圆齿野鸦椿种子发育过程中综合休眠特征的建立

Establishment of Combinational Dormancy Traits during Seed Development of Euscaphis konishii Hayata

摘要

为从发育源头探究圆齿野鸦椿（Euscaphis konishii）种子综合休眠特性的形成机制，以结实盛期的植株为材料，系统分析了花后不同发育阶段种子的生长与发育进程，并测定了种子吸水率、硬实率、主要储藏物质及内源激素含量的动态变化。结果表明：（1）发育前期（花后30~60 d）种子体积迅速增长，中期（花后60~120 d）、后期（花后120~150 d）趋于稳定。花后90 d开始可观察到胚结构分化，种皮逐渐木质化，胚乳持续充实；花后120~150 d，种子外观和大小已基本稳定，但胚细胞结构仍较为致密。（2）在整个生长发育过程中，干物质含量持续增长，含水量持续下降；花后90 d硬实率开始快速升高，花后150 d达到50%以上。（3）可溶性糖含量在发育前期较高，花后90 d维持较低水平；可溶性蛋白、粗脂肪和淀粉在发育后期显著积累；α-和β-淀粉酶活性呈“降—升—降”的趋势，而过氧化物酶（POD）活性在花后90 d显著增强。（4）脱落酸（ABA）、油菜素甾醇（BR）和赤霉素（GA₃）含量整体呈“升—降—升—降”的双峰型变化趋势；生长素（IAA）、玉米素核苷（ZR）含量在发育中期显著升高；茉莉酸甲酯（MeJA）含量在花后30 d处于较高水平，IAA/ABA、ZR/ABA在花后90 d达到峰值，随后随ABA再次积累而下降。（5）主成分分析（PCA）显示，种子发育前期主要与含水量、可溶性糖含量和ABA含量相关，发育中后期主要与淀粉含量、粗脂肪含量、可溶性蛋白含量、POD活性及IAA含量相关。综上，圆齿野鸦椿种子在发育过程中，种皮结构致密化与硬实形成、碳氮储藏物质转变及激素平衡调控协同作用，促成其综合休眠特性的建立。

Abstract

To elucidate the establishment of combinational dormancy in Euscaphis konishii seeds from a developmental perspective， seeds collected from trees at the full fruiting stage were used to systematically examine seed growth and developmental progression at different post-anthesis stages. Dynamic changes in water uptake capacity， hardseededness， major storage reserves， and endogenous phytohormone contents were also analyzed. The results showed that： （1）During the early developmental stage（30-60 days after anthesis， DAA）， seed volume increased rapidly， whereas growth stabilized during the middle（60-120 DAA） and late stages（120-150 DAA）. Embryo structural differentiation became evident at 90 DAA， accompanied by gradual lignification of the seed coat and continued endosperm accumulation. At 120-150 DAA， seed size and external morphology were largely stabilized； however， embryo cells remained densely organized. （2）Throughout development， dry matter content increased steadily， while moisture content progressively declined. Hard seededness rose sharply after 90 DAA and exceeded 50% at 150 DAA. （3）Soluble sugar content was relatively high during early development but remained low after 90 DAA. In contrast， soluble protein， crude fat， and starch accumulated significantly during the later stages. Activities of α- and β-amylase exhibited a “decrease-increase-decrease” pattern， whereas peroxidase（POD） activity increased markedly after 90 DAA. （4） Abscisic acid（ABA）， brassinolide（BR）， and gibberellic acid（GA₃） displayed a biphasic pattern characterized by “increase-decrease-increase-decrease” during seed development. Auxin（IAA） and zeatin riboside（ZR） content increased significantly during the middle stage， and the ratios of IAA/ABA and ZR/ABA peaked at 90 DAA then declining with the subsequent re-accumulation of ABA. （5）Principal component analysis（PCA） indicated that early seed development was primarily associated with moisture content， soluble sugar content， and ABA content， whereas the middle-to-late developmental stages were mainly correlated with starch content， crude fat content， soluble protein content， POD activity， and IAA content. Overall， hardseed formation， shifts in carbon and nitrogen storage reserves， and coordinated hormonal regulation collectively contributed to the establishment of combinational dormancy in E. konishii seeds during development.

