穿心莲不同材料来源原生质体制备及瞬时转化体系建立

Establishment of a Protoplast Isolation and Transient Transformation System from Different Explant Sources of Andrographis paniculata

摘要

优化穿心莲（Andrographis paniculata）子叶与根愈伤组织原生质体的制备方法，并探究影响其瞬时转化的关键因素，为后续开展穿心莲遗传转化及基因功能研究奠定技术基础。本研究采用酶解法研究不同甘露醇浓度、酶浓度及酶解时间对原生质体产量与活力的影响；通过PEG介导法考察PEG浓度、转化时间等因素对瞬时转化效率的影响，并建立穿心莲根愈伤组织原生质体的瞬时转化体系。穿心莲子叶原生质体制备的最佳条件：取0.2 g子叶，在含4.0%纤维素酶R-10、1.5%离析酶R-10和0.6 mol⋅L^-1甘露醇的酶解液中，26 ℃、55 r⋅min⁻¹黑暗酶解4 h，原生质体产量可达3.32×10⁵ 个⋅mL^-1，活力达90.73%。根愈伤组织原生质体制备的最佳条件：取0.4 g培养15 d的根愈伤组织，在含4.0%纤维素酶R-10、1.0%离析酶R-10和0.8 mol⋅L^-1甘露醇的酶解液中，相同条件下酶解9 h，产量可达2.18×10⁶ 个⋅mL^-1，活力达94.19%。PEG介导的瞬时转化试验表明，40% PEG 4000处理30 min、质粒用量10 μg、甘露醇浓度0.6 mol⋅L^-1为最优转化条件，转化效率可达58.03%。不同来源的穿心莲材料在原生质体制备条件上存在显著差异，需要针对材料特性进行条件优化。本研究建立了高效的穿心莲子叶和根愈伤组织原生质体制备体系及根愈伤组织原生质体的瞬时转化体系，为后续开展穿心莲基因功能解析与细胞生物学研究提供了可靠的技术支持。

Abstract

This study aimed to optimize the preparation methods of protoplasts from cotyledons and root callus of Andrographis paniculata， and to investigate the key factors affecting their transient transformation， thereby laying a technical foundation for subsequent genetic transformation and gene function research in A. paniculata. The effects of different mannitol concentrations， enzyme concentrations， and enzymatic hydrolysis time on protoplast yield and viability were studied using the enzymatic hydrolysis method. The PEG-mediated transformation method was employed to examine the influence of factors such as PEG concentration and transformation time on transient transformation efficiency， and a transient transformation system for A. paniculata root callus protoplasts was established. The optimal conditions for protoplast preparation from A. paniculata cotyledons were as follows： 0.2 g cotyledons were enzymatically hydrolyzed in a solution containing 4.0% cellulase R-10， 1.5% macerozyme R-10， and 0.6 mol⋅L^-1 mannitol at 26 ℃ and 55 r⋅min^-1 in darkness for 4 h. Under these conditions， the protoplast yield reached 3.32×10⁵ cells⋅mL^-1， with a viability of 90.73%. For root callus protoplasts， the optimal conditions were： 0.4 g 15‑day‑old callus was enzymatically hydrolyzed in a solution containing 4.0% cellulase R-10， 1.0% macerozyme R-10， and 0.8 mol⋅L^-1 mannitol under the same conditions for 9 h， yielding 2.18×10⁶ cells⋅mL^-1 with a viability of 94.19%. In PEG-mediated transient transformation， the optimal conditions were determined to be 40% PEG 4000 treatment for 30 min， 10 μg of plasmid DNA， and 0.6 mol⋅L^-1 mannitol. Under these conditions， the transformation efficiency reached 58.03%. Significant differences existed in the optimal preparation conditions for protoplasts derived from different tissues of A. paniculata， emphasizing the need for tissue-specific optimization. This study established an efficient protoplast preparation and transient transformation system for both cotyledons and root callus of A. paniculata， providing a reliable technical platform for future gene function analysis and cell biology research in this medicinal plant.

Graphical abstract

关键词

穿心莲 / 原生质体 / 根愈伤组织 / 子叶 / 瞬时转化

Key words

Andrographis paniculata / protoplast / root callus / cotyledon / transient transformation

穿心莲（Andrographis paniculata）作为一种传统药用植物，在亚洲医学中具有悠久的历史。现代药理学研究^［1-5］表明，其提取物和活性成分如穿心莲内酯已被广泛证实具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗糖尿病和抗氧化等多种生物活性。尤其在肿瘤治疗领域，穿心莲已展现出对肝癌^［6］和宫颈癌^［7］等疾病的显著干预潜力，凸显其作为天然药物资源的开发价值。然而，随着市场对穿心莲需求量的持续增长，其栽培与育种中存在的产量与品质问题日渐凸显^［8］，而传统的育种与栽培方法已难以满足对其产量与品质提升的迫切需求^［9］。

