夏蜡梅属(
Calycanthus)隶属于蜡梅科(Calycanthaceae),包含3种1变种,分别为夏蜡梅(
C. chinensis)、美国蜡梅(
C. floridus)、西美蜡梅(
C. occidentalis)以及美国蜡梅的变种光叶红蜡梅(
C. floridus var.
oblongifolius)。其中,夏蜡梅仅分布于我国浙江临安、天台等地,分布范围狭窄且数量稀少,被列为国家二级保护植物
[1],其余种类则分布于美国。夏蜡梅属植物不仅具有较高的观赏价值,其植物化学组成与挥发成分中还含有多种药用活性物质。夏蜡梅叶富含生物碱、总皂苷、黄酮等次生药用代谢物质
[2-5],对感冒、咳嗽及气喘具有一定的疗效。其叶挥发油成分主要包括倍半萜类、桉叶油醇类和乙酸龙脑酯等
[6],而嫩梢的主要挥发性成分为醇类(1-壬烯-4-醇、正己醇)、醛类(2-己烯醛、正己醛)和酯类(左旋乙酸冰片酯)
[7]。美国蜡梅嫩梢的主要挥发性成分则为左旋乙酸冰片酯、水芹烯与榄香醇
[7],光叶红蜡梅茎蒸馏所得精油以1,8-桉油醇、乙酸龙脑酯、单萜(
α-蒎烯、
β-蒎烯)为主
[8],其叶精油成分中还含有2-甲基丁酸异冰片酯、乙酸龙脑酯和莰烯等
[9]。
花香是园林植物重要的观赏性状之一,其源于花朵释放的一系列低分子量、低沸点的挥发性化合物。这些物质的组成与比例共同塑造了花香的感官体验与美学价值。目前,部分常见园林植物的花香成分已被鉴定。例如,丁香属(
Syringa)植物的花香以
β-罗勒烯为主要成分
[10];木樨属桂花(
Osmanthus fragrans)的花香成分包括
β-紫罗兰酮、反-
β-罗勒烯和芳樟醇等
[11];蔷薇属玫瑰(
Rosa rugosa)则以
β-香茅醇、香叶醇、橙花醇、乙酸香茅酯和乙酸正己酯等为主要香气成分
[12];而梅花(
Prunusmume)香气则主要由乙酸苯甲酯和丁子香酚构成
[13]。花香挥发物的组成与含量在花朵发育的不同阶段变化显著,并且在不同基因型品种间也存在明显差异,因此,独特的花香已成为植物的重要特征性状
[12,14]。
夏蜡梅的花感官体验中闻不到香气,但美国蜡梅、西美蜡梅及其与夏蜡梅杂交品种的花却具有迷人的果香。其中,美国蜡梅的花香被形容为“草莓、苹果和凤梨香气的复合体”,与同科的蜡梅属花香明显不同。目前,关于夏蜡梅属植物花香的研究较少,仅有对光叶红蜡梅花香成分测试的报道
[15]。
为探讨夏蜡梅属植物的花香化学成分,以及不同种质资源花香成分的多样性,本研究采用顶空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS- SPME)与静态顶空法(headspace sampling,HS)结合气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术,对夏蜡梅属9个不同种及品种的花香成分进行系统性分析。旨在明确夏蜡梅属植物的特征香气物质,比较不同种及品种间花香成分与含量的差异,并基于花香成分数据进行聚类分析,探究其系统分类关系,以期为夏蜡梅属植物在芳香园林应用及精油产品的开发与经济价值评估提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取9种夏蜡梅属植物(
表1,
图1),包括夏蜡梅、美国蜡梅、美国蜡梅‘雅典’(‘Athens’),以及杂交品种‘美夏’(‘Meixia’)、‘粉灿’(‘Fencan’)、‘小蝶’(‘Xiaodie’)、‘红运’(‘Hongyun’)、‘红笑’(‘Hongxiao’)、‘维纳斯’(‘Venus’)。其中,‘美夏’‘粉灿’‘小蝶’是以美国蜡梅为母本、夏蜡梅为父本的杂交品种;‘红运’为上述品种的反交品种;‘红笑’是以美国蜡梅‘雅典’为母本、夏蜡梅为父本的杂交品种;‘维纳斯’为夏蜡梅、西美蜡梅与美国蜡梅‘雅典’的复合杂交品种。