Graphical abstract

关键词

圆齿野鸦椿 / 种子发育 / 休眠形成 / 硬实性 / 内源激素

Key words

Euscaphis konishii / seed development / dormancy establishment / hardseededness / endogenous phytohormones

圆齿野鸦椿（Euscaphis konishii）为省沽油科（Staphyleaceae）野鸦椿属（Euscaphis）常绿小乔木^［1］，是我国南方地区特有的优良乡土树种，兼具观赏、药用和工业利用价值。其果实成熟后果皮沿背缝线反卷，形似蝴蝶，色泽鲜红，挂果期长且经冬不落，在园林绿化中具有独特的景观效果^［2-3］。研究^［4-5］表明，其根、花及果实中含黄酮类、三萜类、鞣花酸类等多种活性成分，不仅是传统中药资源，近年还被认为具有潜在的抗肿瘤药用价值^［6］。此外，其种子含油率较高，在医药及工业领域亦具开发前景。

由于圆齿野鸦椿髓部较大，扦插和嫁接繁殖效果有限，生产上主要依赖播种育苗^［7］。然而，该树种种子休眠程度深、发芽周期长，严重制约了苗木繁育效率。已有研究^［8-11］表明，其种子休眠与胚发育不完全、内源抑制物质积累及种皮透水、透气性受限等因素密切相关。目前生产中多采用采后自然沙藏层积的方法解除休眠^［7］，虽可在一定程度上提高发芽率，但处理周期长、效率低，难以满足苗木快速繁育的需求。因此，深入开展圆齿野鸦椿种子生物学特性研究，对推动该树种资源高效利用具有重要意义。

现有研究^［10-12］主要集中于圆齿野鸦椿种子休眠的解除技术及层积过程中生理指标的变化，而对休眠“从何而来”这一更为基础的问题关注不足。特别是种子在发育过程中，形态休眠（morphological dormancy，MD）、生理休眠（physiological dormancy，PD）和物理休眠（physical dormancy，PY）是否依次或协同形成，其发生时序、关键阶段及内在调控机制尚缺乏系统阐释。而种子发育过程中胚发育、营养积累、水分变化及内源激素调控与休眠形成之间的关系，是准确界定休眠类型和优化解除策略的关键科学问题^［13］。

基于此，本研究以结实盛期的圆齿野鸦椿为材料，系统采集花后不同发育阶段的种子样本，通过形态观察与解剖分析相结合，动态测定种子大小、含水量、硬实率、营养物质含量、相关酶活性及内源激素含量的变化特征，并利用主成分分析综合解析种子发育与休眠形成的内在联系，旨在从发育源头揭示圆齿野鸦椿综合休眠特性的形成过程与调控机制，为该树种休眠分级解除及高效育苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

所用圆齿野鸦椿种子采自江西农业大学风景园林实训基地（28°76′N，115°83′E），随机选取3株长势良好、无病虫害的15年生植株作为采种母株。

1.2　试验方法

1.2.1　样品采集

于花后30 d（2024年6月20日）开始第1次采样，此后每隔30 d采样一次，直至花后150 d（2024年10月20日）结束，共采样5次。每次采样覆盖植株上、中、下3层，东、西、南、北4个方位，混合后随机选取一部分种子用于形态和含水量测定，其余种子经液氮冷冻后放入冰箱-80 ℃保存，用于生理指标的测定。

1.2.2　种子形态监测

随机选取每个发育时间段的30粒种子，用数显游标卡尺测定其横纵径和厚度，并在体视显微镜下用解剖刀纵向切开种子，观察并拍照记录。

1.2.3　种子鲜质量、干质量、含水量和硬实率测定

随机选取每个发育时间段的20粒种子，用精度为0.000 1 g电子天平称量总鲜质量，然后置于烘箱中85 ℃烘干至恒质量后记录其总干质量，重复3次。

随机选取每个发育时间段的30粒种子，记录每粒种子质量后，将其放入25 ℃蒸馏水中24 h，对比浸种前后种子质量变化，计算硬实率。

种子含水量（W）和硬实率（H）计算公式如下：

W=(m_{\mathrm{f}}-m_{\mathrm{d}})/m_{\mathrm{f}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

H=S_{\mathrm{y}}/S_{\mathrm{a}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

式中：m_f表示鲜质量（g），m_d表示干质量（g），S_y表示硬实种子，S_a表示供试验种子。

1.2.4　种子储藏物质含量测定

随机选取花后30~150 d的新鲜果实，去掉果皮，得到完整的种子，用于测定储藏物质含量。其中，采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量，采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量，采用索氏抽提法^［14］测定粗脂肪含量。每个指标设置3次生物学重复。

1.2.5　种子相关酶活性测定

称取不同发育时间段的新鲜种子0.3 g，采用3，5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性。每个指标设置3次生物学重复。

