杨树C2H2型锌指转录因子PtrZAT11在木材形成中的功能

The Role of the Poplar C2H2 Zinc Finger Transcription Factor PtrZAT11 in Wood Formation

摘要

为探究C2H2型锌指转录因子PtrZAT11在杨树木材形成过程中的分子功能，本研究通过RT-qPCR分析PtrZAT11在毛果杨（Populus trichocarpa）不同茎节木质部的表达模式，利用PEG介导的原生质体瞬时转化系统观察PtrZAT11-GFP融合蛋白的亚细胞定位，采用CRISPR-Cas9技术创制PtrZAT11及其同源基因PtrZAT11h的双突变体，并对突变体进行生长指标测定及茎解剖结构分析。结果表明：PtrZAT11在次生生长阶段的茎节中显著高表达，其蛋白定位于细胞核。与野生型相比，ptrzat11 ptrzat11h双突变体株高增加约31.5%，茎节数量显著增多，但地径和节间长度无显著差异；突变体第12茎节木质部环带宽度及木质部细胞面积占比均显著降低，单位面积纤维细胞数量减少、导管细胞数量增多。PtrZAT11作为核定位转录因子，参与杨树木材形成过程，通过影响木质部细胞的分化数量来调控木质部组织结构，并可能协调植株初生生长与次生生长之间的平衡。

Abstract

This study aimed to investigate the molecular function of the C2H2-type zinc finger transcription factor PtrZAT11 in the process of wood formation in poplar. The expression pattern of PtrZAT11 in the xylem at different stem internodes of Populus trichocarpa was analyzed by RT-qPCR. The subcellular localization of the PtrZAT11-GFP fusion protein was observed using a PEG-mediated protoplast transient transformation system. A double mutant of PtrZAT11 and its homologous gene PtrZAT11h was generated using CRISPR-Cas9 technology. Growth parameters and stem anatomical structures of the mutant were subsequently analyzed. The results indicated that PtrZAT11 was significantly highly expressed in stem internodes during the secondary growth stage， and its protein was localized in the nucleus. Compared with the wild type， the ptrzat11 ptrzat11h double mutant exhibited an approximately 31.5% increase in plant height and a significant increase in the number of stem internodes， while no significant differences were observed in ground diameter or internode length. In the 12th internode of the mutant， the width of xylem ring and proportion of xylem cell area were significantly reduced. Additionally， the number of fiber cells per unit area decreased， whereas the number of vessel cells increased. As a nuclear-localized transcription factor， PtrZAT11 participates in wood formation in poplar by influencing the differentiation quantity of xylem cells to regulate xylem tissue organization. It may also coordinate the balance between primary and secondary growth in poplar.

木材作为地球上最重要的可再生资源之一，在人类社会发展和生态系统中占据着不可替代的核心地位。木材形成是木本植物生长发育的核心过程之一，其主要涉及维管形成层的持续分裂与分化，最终形成次生木质部这一复杂的生物学结构。这一过程不仅直接影响植物的机械支撑、水分运输和养分储存等功能，更是森林生态系统生物量和碳汇的主要来源^［1-2］。木材形成受到严格的遗传调控和环境影响，其分子机制的研究对理解林木生长发育规律及进行林木遗传改良具有重要意义^［3］。

在木材形成的复杂调控网络中，转录因子发挥着至关重要的作用^［4］。已知NAC、MYB、bHLH、WRKY和C2H2锌指蛋白等家族，通过形成复杂的层级调控网络，分别调控木质部细胞分化的启动、次生壁合成，影响木质素、纤维素和半纤维素的生物合成等过程，精确控制木材形成过程^［5-12］。其中，C2H2型锌指蛋白是植物中最大的转录因子家族之一，其成员通过保守的C2H2结构域与DNA特异性结合^［13］，参与植物生长发育、激素响应、逆境适应等过程^［14］。IDD类型的C2H2锌指转录因子PagIDD15A，被证实正向调控杨树（Populus）次生壁加厚和木质素合成^［11］。茶树（Camellia sinensis）中的一个C2H2家族成员CsWIP3，过表达该基因会显著增加木质素的积累^［12］。该家族中属于C1-2i亚类的ZAT（zinc finger of Arabidopsis thaliana）转录因子ZAT11作为转录抑制子，负调控镍离子耐受性并参与调节氧化应激诱导的细胞程序性死亡^［15-16］；与之相反，拟南芥的ZAT6作为正调控因子协调磷稳态与根发育^［17］；而ZAT10则展现出复杂的功能可塑性，其功能获得与功能缺失突变体均能增强植物对非生物胁迫的耐受性，提示其可能作为枢纽因子整合多重信号^［18］。这些研究表明，即使在同一亚类中，C2H2锌指转录因子也可扮演正调控因子、负调控因子甚至双重调控因子等角色，其功能高度依赖于具体的生物学过程与遗传背景。