采样地点位于上海市奉贤区的上海市园林科学规划研究院实验基地(31°14′N,121°29′E)。所选植株的高为1.4~2.0 m,冠幅为1.0~1.5 m。样品采集时间为2024年4月26日—5月16日,选择晴朗天气的上午,采集花蕾初绽时期的花朵。采集后的样品立即置于密封袋中封存,并迅速送往上海交通大学芳香植物研发中心实验室进行测定。
1.2 测定方法
HS-SPME:取3朵花放入采样瓶,并用封口膜密封瓶盖,平衡10 min后,将固相微萃取纤维头(SPME,美国Supelco公司)插入采样瓶内花朵上方2 cm处的采样瓶中吸附20 min。吸附完成后,将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,7890B-5977A,美国安捷伦公司)的进样口进行分析,每组试验平行重复3次。其中,GC-MS分析条件设置如下:色谱柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),载入氦气(99.999%),流速1.2 mL·min-1;起始柱温50 ℃,保持3 min,以4 ℃·min-1升至180 ℃,保持2 min,然后以20 ℃·min-1升温至220 ℃,保持2 min,离子源温度为230 ℃。
HS:取3朵花置于顶空进样瓶中,并用硅胶垫密封瓶口,送入自动顶空进样仪(美国安捷伦公司),于45 ℃条件下预热并平衡30 min后取样,导入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,7890B-5977A,美国安捷伦公司)进行分析,以分流比30∶1分流进样。色谱条件:色谱柱为HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度260 ℃;柱温起始温度50 ℃,保持3 min,4 ℃·min-1升温到180 ℃,保持2 min,再以20 ℃·min-1升温到260 ℃。载入氦气(99.999%),流速1.6 mL·min-1。质谱条件:电离方式EI+,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃。将采集到的质谱图经计算机谱库(NIST MS Search)检索,结合保留时间计算化合物的保留指数,并进行相关资料分析,鉴定出样品中挥发性成分组成,利用峰面积归一法,得出各组分的相对含量。
1.3 数据处理
测试完成后,用Simca 18.0.1软件对花香成分的含量值进行主成分分析,用R语言pheatmap包1.0.12计算欧式距离矩阵,以完全连锁方法对代谢物进行聚类,绘制层次分析聚类热力图。
2 结果与分析
2.1 夏蜡梅属植物花香成分分析
2.1.1 顶空固相微萃取法(HS-SPME)
采用HS-SPME对夏蜡梅属9种植物花朵的挥发性成分进行分析,共鉴定出63种化合物,主要包括萜烯类、酯类,以及部分烷烃、醇类、醛类和酮类(
表2)。其中,夏蜡梅、美国蜡梅及美国蜡梅‘雅典’分别检测到16种、21种和23种挥发性成分。夏蜡梅花香成分中,烷烃类化合物占比最高(49.29%),其次为萜烯类及其衍生物(14.54%)。以相对含量大于5%作为主要挥发性成分的划分标准,夏蜡梅的主要挥发性成分为2,4-二甲基庚烷(18.92%)、正癸烷(7.79%)和