1.2.6　种子激素含量测定

随机称取每个发育时间段的种子0.5 g，重复称取3份，用液氮研磨成粉末后分别装入10 mL离心管中。将样品送至北京北农天一生物科技有限公司，使用超高效液相色谱仪测定样品的激素含量，包括脱落酸（ABA）、赤霉素（GA₃）、生长素（IAA）、油菜素甾醇（BR）、茉莉酸甲酯（MeJA）及玉米素核苷（ZR）。

1.3　数据处理

采用Microsoft Office Excel 2019软件进行数据处理，采用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和主成分分析（PCA），采用Origin 2024、Adobe Photoshop 2020软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1　发育过程中种子大小变化

种子大小通常用籽粒的平均纵径、横径、厚度或千粒质量表示。本研究结果表明，圆齿野鸦椿种子的纵径、横径、厚度、近似体积及质量均在花后30~60 d显著快速增长，之后变化较平缓（图1）。

2.2　发育过程中种子形态和结构变化

圆齿野鸦椿种子在花后不同发育时期，其内部结构发生了明显变化（图2A~2E）。花后30 d，种子内部主要由珠被和胚乳构成，尚未观察到明显分化的胚结构，外种皮较薄（图2A）。花后60 d，胚乳膨胀，胚开始分化但仍不明显（图2B）。花后90 d，胚乳进一步充实，胚的形态开始清晰，胚乳与胚的界限逐渐分明，种皮逐渐加厚，可见输水通道（图2C）。花后120 d，胚显著增大，种皮木质化程度增强（图2D）。花后150 d，种子内可见子叶胚，胚乳紧密包裹于胚周围，种皮结构致密（图2E）。

石蜡切片结果显示，圆齿野鸦椿种子在不同发育阶段胚与胚乳的组织结构和发育程度存在显著差异（图3）。花后30 d，胚处于早期发育阶段，体积较小，尚未形成明显的器官分化，仅可区分原始胚体轮廓；此时胚乳细胞排列相对疏松，细胞壁较薄，细胞质丰富。花后60 d，胚开始由原胚向轴状结构分化，胚轴和胚根区域轮廓逐渐显现，但整体发育程度仍较低；胚乳细胞数量和体积明显增加，胚被完全包埋于胚乳组织之中。花后90 d，胚进一步伸长，轴向结构更加清晰。花后120~150 d，胚在形态上已基本伸长并贯穿胚乳，形成较为完整的轴向结构，但胚细胞结构仍较为致密。

2.3　发育过程中种子含水量和硬实率变化

发育过程中圆齿野鸦椿种子含水量持续下降，花后30~90 d，含水量从（90.02±0.30）%降至（51.77±0.43）%；花后150 d，种子含水量下降至（28.64±1.40）%（图4A）。花后90 d及之前的种子无硬实，之后发育阶段的种子硬实率逐渐升高，花后150 d种子硬实率达到（54.44±0.10）%（图4B）。

2.4　发育过程中种子储藏物质含量变化

在花后30~150 d 的发育过程中，圆齿野鸦椿种子内主要储藏物质含量呈现出明显的阶段性变化特征（图5）。可溶性糖含量在花后30 d、60 d时显著高于其他时期，随后在花后90~120 d明显下降，花后150 d略有上升，但整体仍低于发育早期水平（图5A）。种子内淀粉、可溶性蛋白和粗脂肪含量则在发育前期较低，在发育后期逐渐增加（图5B、5C）。具体表现为淀粉和粗脂肪含量在花后30~60 d较低，花后90 d开始显著增加，花后120~150 d 进一步升高，并在花后150 d 达到峰值（图5B、5D）。可溶性蛋白含量在花后30~90 d维持在较低水平，花后120 d起迅速增加，花后150 d达到最高值，显著高于此前各阶段（图5C）。

2.5　发育过程中种子相关酶活性变化

圆齿野鸦椿种子在发育过程中，与物质代谢及氧化还原调控相关的酶活性也呈现明显的阶段性变化特征（图6）。α-淀粉酶和β-淀粉酶活性在花后30 d处于较高水平，在花后60 d明显下降。2种淀粉酶活性在花后90~120 d出现一定程度的回升，其中花后120 d达到相对较高值，花后150 d再次降低。过氧化物酶（POD）活性在花后30~90 d维持在较低水平，变化幅度较小；花后120 d起显著升高，花后150 d达到最高值，呈现出明显的后期增强趋势。