在木材形成过程中，ZAT14亚家族作为C2H2型锌指蛋白的重要成员，在木质部发育中的调控作用已被进一步揭示。该亚家族包含ZAT14、ZAT5、ZAT14L和ZAT15四个同源基因，均在拟南芥的木质部细胞中特异性表达。遗传学证据显示，zat多突变体呈现出明显的原生木质部导管发育不连续的表型，异位木质部形成显著减少且根中出现木质部间隙细胞，证明这些ZATs在维持木质部正常发育中发挥了重要作用；在转录调控层级上，ZATs作用于木质部分化关键因子VND7的下游，同时受到根尖分生组织因子PLT2的负调控。分子机制研究^［19］表明，ZAT14蛋白能够直接结合多个扩张蛋白基因（EXPA1、EXPA10、EXPA14）的启动子并抑制其转录，通过调控细胞壁松弛过程来确保木质部导管的正常连续分化。然而，该亚类转录因子如何在林木木材形成过程中进行精细调控？其具体功能和分子机制仍是一个亟待探索的重要问题。

本研究在前期通过对毛果杨（Populus trichocarpa）不同发育阶段茎干组织的转录组分析，发现了一个在次生生长阶段显著高表达的C2H2型锌指转录因子基因PtrZAT11。为进一步探究PtrZAT11在杨树木材形成中发挥的功能，本研究通过分子克隆、基因表达分析、亚细胞定位、基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑及表型分析，系统研究PtrZAT11及其同源基因在杨树生长及木材形成中的分子功能，旨在为深入理解树木木材形成的分子过程提供理论支撑，并为木材性状的分子育种提供候选基因和理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

试验材料为毛果杨无性系Nisqually-1，取自林木遗传育种全国重点实验室（东北林业大学）。组培苗接种于WPM固体培养基（含有2.5%蔗糖和0.5%琼脂，pH=5.8），在25 ℃、光照16 h/黑暗8 h的组培室中培养。待幼苗生根且生长健壮后，移栽至温室环境下生长，生长条件为25 ℃、光照16 h/黑暗8 h。

1.2　 PtrZAT11 基因序列分析与克隆

根据前期转录组数据结果，从Phytozome 14网站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载PtrZAT11基因（Potri.010G209400）转录序列，以及与其同一性大于60%的基因氨基酸序列。基于毛果杨ZAT蛋白的全长氨基酸序列进行多序列比对（ClustalW），采用MEGA 12软件的最大似然法（ML）构建系统发育树，Bootstrap重复次数为1 000次。

以毛果杨野生型（WT）茎干组织为材料，提取总RNA，并反转录获得cDNA，以cDNA为模板，设计特异性引物（表1）扩增PtrZAT11的CDS序列，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化，并连接至pENTR/TOPO载体中，利用热激法转化至大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞，筛选阳性克隆后进行测序验证。

1.3　 PtrZAT11 基因表达特性分析

为分析PtrZAT11在毛果杨茎干发育过程中的表达特征，采集毛果杨WT第1~8茎节的木质部组织，提取总RNA并反转录为cDNA，以毛果杨18S作为内参基因，每个样品设置3个生物学重复和2个技术重复，利用RT-qPCR对PtrZAT11的表达水平进行检测。

1.4　 PtrZAT11 基因瞬时表达载体构建及亚细胞定位分析

将PtrZAT11的CDS序列构建至pUC19-35S-GFP载体，与融合GFP表达。利用氯化铯溴化乙锭超高速梯度密度离心法提取高纯度、高浓度的质粒。利用毛果杨木质部原生质体瞬时转化体系^［20］，将pUC19-35S-PtrZAT11-GFP和pUC19-35S-H2A-mCherry共同转入杨树原生质体中进行瞬时表达。利用激光共聚焦显微镜观察GFP和mCherry荧光信号分布情况，以确定PtrZAT11蛋白的亚细胞定位特征。