α-蒎烯(7.64%)。相较之下,美国蜡梅及美国蜡梅‘雅典’的花香成分中酯类化合物占比较大,分别为69.16%和94.03%。其中,美国蜡梅以乙酸乙酯为主(63.22%),其他主要成分有乙醇(9.06%)和3-羟基-2-丁酮(5.23%);而美国蜡梅‘雅典’则以乙酸异丁酯(27.89%)为主,其次为乙酸乙酯(25.46%)、丁酸乙酯(22.99%)和异丁酸乙酯(7.21%)。
在杂交品种中,以夏蜡梅为母本、美国蜡梅为父本的‘红运’及其反交组合‘美夏’‘粉灿’‘小蝶’分别检出24种、16种、23种和16种挥发性成分。其中,‘红运’酯类含量最高(61.42%),以乙酸乙酯为主(59.06%),其他主要成分为α-蒎烯(9.56%)、β-月桂烯(9.27%)和β-蒎烯(6.13%)。反交品种中,‘粉灿’和‘小蝶’的酯类含量相对较低,乙酸乙酯占比分别为23.87%和49.98%;‘美夏’中未检测到酯类成分,但萜烯类化合物占比较高,包括β-月桂烯(27.23%)、莰烯(15.12%)、β-罗勒烯(14.56%)和α-蒎烯(14.87%)。夏蜡梅与美国蜡梅‘雅典’的杂交品种‘红笑’共检出31种成分,主要挥发性成分依次为乙酸乙酯(38.76%)、β-罗勒烯(14.49%)和β-月桂烯(14.04%)。三亲本复合杂交品种‘维纳斯’(夏蜡梅×西美蜡梅×美国蜡梅‘雅典’)共检出25种成分,其中α-水芹烯含量最高(22.69%),其次为乙酸异丁酯(22.61%)、乙酸乙酯(20.34%)和乙酸异戊酯(15.22%)。
综上,夏蜡梅属植物花香物质的组成在种与品种间存在显著差异,主要成分种类及其含量也各具特征。美国蜡梅及其与夏蜡梅的杂交后代(如‘小蝶’‘红运’‘红笑’)的花香主要来源于酯类物质,尤以乙酸乙酯为主;而美国蜡梅‘雅典’则以乙酸异丁酯(27.89%)、乙酸乙酯(25.46%)和丁酸乙酯(22.99%)为主,酯类组成最为丰富。
2.1.2 静态顶空法(HS)
采用HS对9种夏蜡梅属植物花朵进行分析,共检出48种挥发性成分,其中以萜烯类和酯类为主,另有少量醇类、酮类和酸类(
表3)。与HS-SPME结果不同,HS未检出烷烃类化合物。夏蜡梅、美国蜡梅及美国蜡梅‘雅典’分别检出5种、21种和23种成分。夏蜡梅花香成分以萜烯类及其衍生物占绝对优势(73.84%),其中
α-蒎烯含量最高(45.72%),其次为莰烯(12.08%)、
β-月桂烯(10.83%)、柠檬烯(5.21%),酯类中仅检出乙酸冰片酯(5.28%)。与HS-SPME结果一致,美国蜡梅及美国蜡梅‘雅典’仍以酯类为主,其相对含量分别为57.28%和82.28%。美国蜡梅中乙酸乙酯占比达54.81%,另含醇类(18.96%)、萜烯类(13.31%)和酮类(8.11%);美国蜡梅‘雅典’中酯类以乙酸乙酯(46.66%)、乙酸异丁酯(18.81%)和丁酸乙酯(8.02%)为主,萜烯类占14.95%。
杂交品种‘红运’‘美夏’‘粉灿’‘小蝶’分别检出14种、12种、15种和13种成分。其中,‘红运’和‘粉灿’中酯类含量高于萜烯类(分别为67.04%和46.53%),且以乙酸乙酯为主(65.74%和37.02%);而‘美夏’和‘小蝶’则以萜烯类为主(63.95%和46.98%);‘红笑’和‘维纳斯’中萜烯类相对含量较高(分别为59.48%和54.43%),酯类分别为30.45%和31.16%,且以乙酸乙酯占绝对优势(29.63%和22.69%)。两者在萜烯组成上存在明显差异:‘红笑’以β-罗勒烯为主(37.55%),该特征可能遗传自母本美国蜡梅‘雅典’;‘维纳斯’则以α-水芹烯为主(43.01%),推测此特征来源于亲本西美蜡梅。