2.6　发育过程中种子内源激素含量变化

圆齿野鸦椿种子在花后30~150 d的发育过程中，主要内源激素含量及其比值的阶段性变化如图7所示。ABA、BR和GA₃含量均呈现“升—降—升—降的“M”型变化趋势，即在发育前期（花后30~60 d）处于较高水平，随后在90 d时显著下降，花后120~150 d有所回升，但仍显著低于发育早期的水平。IAA和ZR含量总体随发育进程升高，90 d 以后维持在较高水平。MeJA含量在发育前期（花后30 d）处于较高水平，随后在花后60~90 d显著下降，自花后120 d起显著升高，并在150 d达到最高值。

激素比值分析表明，GA₃/ABA在整个发育过程中逐渐升高，花后150 d达到最高值；IAA/ABA和ZR/ABA均在发育前期（30~60 d）处于较低水平，花后90 d显著升高并达到峰值，随后在花后120~150 d明显下降，显示种子发育中期（60~120 d）促进IAA相对于ABA的比例达到最高。

2.7　发育过程中种子生长发育指标主成分分析

主成分分析结果表明，前2个主成分累计解释76.4%的总变异（PC1为50.1%，PC2为26.3%）（图8）。不同发育时期的种子样本在PCA空间中沿PC1轴呈现明显的阶段性分离。从变量载荷分布看，PC1正轴主要与淀粉含量、粗脂肪含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及IAA含量呈正相关，而PC1负轴则主要与含水量、可溶性糖含量和ABA含量相关。对应地，花后30~60 d种子样本主要分布于PC1负轴区域，而花后90~150 d样本逐渐向PC1正轴方向偏移并集中分布，反映种子由高含水量、高ABA含量状态向以物质积累和成熟相关特征为主的生理状态转变。

3 讨 论

3.1　圆齿野鸦椿种子发育过程中的形态建成与胚发育特征

种子外部形态建成是判断其发育阶段和生理成熟程度的直观指标^［15-16］。本研究中，圆齿野鸦椿种子的纵径、横径、厚度及近似体积在花后30~60 d快速增长，随后趋于稳定，表明该阶段为种子形态建成的关键时期。解剖结构观察显示，花后30~60 d，种子内部以胚乳组织为主，胚体逐渐形成并分化。花后120~150 d，种子外观和体量已基本稳定，胚在长度上已明显伸长并贯穿胚乳，形成完整轴向结构，各器官形态基本具备，但细胞排列较为致密，组织结构紧密。在具有PD特征的种子中，成熟散布时胚虽形态完整，但代谢活性较低，需经过一定时期的后熟或环境调节方可萌发^［13］。因此，圆齿野鸦椿种子成熟阶段的形态特征符合PD类型种子在脱离母体时的典型表现，并可能在其复合休眠形成过程中发挥关键作用。

3.2　圆齿野鸦椿种子发育过程中含水量下降与硬实形成

种子含水量的变化是反映种子成熟进程和休眠形成的重要生理指标之一^［17］。一般认为，随着种子由发育态向成熟态转变，其含水量逐渐下降，并伴随种皮结构和功能的显著变化^［18-19］。本研究中，圆齿野鸦椿种子在发育过程中含水量持续下降，花后30~90 d降幅较大，花后150 d降至30%以下，表现出典型的成熟期脱水特征。

与含水量变化相对应，圆齿野鸦椿种子的硬实率在花后90 d之前几乎为零，此后随发育进程显著升高，并在花后150 d（形态成熟期）达到50%以上，表明花后约90 d是圆齿野鸦椿种子硬实性开始形成的关键时间节点。硬实率随种子成熟度的提高而增加，说明圆齿野鸦椿种子在发育后期逐步获得限制吸水的能力。结合解剖结构观察结果可见，随着发育进程推进，圆齿野鸦椿种皮逐渐加厚且木质化程度增强，暗示种皮结构致密化可能与种子的透水性密切相关。已有研究^{［13，20］}指出，PY是由种皮或果皮形成稳定的不透水屏障所引起的，其典型特征是成熟种子中出现不同程度的硬实性。因此，圆齿野鸦椿种子在发育后期表现出含水量显著下降、硬实率升高及种皮结构致密化等特征，表明其PY特性是在种子成熟过程中逐步建立的，这为后续解析其PY解除机制提供重要依据。