1.5　双突变体创制

通过CRISPR-P 2.0网站（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）对PtrZAT11及其同源基因PtrZAT11h进行gRNA序列设计，选取的是2条基因靠近起始子一端相同的20 bp基因序列，即使用的是1条gRNA靶向2条同源基因，构建CRISPR-Cas9载体（pEgP237）。利用毛果杨稳定遗传转化系统进行载体遗传转化，使用卡那霉素进行抗性筛选。利用基因组PCR进行抗性生根苗的转基因检测。分别在PtrZAT11和PtrZAT11h的gRNA区域前后各200 bp设计特异性引物，对转基因苗和WT基因组DNA进行PCR扩增，将PCR产物送测，测序结果使用EditCo网站（https：//ice.editco.bio/#/）进行基因编辑分析。

1.6　双突变体表型分析

选取温室生长90 d和120 d的WT与ptrzat11 ptrzat11h双突变体植株进行拍照，并对其株高、茎节数量、茎节长度和不同茎节直径进行测量。选取温室生长120 d的WT和双突变体植株，分别对其第2、4、6、8、10和12茎节进行取材，每节茎段均切成2 cm厚度，使用预冷的FAA固定液固定样品，而后进行脱水和浸蜡，之后再进行包埋、切片，切片厚度为16 µm，用番红固绿染料对切片进行染色处理，染色后的切片用中性树脂封片。使用M8数字扫描显微成像系统（Precipoint，德国）和View Point软件对石蜡切片进行扫描观察和统计分析。野生型和转基因株系分别选取3张第12茎节切片，每张切片统计木质部细胞的宽度和面积占比，并在每张切片木质部内随机选取3个等面积视野，统计单位面积（mm²）内导管细胞和纤维细胞的数量及单个导管细胞孔径面积（µm²）。

1.7　引物合成及数据处理

引物合成（表1）由黑龙江箭速基因科技有限公司完成，样品测序由吉林省库美生物科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1　 PtrZAT11 基因表达分析

为了挖掘参与毛果杨木材形成的关键调控因子，本研究前期通过对毛果杨野生型（WT）不同发育阶段茎干木质部的转录组测序进行基因筛选，获得了一个在次生生长阶段显著高表达的C2H2型锌指转录因子PtrZAT11。为了进一步确定该转录因子在毛果杨植株茎干发育不同阶段的表达特征，本研究收集了毛果杨WT植株第1~8茎节的木质部组织进行RT-qPCR检测。结果显示，PtrZAT11在第1~5茎节维持相对较低的表达量，从第6茎节开始，随着次生木质部的发育，其表达水平显著升高（图1）。以上结果表明，PtrZAT11在毛果杨次生木质部发育（木材形成）过程中发挥着潜在的重要作用。

为了进一步验证PtrZAT11的功能相关性，结合本研究前期的毛果杨不同组织转录组数据^［21］，对PtrZAT11基因的组织表达特征进行了分析。结果显示，PtrZAT11基因在木质部和根中的表达水平明显高于茎维管组织形成层、韧皮部、叶片和顶芽（图2）。综合其在木质部发育梯度中的差异表达特征及组织特异性表达模式，推测PtrZAT11转录因子可能在毛果杨木材形成过程中发挥一定的调控作用。

2.2　毛果杨PtrZAT11亚细胞定位

为了对PtrZAT11功能进一步分析，通过基因克隆和测序验证，获得了PtrZAT11基因540 bp的CDS序列。为了分析PtrZAT11蛋白的亚细胞定位特征，构建了35S启动子驱动PtrZAT11与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合表达的瞬时表达载体pUC19-35S-PtrZAT11-GFP。利用PEG介导的毛果杨木质部原生质体瞬时转化系统结合激光共聚焦显微镜观察，得到的结果显示，PtrZAT11-GFP融合蛋白的绿色荧光信号主要分布于细胞核区域（图3）。以上结果表明，PtrZAT11蛋白定位于细胞核，其亚细胞定位特征符合转录因子的一般特性。

2.3　毛果杨 PtrZAT11 及其同源基因突变体的获得

为了分析PtrZAT11在毛果杨次生生长过程中的功能，本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对PtrZAT11进行毛果杨功能突变体的创制。利用PtrZAT11的氨基酸序列进行同源基因分析，查找到8个与之序列同一性大于60.0%的基因。将拟南芥的AtZAT11一同进行进化树分析，结果表明，PtrZAT11具有一个旁系同源基因（图4A），序列同源分析进一步表明，PtrZAT11与该基因的氨基酸序列相似度为95.4%，二者均包含典型的锌指（zinc finger）结构域，将该旁系同源基因命名为PtrZAT11h（图4B）。为避免潜在的功能冗余引起单突变体表型不显著，本研究对PtrZAT11和PtrZAT11h进行了双突变体的创制。