植物原生质体是指去除细胞壁后被质膜所包围的、具有生命力和全能性的裸露细胞。此类细胞保留了植物完整的遗传信息，并具有分化发育成完整植株的能力^［10］。因此，高效获取高产量与高活力植物原生质体，是实现植株再生、体细胞杂交、遗传转化、亚细胞定位及单细胞测序等下游应用的关键前提^［11-12］。目前，该技术已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中发展得较为成熟^［13］，并在人参（Panax ginseng）^［14］、丹参（Salvia miltiorrhiza）^［15］等其他药用植物的遗传转化研究中得到了成功应用。相比之下，穿心莲的原生质体研究仍处于起步阶段，现有报道多是探索单一材料的酶解条件^［16-17］，缺乏对不同组织来源原生质体制备条件的系统优化，更未对原生质体的产量、活力与物理均一性进行系统性表征与比较，严重制约了适用于多样化下游应用的高质量原生质体材料的获取。

鉴于上述研究缺口，建立一套稳定、高效且适用于穿心莲不同试验需求的原生质体制备与瞬时转化体系，已成为推进其分子生物学与合成生物学研究的关键技术需求。本研究旨在系统比较并优化穿心莲2种关键外植体——子叶与根愈伤组织的原生质体制备体系，通过考察酶种类与浓度、渗透压稳定剂浓度、酶解时间及材料生理年龄等多重因素，明确其最佳制备条件；并首次对2种来源原生质体的产量、活力及物理特性包括直径与均一性进行系统比较与表征，并基于上述优化与表征，筛选适宜的原生质体材料，建立并优化PEG介导的瞬时转化体系。

1 材料与方法

1.1　材料与仪器

植物材料：穿心莲种子采自广西贵港穿心莲种子田，经广州中医药大学药用植物学教研室主任杜勤教授鉴定为爵床科（Acanthaceae）植物穿心莲种子。

主要试剂：纤维素酶R-10（cellulase R-10，Yakult，日本）、离析酶R-10（macerozyme R-10，Yakult，日本）、果胶酶Y-23（pectinase，Yakult，日本）、荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA，北京索莱宝科技有限公司，中国）。

主要仪器：TD6-W型微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司，中国）、OLYMPUS CX21光学显微镜（OLYMPUS，日本）、THZ-100B型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司，中国）、JJ300型电子天平（广州湘仪机电设备有限公司，中国）。

1.2　无菌苗培养和愈伤组织诱导

穿心莲种子经75%的乙醇浸泡30 s，10%的次氯酸钠消毒10 min后，用无菌水漂洗3~5次；配制固体培养基，配方为1/2 MS（Murashige and Skoog）+0.5 mg·L^-1吲哚-3-丁酸（IBA）+0.5 mg·L^-1活性炭+30.0 mg·L^-1蔗糖+6.6 mg·L^-1琼脂，调节pH=5.8，121 ℃高温灭菌20 min。待培养基冷却后接入消毒种子，放置于组培室培养，条件为长日照（LED，光照16 h/黑暗8 h），温度25 ℃。待无菌苗长至2~3片真叶（对生）时，取其根接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养，培养基配方为MS（Murashige and Skoog）+0.2 mg·L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+0.4 mg·L^-1 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.1 mg·L^-1激动素（KT）+30.0 g·L^-1蔗糖+6.6 g琼脂，调节pH=5.8，121 ℃高温灭菌20 min。取培养15~30 d的无菌苗子叶及诱导获得的初代根愈伤组织用于原生质体制备。

1.3　穿心莲原生质体分离方法

将培养21 d的穿心莲愈伤组织（0.4 g，鲜质量）和子叶（0.2 g，切成0.2 mm的细条），分别置于5 mL新鲜制备的酶解液（55 ℃水浴10 min，0.22 μm微孔滤膜过滤）中。将含有材料的酶解液置于50 mL无菌三角锥形瓶中，使用小药匙将愈伤组织捣碎，在（26±1） ℃的黑暗条件下以55 r·min^-1转速振荡酶解。酶解后，加入等体积预冷的W5溶液（154 mmol·L^-1 NaCl，125 mmol·L^-1 CaCl₂，5 mmol·L^-1 KCl，2 mmol·L^-1 MES）稀释，经70 μm尼龙网过滤至50 mL离心管中，1 000 r·min^-1离心2 min，弃上清，重复洗涤3次。最后将纯化的原生质体重悬于1 mL W5溶液中。使用细胞计数板对原生质体浓度和总产量进行定量；采用FDA活体染色法测定细胞活力，取100 μL原生质体悬液加入10 μL 1 g·L^-1 FDA溶液避光染色3~4 min后于荧光显微镜下观察。

原生质体产量=血细胞计数板中观察到的原生质体平均数×稀释倍数（1）

原生质体活力=（观察视野中被染色的原生质体数/观察视野中原生质体总数）×100%（2）

1.4　甘露醇浓度对穿心莲原生质体产量和活力的影响

基于预试验结果，以子叶为材料的试验，采用4.0%纤维素酶+1.0%离析酶，酶解4 h；以根愈伤组织为材料的试验，采用3.0%纤维素酶+ 1.5%离析酶+0.1%果胶酶，酶解8 h；分别进行单因素试验：以子叶为材料的试验，设置甘露醇浓度梯度为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol·L^-1；以根愈伤组织为材料的试验，设置甘露醇浓度梯度为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol·L^-1。测定不同甘露醇浓度下穿心莲原生质体的产量及活力，酶解方法同1.3。