3.3　圆齿野鸦椿种子发育过程中储藏物质的积累与代谢

种子发育过程中营养物质的动态变化反映了其由生长型代谢向储藏型代谢、由高代谢活性向休眠准备状态的转变^［21］。已有研究^［16］表明，在多数被子植物中，发育早期种子以可溶性糖作为主要碳源，以满足细胞分裂和组织建成的能量需求；而在发育中后期，碳流逐渐转向淀粉、脂类和蛋白等储藏物质的合成与积累，这是种子进入成熟阶段的典型特征。

本研究中，圆齿野鸦椿种子在发育早期可溶性糖含量较高，而淀粉、粗脂肪和可溶性蛋白含量较低，表明该阶段以生长和结构建成为主。自花后90 d起，淀粉、粗脂肪和蛋白质含量迅速增加，并在发育后期达到较高水平，说明圆齿野鸦椿种子已由生长状态转入以储藏物质沉积为主的成熟阶段，为后续萌发提供物质基础。α-和β-淀粉酶主要参与淀粉的水解和可溶性糖的生成^［22-23］，两者在发育早期活性较高，而在发育中后期下降，进一步反映了这一生理转变过程。与此同时，POD活性在发育后期显著增强。POD活性升高通常与细胞壁加固、抗氧化能力提升及组织结构稳定性增强有关^［24］；其变化进一步说明，圆齿野鸦椿种子在发育后期已具备PD和PY休眠的基础条件。

3.4　圆齿野鸦椿种子发育过程中内源激素的变化

内源激素通过协同与拮抗作用调控种子发育进程及休眠形成，其中ABA与GA构成休眠—萌发调控的核心信号轴，而IAA和CTKs主要参与胚的生长潜能建立^{［16，25］}。

本研究中，圆齿野鸦椿种子ABA含量在发育早期（花后30~60 d）维持在较高水平，花后90 d明显下降，并在花后120~150 d再次回升，呈现双峰型变化。类似的ABA双峰积累模式已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［26］、油菜（Brassica napus）^［27］和小麦（Triticum aestivum）^［28］等多种植物中被报道，其中发育初期的ABA主要来源于母体组织，其具有抑制早熟萌发和促进脱水耐受性的作用，而成熟后期由胚自身合成的ABA则被认为与休眠的诱导和维持密切相关。与ABA变化相对应，GA₃/ABA在整个发育过程中持续升高，并在花后150 d达到最高值。在种子发育过程中，GA不仅参与α-淀粉酶的诱导和储藏物质动员，还与胚潜在生长能力的建立密切相关^［29-30］。这些结果表明，在圆齿野鸦椿种子发育过程中，GA更可能参与维持胚的潜在生长能力，而非直接触发萌发过程。IAA和ZR通常与细胞分裂、细胞伸长及组织分化相关，并正向调控GA合成^［31-32］。本研究中，IAA和ZR在发育中期显著升高，其与ABA的比值（IAA/ABA、ZR/ABA）在花后90 d达到峰值，随后随ABA再次积累而下降，说明它们主要作用于胚的结构建成与生长。

PCA分析进一步表明，ABA与含水量主导圆齿野鸦椿种子发育早期阶段，而IAA、储藏物质及POD活性则与发育后期密切相关，说明激素调控与种子脱水进程、储藏物质积累及结构成熟协同进行。综合来看，尽管成熟过程中促生长激素信号逐步增强，但在ABA主导的调控背景下，圆齿野鸦椿种子在结构、代谢和激素层面共同建立起一个稳定的综合休眠状态。

4 结 论

本研究系统揭示了圆齿野鸦椿种子在发育过程中由形态建成向休眠建立转变的关键生理特征。研究表明，种子在外观形态和体积上较早达到稳定状态，成熟阶段胚形态完整但组织结构致密、代谢活性较低，表现出PD特征；随着发育推进，种子含水量显著下降，种皮结构致密化及硬实率快速升高，表明PY特征在成熟后期逐步建立。同时，碳、氮储藏物质由可溶性形式向稳定形式转变，淀粉酶活性降低而过氧化物酶活性增强，反映种子由生长型代谢向休眠准备状态转变。在此过程中，ABA在发育早期和成熟后期起主导作用，GA、IAA和ZR在中后期阶段性积累，为休眠状态的稳定与维持提供内源调控基础。本研究从发育过程角度解析了圆齿野鸦椿种子综合休眠特征的建立规律，为其休眠调控与繁育利用提供理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(32360420)

江西省自然科学基金项目(20212BAB215014)

江西省研究生创新资金项目(YC2023-S353)