭菌20 min。

1.5.2.2 阳性植株检测

取出pBI121-pPxWOX4a：：GUS农杆菌，置于冰上融化后，在含Kan和利福平（Rif）抗性的固体LB培养基上进行三级划线，于28 ℃恒温培养48 h。随后挑取大小适中的单菌落，接种至10 mL含Kan和Rif抗性的液体LB培养基中，于28 ℃、200 r·min^-1恒温振荡培养至OD₆₀₀达1.0~1.1。取1 mL菌液加入25 mL含Kan和Rif的LB液体培养基中，于28 ℃、200 r·min^-1继续培养，待OD₆₀₀达到0.5~0.6后，于4 ℃、4 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用含50 mg·L^-1 AS的MS重悬液重悬菌体，调整OD₆₀₀至0.6~0.8，用于后续遗传转化。

选取培养约30 d、生长旺盛的84K杨组培苗，剪取第2~4片完全展开的叶片，去除叶尖并保留部分叶柄，将其浸入OD₆₀₀为0.6~0.8的1/2MS重悬液中，于28 ℃、100 r·min^-1振荡共培养30 min。取出叶片后吸干表面残余菌液，将叶背朝下紧密贴附于共培养培养基上，暗培养48 h后转移至筛选分化培养基。分化培养30~40 d后，将抗性芽转移至筛选生根培养基中；待抗性芽生长至2~3 cm时，剪下并重新插入筛选生根培养基，经1~2周后形成不定根，即获得抗性植株。

提取抗性植株和野生型的叶片DNA，用附表4中的引物进行PCR鉴定，将鉴定成功的株系进行扩繁，用于后续试验。

1.5.3　转基因植株GUS染色及GUS活性分析

剪取转基因植株的根、茎、叶，浸没于GUS染液中（配制：10 mmol·L^-1乙二胺四乙酸（EDTA）、100 mmol·L^-1 Na₃PO₄、2 mmol·L^-1铁氰化钾、2 mmol·L^-1亚铁氰化钾、0.1% Triton X-100、1 mmol·L^-1 X-Gluc，pH=7.0），置于干燥器中真空侵染。当达到最低气压时，关闭抽气泵及干燥器阀门，维持负压15 min，随后恢复气压，重复上述操作3次以上，直至组织无气泡逸出并沉至瓶底。将样品转移至37 ℃培养箱中避光孵育8 h。随后，将样品置于10倍体积的卡诺固定液（无水乙醇）中固定，并定期更换固定液，直至其颜色不再加深。接着，将样品转入透明剂（配制：水、甘油、乳酸、苯酚按1∶1∶1∶2体积比混合）进行透明化处理。最后，将样品浸于75%乙醇中，置于4 ℃条件下保存。

采用CTAB法分别从转基因84K杨的根、茎、叶组织中提取总RNA，并使用反转录试剂盒反转录为cDNA。以cDNA为模板，选用PxUBQ7作为内参基因，使用附表5所列引物进行RT‑qPCR分析。定量数据通过2^-ΔΔCT方法进行计算，并利用Excel 2010、SPSS 8.5及GraphPad Prism 8软件进行柱状图绘制与差异显著性统计分析。所有试验均设置3个生物学重复。

2 结果与分析

2.1　 PxWOX4a 启动子顺式作用元件分析

通过PlantCARE在线数据库对PxWOX4a启动子进行顺式作用元件预测，总共鉴定出11种主要元件（图1，表1）。结果表明，PxWOX4a启动子区域包含多个光响应元件，其中包括G-Box、I-box、Box 4、chs-CMA1a和TCCC-motif，还包括脱落酸响应元件（ABRE）、厌氧诱导元件（ARE）、MYB结合位点，以及与胁迫相关的HD-Zip 1元件。由此推测，PxWOX4a启动子主要受光调控，同时参与植物激素响应和胁迫诱导过程。

2.2　 PxWOX4a 组织表达特异性

采用实时荧光定量PCR技术分析PxWOX4a组织特异性表达模式，结果显示，PxWOX4a表达具有显著的组织特异性。其表达量在茎部最高，根部次之，两者均显著高于叶片。其中，茎部下段的表达丰度尤为突出，约为叶片表达水平的22倍（图2）。该结果表明，PxWOX4a是茎部特异性高表达基因。

2.3　 PxWOX4a 启动子的克隆

以小黑杨总DNA为模板，用特异性引物（附表2）进行PCR扩增。电泳结果显示（图3），各泳道均呈现清晰单一、大小约2 000 bp的条带。测序结果与本实验室基因组测序结果比对，一致性达到98%（图4），确定成功克隆得到PxWOX4a上游1 742 bp的启动子（序列见附件）。

2.4　 pBI121-pPxWOX4a ：：GUS载体构建

采用双酶切及同源重组方法构建了植物表达载体pBI121-pPxWOX4a：：GUS（图5）。经测序验证构建成功后，将该载体转化至农杆菌GV3101中，并通过PCR鉴定（图6）确认其转化成功。