1.5　酶浓度对穿心莲原生质体产量和活力的影响

在确定最适甘露醇浓度的基础上，分别对穿心莲子叶与根愈伤组织进行单因素试验：对于子叶材料，设置离析酶浓度梯度为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，以及纤维素酶浓度梯度为2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%。对于根愈伤组织，设置离析酶浓度梯度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，果胶酶浓度梯度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，以及纤维素酶浓度梯度为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%。测定不同酶浓度下穿心莲原生质体的产量和活力，酶解方法同1.3。

1.6　酶解时间对穿心莲原生质体产量和活力的影响

在确定最适甘露醇浓度及酶浓度的基础上，对穿心莲子叶与根愈伤组织材料进行单因素试验，分别设置酶解时间梯度为3、4、5、6、7 h，6、7、8、9、10 h。测定不同酶解时间下穿心莲原生质体的产量和活力，酶解方法同1.3。

1.7　穿心莲原生质体酶解条件正交试验优化

以确定的最佳甘露醇浓度为基础，选择纤维素酶浓度（A）、离析酶浓度（B）、酶解时间（C）3个因素进行正交试验优化。采用L₉（3³）正交试验设计（表1~2），分别对穿心莲子叶和根愈伤组织进行原生质体分离，方法同1.3，测定穿心莲原生质体产量，试验重复3次。对正交试验结果进行极差分析和方差分析，综合确定最佳酶解条件组合。

1.8　培养时间对穿心莲原生质体产量和活力的影响

在确定的最适酶解条件的基础上，取培养15、30、45 d的初代愈伤组织进行酶解。测定不同培养时间下穿心莲原生质体的产量和活力，酶解方法同1.3。

1.9　穿心莲不同材料原生质体形态学观察与统计

取100 μL上述条件下制备得到的原生质体悬液，加入10 μL 0.5%中性红染色液避光染色10 min，置于光学显微镜下观察并拍照。另取新鲜分离的原生质体，稀释后置于载玻片上，使原生质体呈单层分散状态，在光学显微镜下拍摄原生质体图像。使用ImageJ 1.54图像分析软件测量原生质体的最大直径，每个样品随机测量100个原生质体。

1.10　穿心莲根愈伤组织原生质体瞬时转化条件优化

参考上述原生质体分离纯化方法，向离心洗涤后的穿心莲原生质体沉淀中加入MMG溶液（15.0 mmol·L^-1 MgCl₂，4.0 mmol·L^-1 MES，0.8 mol·L^-1甘露醇），轻击离心管底部重悬并调整原生质体密度至1.0×10⁵ 个·mL^-1。在2 mL圆底离心管中加入10、20、30 μg植物表达载体pcambia1300-35S-GFP，再加入200 μL原生质体重悬液轻柔混匀，静置3 min。然后加入220 μL PEG-Ca²⁺溶液（其中甘露醇浓度分别设置为0.4、0.6、0.8 mol·L^-1），轻柔混匀。室温黑暗条件下分别孵育10、20、30、40、50 min进行转化。转化反应完成后，加入1 mL的W5溶液，颠倒离心管充分混合均匀以终止转化反应。100×g离心2 min，弃上清，使用1 mL的W5溶液顺离心管壁滴入洗涤2次，弃上清加入1 mL的W5溶液轻轻重悬原生质体，置于25 ℃下黑暗静置培养20 h。培养完成后，混合液于100×g离心2 min，去部分上清，对原生质体溶液进行浓缩，取样制片，荧光显微镜下观察GFP表达情况。每个试验设3次重复，每次重复随机观察3个视野，统计转化效率。

原生质体转化效率=（激发光下发出绿色荧光的原生质体数目/明场下所有原生质体数目）×100%（3）

1.11　数据处理

所有试验均设置3次生物学重复，数据以均值±标准差表示。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较检验进行显著性分析（P<0.05）。使用GraphPad Prism 9.5.1制图。

2 结果与分析

2.1　穿心莲子叶与根愈伤组织原生质体的分离与形态观察

以生长状态良好的穿心莲无菌苗（图1A）为起始材料，分别取其子叶（图1B）和根段诱导的根愈伤组织（图1E）作为外植体进行原生质体制备。经酶解处理后，光学显微镜观察显示，2种材料均能释放出形态完整的原生质体（图1C、1F），所获原生质体呈圆形、边界清晰。采用FDA荧光染色法进行检测原生质体活力，结果显示，来源于子叶和根愈伤组织的原生质体在荧光视野下（图1D、1J）均发出明亮的绿色荧光，表明所分离的原生质体具有良好活力。