利用CRISPR-Cas9系统进行PtrZAT11和PtrZAT11h的双突变体创制，首先分别对2条基因进行gRNA设计，选取2条基因靠近起始子一端的相同的20 bp基因序列，构建pEgP237载体。其次利用毛果杨稳定遗传转化体系获得了抗性筛选植株，对其进行叶片基因组DNA的PCR鉴定，结果表明，成功获得5株转基因植株（图5）。进一步的PtrZAT11及其同源基因PtrZAT11h靶位点的测序鉴定结果表明，共获得4株ptrzat11 ptrzat11h双突变体（图6）。其中，4个突变体靶点处均插入或缺失不同数量的碱基，导致ptrzat11 ptrzat11h-L8和L9株系在PtrZAT11和PtrZAT11h蛋白翻译中提前终止，理论上最终缺失了C2H2家族的典型锌指结构域；L3和L5株系缺失了PtrZAT11的锌指结构域，但PtrZAT11h仍保留绝大部分正常序列，未造成移码突变。因此，本研究选取突变体中的ptrzat11 ptrzat11h-L9进行后续研究。

2.4　 ptrzat11 ptrzat11h 突变体植株生长表型观测及分析

为了评估PtrZAT11功能缺失对毛果杨的生长及木质部发育的影响，本研究对生长60 d和120 d的WT与ptrzat11 ptrzat11h-L9植株进行了生长指标检测和组织解剖分析。与WT相比，ptrzat11 ptrzat11h突变体植株表现出显著的纵向生长优势（图7A、7B），4月龄时其株高平均增加约31.5%（图7C），且总茎节数量显著多于WT（图7D）。突变体与WT的地径并无显著差异（图7E）。对第3、4、8、10茎节的长度和直径进行测量，结果显示，突变体在特定节间位的长度及直径与WT无显著差异（图7F、7G）。以上生长指标结果表明，PtrZAT11与同源基因缺失引起的植株株高增加，源于茎节数量增多。

采用石蜡切片技术对突变体和WT的第2、4、6、8、10和12茎节进行横切面观察。结果显示，随着茎节的发育，突变体的木质部发育逐渐迟缓（图8A）。对第12茎节的木质部环带宽度和木质部细胞面积占茎干横截面的比例进行统计，发现二者均显著低于WT（图8B、8C）。与此同时，对木质部中的纤维细胞和导管细胞进行统计分析，与WT相比，突变体木质部中单位面积的纤维细胞数量显著减少（图8D），单位面积的导管细胞数量显著增多（图8E）。导管细胞形态特征表明，单个导管细胞的平均横截面积与WT相比无显著差异（图8F）。以上结果说明，PtrZAT11及同源基因的缺失显著改变了次生木质部的组织结构。

3 讨 论

本研究利用杨树不同茎节的木质部组织转录组测序数据，筛选得到一个在初生生长阶段表达较低、次生生长阶段表达显著提高的转录因子PtrZAT11，通过RT-qPCR验证发现，PtrZAT11在毛果杨不同茎节中的表达呈现明显的动态变化特征，即在第1~5茎节表达量相对较低，从第6茎节开始表达量显著升高。基部茎节通常具有更发达的次生木质部，而顶端茎节则以初生生长为主^［22］。PtrZAT11的这种表达模式与次生木质部的发育进程高度一致，提示其可能在次生木质部发育的特定阶段发挥关键调控作用。调控木材形成过程的一些典型的转录因子同样具有类似的表达模式，例如在杨树的木材形成研究中，PtrWND1在基部茎节中的表达量显著高于顶端茎节^［23］，PtrMYB3和PtrMYB20在次生生长旺盛的茎段中表达量最高^［24］，84K杨（P.alba×P.glandulosa）的第2~7茎节的转录组分析发现次生细胞壁形成相关基因在第7茎节被完全激活，且在次生生长阶段存在大量的差异表达基因^［25］，杉木（Cunninghamia lanceolata）的CINAC40在茎中的表达随木质化程度升高呈现递增趋势^［26］。这些转录因子在树木的不同发育阶段，可能共同构成了木材形成的时空调控网络。