HS-SPME作为一种富集型采样技术,具有无需溶剂、对痕量物质敏感的优势;而HS法则直接采集顶空气体,更能反映自然状态下的香气释放。综合2种方法的结果,9种夏蜡梅属植物共检出74种挥发性成分,其中HS-SPME法检出63种,HS法检出48种。2种方法共有的成分为36种;HS-SPME独有27种,包括8种萜烯类(如反式-石竹烯、δ-榄香烯等)、1种醇类(芳樟醇)、1种酮类(2-乙酰氧基-3-丁酮)、5种酯类(如乙酸丙酯、乙酸叶醇酯等)及12种烷烃类;HS独有12种,包括1种萜烯类(大根香叶烯)、3种醇类(如桉叶油醇)、5种醛类(如丁醛、壬醛等)、3种酯类(如乙酸芳樟酯)及2种其他化合物(异丁腈、对伞花烃)。HS法未检出烷烃类化合物,表明2种方法对挥发物的富集存在一定偏好性。
综上所述,夏蜡梅花香成分以烷烃类(HS-SPME)或萜烯类(HS)为主,而美国蜡梅及其品种花香则以酯类为主。杂交品种中酯类成分主要来源于美国蜡梅或美国蜡梅‘雅典’。以相对含量均值评估,酯类含量由高到低依次为‘红运’‘维纳斯’‘红笑’‘粉灿’‘小蝶’‘美夏’。部分杂交品种中萜烯类成分显著富集,如‘维纳斯’中的α-水芹烯、‘红笑’中的β-罗勒烯、‘美夏’中的β-月桂烯,这些成分均与其香气特征密切相关,共同构成了各品种独特的香型。
2.2 夏蜡梅属植物花香成分PCA分析
基于HS-SPME和HS测定的夏蜡梅属植物花香成分结果,进行PCA分析。结果显示,9种夏蜡梅属植物均相互分离,这表明不同种(品种)间花香物质组成存在明显差异(图
2A、
2B)。HS-SPME测试结果显示,夏蜡梅与其他种类挥发性成分差异最大,其次为‘美夏’和‘粉灿’,而‘小蝶’、美国蜡梅‘雅典’‘红运’‘维纳斯’‘红笑’与美国蜡梅的相似度更高。HS测试结果表明,夏蜡梅与‘红笑’‘维纳斯’的花香成分差异较大,而美国蜡梅及美国蜡梅‘雅典’‘红运’与‘粉灿’间花香成分相似度较高。
2.3 夏蜡梅属植物花香物质组成聚类分析
分别采用HS-SPME与HS对夏蜡梅属花香成分进行聚类分析,并绘制热图(图
3A、
3B)。HS-SPME聚类分析结果显示,‘红笑’单独聚为一类,与其他夏蜡梅属植物相分离,主要原因在于‘红笑’品种含有其他夏蜡梅属植物所不具备的萜烯类化合物,如
δ-榄香烯、
β-榄香烯、大根香叶烯等。另一大类包含夏蜡梅、美国蜡梅、美国蜡梅‘雅典’及杂交品种,其中夏蜡梅与美国蜡梅‘雅典’首先聚在一起,与美国蜡梅、‘红运’‘小蝶’‘维纳斯’及‘美夏’‘小蝶’组成的另一类相分离。从化合物成分来看,每种植物均有区别于其他植物的特异性成分,例如夏蜡梅中的2,4-二甲基庚烷等烷烃类化合物,以及美国蜡梅‘雅典’中的丁酸乙酯等酯类物质。
HS分析聚类结果呈嵌套式分布,‘美夏’与‘小蝶’最先聚类,随后与相同杂交组合的‘粉灿’相聚类。三者均含有较多的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯等萜烯类物质,因此亲缘关系最近,花香物质组成也最为接近,且与父本夏蜡梅的花香气体挥发物成分更为相似。而反交品种‘红运’则更接近于母本美国蜡梅,含有较高的乙酸乙酯等酯类化合物。在此之后,‘红笑’与‘维纳斯’依次被聚类,最后与美国蜡梅‘雅典’聚为一类。美国蜡梅‘雅典’与其他品种的相似度最低,原因在于其含有其他植物中未检测到或含量极少的酯类物质,如乙酸异丁酯、丁酸乙酯、异丁酸乙酯等。综合2种方法测试的夏蜡梅属花香成分比较,HS测试结果更接近于所测夏蜡梅属植物的亲缘关系,可更好地反映出自然状态下夏蜡梅属植物花挥发物成分的差异。
3 讨论