2.2　甘露醇浓度对穿心莲不同材料原生质体酶解的影响

甘露醇在平衡原生质体渗透压和影响酶解效率方面具有关键作用。本研究对子叶与根愈伤组织分别设置了0.4~0.8 mol·L^-1及0.6~1.0 mol·L^-1的甘露醇浓度梯度进行试验。结果表明，穿心莲2种材料来源的原生质体产量和活力都随着甘露醇浓度的增加呈现先上升后下降的趋势（图2）。对于子叶材料，当甘露醇浓度从0.4 mol·L^-1增加至0.6 mol·L^-1时，原生质体产量从0.88×10⁵个·mL^-1增加至1.45×10⁵个·mL^-1，活力从65.03%提升至88.68%，继续增加浓度至0.8 mol·L^-1，产量下降至1.13×10⁵ 个·mL^-1，活力下降至74.97%；对于根愈伤组织，甘露醇浓度从0.6 mol·L^-1增加至0.8 mol·L^-1时，原生质体产量从3.87×10⁵ 个·mL^-1增加至1.05×10⁶ 个·mL^-1，原生质体活力从75.00%提升至85.25%；当浓度继续增加至1.0 mol·L^-1，产量和活力均有所下降。因此，确定0.6、0.8 mol·L^-1甘露醇浓度分别为穿心莲子叶与根愈伤组织酶解的最佳渗透压浓度。此条件下，所获穿心莲原生质体形态完整，呈圆球形（图1C、1F）。

2.3　酶浓度对穿心莲根愈伤组织原生质体产量和活力的影响

不同酶浓度对穿心莲子叶与根愈伤组织原生质体产量和活力有显著影响（图3）。其中，随着离析酶浓度增加，子叶及根愈伤组织原生质体的产量分别从0.33×10⁵个·mL⁻¹和3.64×10⁵个·mL⁻¹显著上升至最高产量3.32×10⁵个·mL⁻¹和9.99×10⁵个·mL⁻¹，分别在1.0%、1.5%的离析酶浓度下达到峰值；原生质体活力分别提高至88.69%、81.80%，当离析酶浓度继续增加，子叶及根愈伤组织原生质体产量分别显著下降至2.87×10⁵个·mL⁻¹、7.04×10⁵个·mL⁻¹，原生质体活力分别下降至82.50%、45.64%。因此，选择1.0%、1.5%离析酶浓度分别作为子叶与根愈伤组织的最佳酶浓度进行后续试验。

子叶原生质体的产量随着纤维素酶浓度增加显著上升，在5.0%纤维素酶浓度时达到峰值4.08×10⁵个·mL⁻¹，而活力随着纤维素酶浓度的增加而减低。随着纤维素酶浓度的增加，根愈伤组织原生质体的产量提高至最高值1.92×10⁶个·mL⁻¹，活力达到峰值为90.51%；当纤维素酶浓度从3.5%增加到4.0%时，原生质体产量显著下降至1.12×10⁶个·mL^-1，原生质体活力下降至78.49%。因此，子叶与根愈伤组织选择5.0%、3.5%纤维素酶浓度作为最佳酶浓度进行后续试验。

对于根愈伤组织，进一步考察了果胶酶浓度的影响。结果显示，不添加果胶酶时原生质体产量最高，达1.42×10⁶个·mL⁻¹，随着果胶酶浓度增加，产量逐渐降低，当浓度增加至0.4%时，产量显著下降至最低值1.98×10⁵个·mL⁻¹，同时原生质体活力下降至72.42%。因此，后续根愈伤组织原生质体制备中不添加果胶酶。

2.4　酶解时间对穿心莲根愈伤组织原生质体分离产量和活力影响

不同酶解时间对穿心莲原生质体产量和活力有显著影响。由图4可知，随着酶解时间增加，两种材料原生质体产量均随酶解时间延长呈先升后降趋势。子叶和根愈伤组织分别在酶解4 h和8 h时达到峰值3.77×10⁵ 个·mL^-1和1.31×10⁶ 个·mL^-1，原生质体活力有所上升。继续延长酶解时间，原生质体产量和活力均逐渐下降。因此，选用4 h、8 h分别为穿心莲子叶、愈伤组织酶解最适酶解时间进行后续试验。

2.5　穿心莲原生质体分离条件的正交优化

在单因素试验结果确定穿心莲子叶、根愈伤组织原生质体合适的酶解液浓度及酶解时间范围的基础上，采用L9（3³）型正交设计，以纤维素酶（A）、离析酶（B）、酶解时间（C）为考察对象，以原生质体产量作为评价指标，分别对穿心莲子叶和根愈伤组织的原生质体分离条件进行优化。

对于穿心莲子叶原生质体解离效果的影响通过R（极差）大小反映（表3），结果发现R_B=0.97>R_C=0.83>R_A=0.82，表明各因素对子叶原生质体产量的影响依次为离析酶>酶解时间>纤维素酶。进一步方差分析和显著性分析发现（表4），离析酶和酶解时间对试验结果的影响显著（P<0.05）；纤维素酶对结果的影响不显著，说明离析酶和酶解时间是影响酶解效率的主要因子。综合极差、方差分析结果，结合K值，最终确定穿心莲子叶原生质体最佳解离条件组合为A1B3C2，编号为2，即纤维素酶浓度为4.0%、离析酶浓度为1.5%和酶解时间4 h。

根愈伤组织原生质体分离条件优化的正交试验结果表明，各因素极差大小关系为R_A=8.46>R_B=7.74>R_C=5.94（表5），各因素对穿心莲根愈伤组织原生质体产量的影响依次为纤维素酶>离析酶>酶解时间。方差分析和显著性分析结果表明，纤维素酶和离析酶对试验结果的影响显著（P<0.05），酶解时间对结果的影响不显著（表6），说明酶浓度是影响根愈伤组织原生质体分离效果的主要因子。综合极差、方差分析结果，结合K，最终确定穿心莲根愈伤组织原生质体最佳解离条件组合为A3B1C3，编号为8，即纤维素酶浓度为4.0%、离析酶浓度为1.0%和酶解时间9 h。