植物生长发育需在初生生长与次生生长之间进行资源的最优分配。初生生长主要由顶端分生组织驱动，表现为茎节的持续产生和株高的增加；次生生长则依赖于维管形成层的活动，通过木质部的不断积累实现茎干的增粗和木材的形成。茎节是初生生长的直接产物，其数量的增多表明顶端分生组织活性的增强，PtrZAT11及同源基因的功能缺失导致突变体茎节数量大幅增多，但植株不同茎节的长度与野生型相比没有明显差异。因此，突变体株高的增加可能是由于顶端分生组织产生茎节的频率加快所致。与此同时，突变体的木质部发育迟缓且纤维细胞和导管细胞的组成发生了显著改变。木质部是次生生长的核心产物，其发育迟缓和细胞组成的改变直接反映了次生生长的调控异常。PtrZAT11及同源基因的功能缺失所导致的突变体表现出纵向生长加速、径向生长改变的表型特征，表明在野生型毛果杨中，PtrZAT11可能通过抑制顶端分生组织的过度活跃来控制初生生长的节奏，同时促进木质部纤维细胞的正常分化以确保次生生长的质量。

已有研究表明，拟南芥ZAT转录因子成员ZAT18可调控激素信号，该基因的功能丧失可激活生长素和细胞分裂素通路^［27］，ZAT6可直接负调控生长素合成与信号转导^［28］。因此，PtrZAT11及同源基因的功能缺失突变体的高生长加速可能与该转录因子调节激素信号的功能相关，这需进一步试验验证。突变体中导管细胞数量增多而纤维细胞数量减少，提示PtrZAT11可能参与调控木质部细胞的命运分化。木质部由导管细胞、纤维细胞和薄壁细胞等多种细胞类型组成，这些细胞的分化和比例决定了木材的物理性质和功能特性^［29］。导管细胞主要负责水分运输，纤维细胞提供机械支撑，不同类型细胞的分化受到严格的遗传调控，多个转录因子家族参与这一过程。PtrZAT11可能通过直接调控木质部细胞分化相关基因的表达来影响细胞命运决定。虽然突变体中导管细胞数量增加，但单个导管的横截面积并无显著变化，表明PtrZAT11主要影响细胞分化的数量而非细胞扩张过程，这与已知的木材形成调控机制相符，表明细胞分化数量和细胞扩张是2个相对独立的调控过程^［30］。

植物在生长过程中，通常需要在不同器官和功能之间进行资源分配权衡^［31］，如光合产物分配、根系发育、茎干生长和繁殖投入等，这一生长模式的调节涉及转录因子调控、激素信号传导及碳水化合物分配。PtrZAT11及同源基因突变导致的植株在初生生长和次生生长过程中的模式改变，反映了PtrZAT11可能在协调植物资源分配中发挥重要作用。PtrZAT11与PtrZAT11h可能是权衡初生和次生生长过程的关键调控因子，二者是否参与激素如赤霉素、生长素和细胞分裂素等通路，尚需后续研究。

杨树不同组织的转录组数据表明，PtrZAT11在木质部和根中均呈现高表达特征。根和茎木质部均为植物的输导组织，在结构和功能上具有相似性，都承担着水分和养分运输的重要功能^［32］。木质部与根在发育上存在密切的关联性，根系发育直接影响矿质营养吸收和对地上部分的水分供应，进而影响木质部的形成和功能^［33］。本研究解析了突变体地上部的表型及功能，而植株地下部分是否发生了表型的变化，以及PtrZAT11在根中的调控作用有待进一步研究。

4 结 论

本研究通过对毛果杨PtrZAT11转录因子在植株发育过程中的表达模式分析、功能缺失突变体的创制及其生长表型和茎组织切片分析，探究了其在木材形成过程中的调控功能。PtrZAT11在毛果杨茎干发育过程中呈现从第6茎节开始显著上调的变化趋势，提示其参与木材形成调控过程。利用CRISPR-Cas9技术创制的ptrzat11 ptrzat11h双突变体植株表现出显著的纵向生长加速、径向生长改变的表型，同时植株茎中单位面积内纤维细胞数量减少、导管细胞数量增多，表明PtrZAT11主要影响木质部细胞分化的数量，可能对木质部细胞的命运分化发挥一定调控作用。综上所述，PtrZAT11作为C2H2型锌指转录因子，通过改变木质部细胞的组织结构来参与杨树木材的形成过程，且可能参与协调杨树初生生长与次生生长之间的平衡。

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