本研究采用HS-SPME与HS结合GC-MS技术,对9种夏蜡梅属植物的花香成分进行了分析,共分离并鉴定出74种挥发性成分,主要为萜烯类和酯类化合物。代表性萜烯类成分包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和β-罗勒烯;酯类成分中,乙酸乙酯占绝对优势,同时检出少量乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和丁酸乙酯等。
与同科蜡梅属(
Chimonanthus)植物相比,夏蜡梅属的花香物质组成存在显著差异。蜡梅属挥发物以萜烯类为主,尤其是罗勒烯,同时含有少量酯类、酚类和醇类物质
[16],其独特香气可能源于罗勒烯型化合物,以及萜烯、酯、醇和烷烃等类别的含量与比例变化
[17]。夏蜡梅属中,不同物种的花香组成有所不同
[18]:夏蜡梅挥发物以萜烯和烷烃类为主,感官体验几乎无香气;而美国蜡梅及其芽变或杂交品种则具有明显的果香,主要来源于以乙酸乙酯为代表的酯类挥发物。美国蜡梅中乙酸乙酯占绝对优势,其变种光叶红蜡梅的花香成分则主要为丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯
[15]。相比之下,美国蜡梅的芽变品种‘雅典’酯类组成更为丰富,除乙酸乙酯外,还含有乙酸异丁酯、丁酸乙酯和异丁酸乙酯等,可呈现出苹果、草莓、菠萝和香蕉等混合果香。
杂交后代的香气成分变化呈现多样化。杂交品种‘红笑’带有母本美国蜡梅‘雅典’乙酸乙酯的花香成分,但其他酯类成分较少;‘维纳斯’作为美国蜡梅‘雅典’、夏蜡梅和西美蜡梅的复合杂交后代,带有亲本之一美国蜡梅‘雅典’的乙酸异丁酯与乙酸异戊酯香气成分,使其成为夏蜡梅属中酯类挥发物较丰富的品种之一。同时,其高含量的α-水芹烯在亲本之一的夏蜡梅和美国蜡梅‘雅典’中均未检出或含量极低,推测可能源自另一亲本西美蜡梅。在夏蜡梅与美国蜡梅的杂交后代中,‘红运’酯类相对含量最高,‘美夏’酯类含量极低,‘粉灿’与‘小蝶’处于中等水平。尽管‘美夏’酯类含量极低,但其萜烯类成分却是所测材料中最高的,甚至超过了亲本夏蜡梅。
植物花的香气具有种和品种的特异性,因此常被用作植物分类的重要标记化合物
[19],并在不同品种类群间表现出显著差异,进而成为品种鉴别的重要依据
[14]。已有研究
[20]表明,基于花香成分色谱指纹图谱的相似度分析,能够有效区分不同桂花品种。本研究发现,同一类群或亲缘关系较近的种或品种,其花香成分更为相似。此外,花香成分的差异可能影响传粉昆虫的偏好,从而对物种进化产生重要影响,具有重要的生物学意义
[21]。因此,花香也成为夏蜡梅属种类间的特异标志。另有研究
[22]表明,花香与花色之间存在一定关联,本研究中黄色花品种美国蜡梅‘雅典’和白色花品种‘维纳斯’在花香成分上与开红花的美国蜡梅差异显著,也印证了这一特性。然而,花香与花色形成的深层遗传机制仍需从代谢组学角度进一步解析。
总体而言,在夏蜡梅属植物中,美国蜡梅‘雅典’及美国蜡梅的酯类挥发物含量较高,其余品种按酯类含量由高到低依次为‘红运’‘维纳斯’‘红笑’‘小蝶’‘粉灿’‘美夏’。美国蜡梅及其品种中富含的乙酸乙酯,除可作为香料添加剂广泛用于糖果、饮料及烘焙食品中以提升果香风味外,也是日化产品中常用的优良溶剂。目前,国外市场已出现基于美国蜡梅香气的香水产品,而国内在该属植物精油的提取与加工技术方面仍有待加强研究。此外,美国蜡梅‘雅典’‘红笑’‘维纳斯’等品种除含有乙酸乙酯外,还富集乙酸异丁酯、丁酸乙酯、β-罗勒烯和α-水芹烯等成分,进一步丰富了花香的层次感。未来需进一步探究花香成分的时空动态变化规律,为芳香疗愈花园的植物选择与配置提供科学依据。
国家林业和草原局生物安全与遗传资源管理专项(KJZXSA202308)
上海市绿化和市容管理局科研专项(G220202)