2.6　培养时间对穿心莲原生质体产量和活力的影响

由于培养时间直接影响细胞壁的组成和代谢活性，本研究分别选取培养15、30、45 d的根愈伤组织进行分离比较。结果表明，培养15 d的根愈伤组织经酶解后，原生质体产量最高，达2.18×10⁶个·mL⁻¹，活力达到94.19%（图5）。随着培养时间的延长，原生质体的产量与活力均呈逐渐下降趋势。因此，培养15 d的根愈伤组织最适作为原生质体制备材料。

2.7　不同材料来源穿心莲原生质体的形态学观察与物理表征

采用0.5%中性红对2种来源的原生质体染色后进行显微观察，结果显示，子叶来源的原生质体呈深红色染色，液泡大小中等，细胞内散布大量大小不一的圆形液泡，并可见明显的叶绿体（图6）。根愈伤组织来源的原生质体染色较浅，呈浅红色，液泡较小或难以辨别，细胞内部充满密集的颗粒状内容物，细胞质浓厚，表明其液泡特异性程度较低。

不同组织来源穿心莲原生质体的直径大小与群体均一性存在显著差异（图7）。直径分析结果表明，子叶来源的原生质体直径最大，主要分布在30~40 μm，显著大于根愈伤组织来源的原生质体（主要分布在15~30 μm）。从群体均一性来看，根愈伤组织来源原生质体的小提琴图最为紧凑，离散程度最小，表明其均一性最佳；而子叶来源原生质体的直径分布范围最广，均一性相对较差。综上，子叶原生质体平均直径为29.90 μm，显著高于根愈伤组织来源的20.52 μm，但在群体均一性则表现为根愈伤组织来源原生质体优于子叶来源。因此，选择根愈伤组织来源的原生质体进行后续瞬时转化研究。

2.8　穿心莲根愈伤组织原生质体瞬时转化条件优化

研究表明：PEG浓度、转化时间、质粒用量及甘露醇浓度等因素对根愈伤组织原生质体的瞬时转化效率均有显著影响（图8）。PEG浓度对转化效率的影响呈先升后降趋势（图8A）。当PEG浓度从25%增加至40%，转化效率由26.52%上升至45.20%；当浓度进一步提高至45%时，转化效率下降至40.13%。这表明适宜浓度的PEG可有效促进原生质体吸收外源DNA，但浓度过高可能产生细胞毒性，从而抑制转化。

转化时间对根愈伤组织原生质体的瞬时转化效率的影响同样呈现类似的趋势（图8B）。处理10 min时，转化效率仅为21.50%；延长至30 min时，效率提升至37.63%；继续延长至50 min则导致转化效率下降至26.08%，表明过长或过短的转化时间均不利于根愈伤组织原生质体的瞬时转化。

质粒用量对转化效率的影响则呈现不同规律（图8C）。当质粒添加量为10 μg时，转化效率最高，达40.60%；随着质粒量增加至30 μg，转化效率逐渐降低至23.66%，说明过高的质粒用量可能对原生质体产生毒性或干扰转化过程。

此外，渗透压调节剂甘露醇浓度对转化效率亦有显著影响（图8D）。在0.4~0.8 mol·L^-1，转化效率随甘露醇浓度升高呈现先升后降的变化。当甘露醇浓度为0.4 mol·L^-1时，转化效率为47.50%；升高至0.6 mol·L^-1时达到最高值58.03%；继续增至0.8 mol·L^-1时瞬时转化效率降至40.49%。该结果表明，0.6 mol·L^-1的甘露醇浓度最有利于维持原生质体在PEG处理过程中的稳定性，从而获得最佳转化效率。

2.9　穿心莲原生质体瞬时转化体系的构建

综合上述优化结果，确定穿心莲根愈伤组织原生质体的最佳瞬时转化条件：原生质体密度1×10⁵ 个·mL^-1，转化液由40% PEG4000、0.1 mol·L^-1 CaCl₂及0.6 mol·L^-1甘露醇配制而成，转化时间为30 min，转化后黑暗孵育20 h。在此优化条件下，原生质体的瞬时转化效率达58.03%（图9A、9B）。进一步采用激光共聚焦显微镜对转化后原生质体进行观察，镜检结果如图9C~9E所示。在激发光488 nm条件下可观察到外源GFP蛋白表达的绿色荧光信号，表明外源基因成功转入并在原生质体中实现了瞬时表达。

3 讨论

植物中原生质体来源多样，如叶、根、子叶和愈伤组织等^［18-20］。由于细胞壁组成在植物种类、发育阶段和组织中存在显著差异，因此针对每种特定材料的原生质体分离和纯化方法至关重要。而渗透压、酶种类与浓度、酶解时间及材料状态等因素均会影响原生质体的解离效率与质量^［21］。