2.5　 pBI121-pPxWOX4a ：：GUS转基因株系鉴定及GUS活性分析

2.5.1　pBI121-pPxWOX4a：：GUS转基因株系鉴定

采用农杆菌介导法对84K杨进行遗传转化。经PCR鉴定，最终筛选获得3株转基因阳性植株（图7）。

2.5.2　pBI121-pPxWOX4a：：GUS转基因株系GUS活性分析

分别取野生型与转基因植株的根、茎及叶片组织进行GUS组织化学染色分析。染色后的样本置于体式显微镜下进行系统观察与图像采集，以检测并定位GUS基因在各组织中的表达模式。观察结果显示，与野生型相比，PxWOX4a启动子在所有检测器官中均驱动了GUS信号的表达。进一步对比不同组织间的染色强度发现，茎段组织中的GUS信号显著高于根系与叶片（图8A）。其中，茎中形成层和叶柄区域可观察到明显的GUS信号（图8E、8G），根中柱区域亦可检测到GUS信号（图8C）。随后，对转基因株系的根、茎、叶中GUS基因进行RT-qPCR分析，结果表明，GUS基因在不同组织中的表达水平存在显著差异，其中茎中的表达量显著高于根部和叶片（图9）。定量分析结果与组织化学染色观察结果高度一致，进一步证实PxWOX4a启动子在84K杨树中能够有效驱动GUS报告基因的表达，表现出显著的转录活性。该启动子的活性具有明显的空间分布特征，其在茎组织中的表达显著高于其他部位。

3 讨论

木本植物的“源库”关系直接调控光合产物的分配效率^［16］，其中茎作为主要的“库”器官，其库强的提升对于增加木材产量至关重要。茎维管形成层不仅是植物次生生长的关键分生组织，也是木材形成的主要器官^［17］。WOX家族作为植物特有的转录因子，在干细胞维持、器官建成及维管系统发育中发挥关键调控作用。其中，WOX4亚家族成员被证实在维管形成层中具有高度保守的表达模式与功能。Kucukoglu等^［18］在杨树中发现，PtWOX4a/b基因可显著调控形成层细胞分裂和次生生长；在萝卜（Raphanus sativus）中，RsWOX4-2基因影响根的中柱结构，改变其导管和形成层细胞的数量^［19］。此外，有研究^［20-21］进一步揭示，WOX4基因的表达受植物激素（如生长素、脱落酸）及环境信号（如光、干旱）的共同调控，表明其在维管发育中的调控网络具有高度整合性。

小黑杨是我国三北地区广泛栽培的速生树种^［22］，具有耐干旱、耐瘠薄和耐盐碱等特性。本研究以小黑杨为研究对象，首次克隆并功能验证了PxWOX4a上游1 742 bp序列的启动子。生物信息学分析结果显示，该启动子区域富含多种光响应顺式作用元件（如G-box、I-box、Box 4等），同时包含脱落酸响应元件（ABRE）、厌氧诱导元件（ARE）及MYB结合位点等，提示其表达可能受到光信号、植物激素及逆境胁迫的多重调控。这与近年来在拟南芥及白杨中发现的光信号通过调控WOX4基因表达影响形成层活性的机制相吻合^［21］，进一步支持了PxWOX4a启动子在调控木材生长中的潜在功能。

组织表达特异性分析结果显示，PxWOX4a在小黑杨茎下部表达量最高，约为叶片表达量的22倍，表明该基因是茎部特异高表达基因。通过构建pBI121-pPxWOX4a：：GUS表达载体并在84K杨中进行遗传转化，GUS组织化学染色与RT-qPCR分析结果一致表明，该启动子可驱动GUS报告基因在茎特异性高表达，进一步验证了其作为形成层特异性启动子的功能特性。

近年来，随着林木基因组学与基因工程技术的快速发展，组织特异性启动子的挖掘与应用已成为植物分子育种的重要研究方向。在陆地棉（Gossypium hirsutum）中，proGhPER21启动子仅在脱叶剂诱导下于叶柄离层区特异性激活，在棉铃等其他组织中处于“休眠”状态。因此利用该启动子进行的proGhPER21：：GhRLF1转基因棉花，实现了高脱叶效率，同时脱叶剂用量减少30%^［23］。在大豆（Glycine max）中，通过根特异性启动子（pH6H）驱动发根农杆菌（Rhizobium rhizogenes）rolB/rolC基因在颠茄（Atropa belladonna）中的表达，成功实现托品烷生物碱（mTAs）的靶向超量积累，同时避免组成型表达导致的植株形态异常^［24］。由此可见，选择恰当的启动子开展基因工程育种具有显著优势。

克隆与应用组织特异性启动子，可利用基因工程技术在分子水平上实现光合产物分配过程的精准调控。例如，在马铃薯（Solanum tuberosum）块茎中特异性高表达的Patatin启动子可用于提高块茎产量、改良淀粉品质或增强抗病性，从而提升马铃薯库组织容量^［25］。这种分子层面对基因表达的精准操纵，可系统性优化光合产物从合成部位向贮藏或生长部位的定向运输与分配。对于林木而言，茎部是木材形成的主要组织，也是重要的库器官，可利用茎部高表达启动子，通过基因工程手段定向调控光合产物向木材的流动，进而提高木材产量。然而，目前基于库源关系理论、特异性提高林木木材产量的研究仍较为匮乏。本研究所克隆的PxWOX4a启动子在茎部具有较高活性，因此可用于驱动与细胞壁形成、木质部分化相关的功能基因表达，定向调控光合产物向木材的分配，为通过基因工程手段提高林木木材产量提供了可靠的启动子资源；同时也为利用茎部特异表达启动子开展木材形成相关基因的功能解析提供了新的选择。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(31570648)