环境渗透压不适，会显著加剧原生质体所受胁迫，严重时可导致其结构破裂并丧失活性。因此，合适的渗透压是获得高产量高活力原生质体的关键因素^［22］。本研究结果显示，穿心莲2种不同材料来源的原生质体具有不同的渗透生理特性，子叶原生质体适宜的渗透压浓度为0.6 mol·L^-1的甘露醇溶液，而根愈伤组织的渗透压则需要选择更高的浓度，即0.8 mol·L^-1。这一差异与其细胞结构特征密切相关。子叶作为光合器官，有较大的液泡，其细胞内部渗透压可能相对较高，因此，与0.6 mol·L^-1的甘露醇溶液能达到较好平衡；而脱分化的根愈伤组织细胞液泡化程度较低、细胞质更为浓厚，其内部渗透压可能较低，因此需要更高浓度的甘露醇来提供足够的外部支撑，以防止在细胞壁降解后因水分大量内流而导致原生质体破裂。

细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶等组分构成，其组分含量在不同种类植物及不同发育阶段会存在显著差异^［23］。单因素试验结果表明，穿心莲子叶与根愈伤组织原生质体对酶种类和浓度的响应存在显著差异。子叶原生质体的高效分离需要相对更高的纤维素酶浓度（5.0%）与离析酶浓度（1.5%）方能达到峰值，暗示其具有结构更为完整、需要多种酶协同作用才能有效解离的细胞壁。而根愈伤组织在3.5%纤维素酶时即达到产量峰值（1.92×10⁶ 个·mL^-1）和活力峰值（90.51%），表明其对纤维素酶浓度变化极为敏感。值得注意的是，外源果胶酶对根愈伤组织原生质体产量和活力呈显著负效应，不添加果胶酶时产量最高（1.43×10⁶ 个·mL^-1）。这一结果与Vi\tilde{\mathrm{n}}as等^［24］在火龙果（Selenicereus costaricensis）愈伤组织中的观察一致，推测穿心莲根愈伤组织细胞壁含有的果胶含量较少或内源果胶酶活性已充足，外源添加导致中层过度水解，使原生质体过早释放而膜完整性受损。上述差异从根本上反映了两者在细胞发育状态与细胞壁化学组成上的特异性。

酶解时间是导致原生质体不能有效分离的重要因素之一。时间不足，则原生质体难以充分释放；时间过长，游离的原生质体又会受到酶组分的毒害^［25］。本研究中，随着酶解时间的延长，子叶与根愈伤组织原生质体的产量与活力均呈现先上升后下降的趋势，并分别在4 h与8 h达到峰值。这一规律揭示了原生质体释放过程中“充分解离”与“过度损伤”之间的精细平衡。

愈伤组织培养时间对分离效果影响亦有显著影响。培养15 d的幼嫩愈伤组织产量与活力均显著高于培养30 d和45 d的材料。这可能是因为幼嫩愈伤组织细胞分裂活跃，细胞壁较薄且结构松散，易于被酶降解；而随着培养时间延长，细胞逐渐老化、次生壁增厚或代谢产物积累，从而增强了细胞壁对酶解的抵抗力，并降低了原生质体的活力。该“幼嫩优势”规律与Chen等^［26］在杂交矮牵牛（Calibrachoa hybrida）中的发现一致，表明幼嫩材料细胞壁木质化程度低、可溶性果胶比例高，且氧化损伤水平低，这些特性共同为原生质体高效制备提供了理想的生理基础。

本研究首次系统表征并比较了穿心莲不同组织来源原生质体的物理特性。结果表明，子叶与根愈伤组织来源的原生质体在直径与群体均一性上存在本质差异。子叶原生质体平均直径更大（29.90 μm，主要分布于30~40 μm），这与其供体细胞高度分化、液泡发达的结构有关；而根愈伤组织原生质体直径较小（20.52 μm，集中于15~30 μm），且群体分布高度集中、均一性极佳，这可能与其来源于脱分化、分裂旺盛的幼嫩细胞有关。这些物理差异对后续应用具有明确指向。Pujari等^［27］指出，小尺寸的原生质体通常具有更高的分裂与再生效率，是基因编辑等研究的首选材料。因此，本研究中均一性高、直径较小的根愈伤组织原生质体，更适合用于需要标准化输入的高通量转化或同步培养分析。而子叶原生质体较大的直径与较高的异质性，反映了其来源组织的细胞类型多样性，这与Faraco等^［28］关于原生质体短期内保留来源组织特性的结论相符。综上，本研究从物理表征层面为针对不同下游应用选择最适原生质体材料提供了直接依据。

PEG介导法是一种相对简单、低成本、高效的原生质体瞬时转化方法^［29］。本研究系统优化了影响转化效率的关键参数。PEG浓度是核心因素之一。结果表明，35%~45% PEG 4000可有效介导外源质粒进入细胞，其中使用40% PEG 4000处理30 min时转化效果最佳。浓度过低时膜通透性改变不足，DNA难以有效导入；浓度过高则易对细胞膜结构造成损伤。转化时间也呈现类似阈值效应：延长至40~50 min时，转化效率显著下降，镜检可见细胞裂解及内容物外泄，这与PEG长时间作用破坏膜磷脂双分子层结构有关^［30］。质粒用量对原生质体瞬时转化的影响表现为随质粒用量增加而逐渐降低，这表明原生质体对DNA的摄入在一定范围内可能趋于饱和，过量的外源DNA不仅无法被有效吸收，还可能对原生质体细胞造成损伤，甚至对细胞代谢产生额外负担。此外，渗透压稳定剂甘露醇的浓度是另一个关键因素^［31］。与根愈伤组织原生质体酶解最适浓度（0.8 mol·L^-1）相比，转化体系中适当降低甘露醇浓度至0.6 mol·L^-1可获得最高的转化效率（图8D）。这一现象可能归因于适度低渗环境能够提高原生质体质膜的通透性，从而促进外源DNA的进入；但浓度过低（0.4 mol·L^-1）则保护不足，导致原生质体存活率下降。通过系统优化上述关键参数，本研究建立了高效的穿心莲根愈伤组织原生质体瞬时转化体系，为后续基因功能研究提供了可靠技术平台。

4 结论

本研究通过对酶液组合、甘露醇浓度和酶解时间的系统优化，确定了穿心莲子叶原生质体最佳分离条件：4.0%纤维素酶+1.5%离析酶+ 0.6 mol·L^-1甘露醇溶液的酶液组合下处理4 h。在此条件下，原生质体产量达到3.32×10⁵个·mL^-1，活力可达90.73%。穿心莲根愈伤组织原生质体的最佳分离条件：培养15 d的根愈伤组织在4.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.8 mol·L^-1甘露醇溶液的酶液组合下酶解9 h。在此条件下，原生质体分离量最高达到2.18×10⁶ 个·mL^-1，活率在90%以上。值得注意的是，这一产量超过了从花药愈伤组织中分离原生质体的报道^［17］。在此基础上，进一步建立了穿心莲根愈伤组织原生质体瞬时转化体系：原生质体密度为1×10⁵ 个·mL^-1，加入10 μg质粒，在含有0.6 mol·L^-1甘露醇、1 mol·L^-1 CaCl₂、40% PEG 4000的转化液中转化30 min，黑暗孵育20 h，转化效率可达58.03%。综上，本研究建立了一套高效、高活力的穿心莲不同材料来源原生质体分离方法，以及根愈伤组织来源原生质体的瞬时转化体系。该体系的建立为穿心莲原生质体育种技术奠定了基础，也为研究组织特异性过程提供了更可靠的试验平台。

参考文献

[1] LOW M， KHOO C S， MÜNCH G，et al.An in vitro study of anti-inflammatory activity of standardised Andrographis paniculata extracts and pure andrographolide［J］.BMC Complementary and Alternative Medicine，2015，15（1）：18.

[2] MAIUOLO J， CAMINITI R， MAZZA V，et al.An innovative method of improving an extract of Andrographis paniculata from leaves：its anticancer effect involves the cell endoplasmic reticulum［J］.International Journal of Molecular Sciences，2025，26（1）：344.

[3] JADHAV A K， KARUPPAYIL S M. Andrographis paniculata （Burm.f.） wall ex nees：antiviral properties［J］.Phytotherapy Research，2021，35（10）：5365-5373.

[4] AKHTAR M T， MOHD SARIB M S BIN， ISMAIL I S，et al.Anti-diabetic activity and metabolic changes induced by Andrographis paniculata plant extract in obese diabetic rats［J］.Molecules，2016，21（8）：1026.

[5] LIN F L， WU S J， LEE S C，et al.Antioxidant，antioedema and analgesic activities of Andrographis paniculata extracts and their active constituent andrographolide［J］.Phytotherapy Research，2009，23（7）：958-964.

[6] GAO S Y， TAN H X， GANG J.Inhibition of hepatocellular carcinoma cell proliferation through regulation of the cell cycle，AGE-RAGE，and leptin signaling pathways by a compound formulation comprised of andrographolide，wogonin，and oroxylin a derived from Andrographis paniculata（Burm.f.） Nees［J］.Journal of Ethnopharmacology，2024，329：118001.

[7] ISLAM M A， HOSSAIN M S， HASNAT S，et al.In-silico study unveils potential phytocompounds in Andrographis paniculata against E6 protein of the high-risk HPV-16 subtype for cervical cancer therapy［J］.Scientific Reports，2024，14（1）：17182.

[8] 邵艳华.穿心莲种质资源及其质量评价研究［D］.广州：广州中医药大学，2015.

[9] SHAO Y H.Study on germplasm resource and quality evaluation of the medicinal plant Andrographis paniculata ［D］.Guangzhou：Guangzhou University of Chinese Medicine，2015.

[10] 陈东亮，钟楚，林阳.药用植物穿心莲种质资源、育种及栽培研究进展［J］.江苏农业科学，2020，48（21）：34-40.

[11] CHEN D L， ZHONG C， LIN Y.Research progress on germplasm resources，breeding and cultivation of medicinal plant Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees［J］.Jiangsu Agricultural Sciences，2020，48（21）：34-40.

[12] EECKHAUT T， LAKSHMANAN P S， DERYCKERE D，et al.Progress in plant protoplast research［J］.Planta，2013，238（6）：991-1003.

[13] YOKOYAMA R， KUKI H， KUROHA T，et al. Arabidopsis regenerating protoplast：a powerful model system for combining the proteomics of cell wall proteins and the visualization of cell wall dynamics［J］.Proteomes，2016，4（4）：34.

[14] XU Y， LI R L， LUO H B，et al.Protoplasts：small cells with big roles in plant biology［J］.Trends in Plant Science，2022，27（8）：828-829.

[15] ROEST S， GILISSEN L J W.Plant regeneration from protoplasts：a literature review［J］.Acta Botanica Neerlandica，1989，38（1）：1-23.

[16] WANG Q， ZHANG M Y， HAN M X，et al.Development of a transient expression system for Panax ginseng based on protoplast isolation from its embryoids［J］.Horticultural Plant Journal，2025，11（1）：459-462.

[17] HSU C T， CHIU C C， HSIAO P Y，et al.Transgene-free CRISPR/Cas9-mediated gene editing through protoplast-to-plant regeneration enhances active compounds in Salvia miltiorrhiza ［J］.Plant Biotechnology Journal，2024，22（6）：1549-1551.

[18] 黄瑞华，刘潇晗，曹天丽，等.穿心莲叶片原生质体制备方法的建立与优化［J］.分子植物育种，2021，19（17）：5878-5885.

[19] HUANG R H， LIU X H， CAO T L，et al.Optimization of protoplasts preparation of leaves from Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees［J］.Molecular Plant Breeding，2021，19（17）：5878-5885.

[20] 胡斌盛，周纯贤，郑健云，等.穿心莲花药愈伤组织原生质体分离条件初探［J/OL］.分子植物育种，（2023-03-20）［2026-01-10］.

[21] HU B S， ZHOU C X， ZHENG J Y，et al.Preliminary study on isolation conditions of anther callus protoplasts from Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees［J/OL］.Molecular Plant Breeding，（2023-03-20）［2026-01-10］.

[22] HOU S L， LI Z Y， YI D D，et al.Establishment of a system for tissue culture regeneration and isolation of camellia yubsienensis，and PEG-mediated transient expression of mesophyll protoplasts［J］.Industrial Crops and Products，2024，222：119897.

[23] LIU Q K， LI P T， CHENG S，et al.Protoplast dissociation and transcriptome analysis provides insights to salt stress response in cotton［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（5）：2845.

[24] SINHA A， WETTEN A C， CALIGARI P D S.Effect of biotic factors on the isolation of Lupinusalbus protoplasts［J］.Australian Journal of Botany，2003，51（1）：103-109.

[25] KLIMEK-CHODACKA M， KADLUCZKA D， LUKASIEWICZ A，et al.Effective callus induction and plant regeneration in callus and protoplast cultures of Nigella damascena L.［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2020，143（3）：693-707.

[26] MASANI M Y A， NOLL G A， PARVEEZ G K A，et al.Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection［J］.PLoS One，2014，9（5）：e96831.

[27] 张曼，张叶卓，何其邹洪，等.植物细胞壁结构及成像技术研究进展［J］.生物技术通报，2023，39（7）：113-122.

[28] ZHANG M， ZHANG Y Z， HE Q Z H，et al.Advances in plant cell wall structure and imaging technology［J］.Biotechnology Bulletin，2023，39（7）：113-122.

[29] VIÑAS M， GÓMEZ-ZELEDÓN J， ACUÑA-GUTIÉRREZ C，et al.Protoplast isolation from different explant sources in pitahaya （Selenicereus costaricensis，Cactaceae）：insights from roots，callus，and shoot tissues［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2025，161（1）：17.

[30] 孙长恒.大豆不同器官原生质体制备的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2024.

[31] SUN C H.Study on preparation of protoplasts from different organs of soybean［D］.Harbin：Northeast Agricultural University，2024.

[32] CHEN G Q， LI M L， GUO X X，et al.Impact of cultivation methods and leaf age on protoplast isolation efficiency in Calibrachoa hybrida ［J］.Scientia Horticulturae，2025，350：114369.

[33] PUJARI I， THOMAS A， RAI P S，et al.Cell size：a key determinant of meristematic potential in plant protoplasts［J］.aBIOTECH，2021，2（1）：96-104.

[34] FARACO M， DI SANSEBASTIANO G P， SPELT K，et al.One protoplast is not the other！［J］.Plant Physiology，2011，156（2）：474-478.

[35] LI S F， ZHAO R， YE T W，et al.Isolation，purification and PEG-mediated transient expression of mesophyll protoplasts in Camellia oleifera ［J］.Plant Methods，2022，18（1）：141.

[36] 王丹丹，李成阳，李强.甘薯高效原生质体瞬时转化系统的建立及应用［J］.江苏农业学报，2024，40（12）：2201-2206.

[37] WANG D D， LI C Y， LI Q.Establishment and application of an efficient protoplast transient transformation system in sweet potato［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，2024，40（12）：2201-2206.

[38] YU X X， YU J T， LU Y，et al.An efficient and universal protoplast-based transient gene expression system for genome editing in Brassica crops［J］.Horticultural Plant Journal，2024，10（4）：983-994.

基金资助

广东省科技特派员项目(KTP20200137)

广州市重点研发和社会发展科技计划项目(2023B03J1273)