铁皮石斛叶多糖美白和抗氧化活性

Whitening and Antioxidant Activities of Leaf Polysaccharide from Dendrobium officinale

摘要

采用水提醇沉法提取纯化名贵药食同源中药材铁皮石斛（Dendrobium officinale）茎、叶组织多糖，并研究其吸湿、保湿、美白、抗氧化等活性。从铁皮石斛叶中提取纯化获得的叶多糖（leaf polysaccharide，L-POL）得率为（13.95±0.27）%，纯度达（92.14±7.75）%。L-POL具有较好的吸湿、保湿活性，吸湿率、保湿率分别为（9.50±0.57）%、（25.13±0.24）%。L-POL具有较强的2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）自由基清除能力和体外酪氨酸酶抑制活性，IC₅₀值分别为2.232、54.930 g⋅L^-1。质量浓度为125 mg⋅L^-1的L-POL能显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16合成黑色素，抑制率达36.89%。此外，75~300 mg⋅L^-1的L-POL对小鼠黑色素瘤细胞没有细胞毒性（细胞活力89.33%~102.00%）。高纯度的L-POL具有较好的抗氧化、美白、吸湿、保湿活性，为铁皮石斛资源进一步在化妆品或美白功能食品领域中的开发利用提供了新的思路。

Abstract

Polysaccharide from the stems and leaves of Dendrobium officinale was extracted and purified by water extraction and alcohol precipitation， and its hygroscopic， moisturizing， whitening and antioxidant activities were clarified， respectively. The yield of polysaccharide（L-POL） extracted and purified from D. officinale leaves was（13.95±0.27）% and the purity was（92.14±7.75）%. L-POL had good moisture absorption and moisture retention effects， and moisture absorption rate and moisture retention rate were（9.50±0.57）% and （25.13±0.24）%， respectively. L-POL had strong DPPH free radical scavenging ability and in vitro tyrosinase activity with IC₅₀ value of 2.232 and 54.930 g⋅L^-1， respectively. L-POL with a concentration of 125 mg⋅L^-1 could significantly inhibit the synthesis of melanin by mouse melanoma cells B16 with an inhibitory rate of 36.89%. In addition， L-POL with concentrations ranging from 75-300 mg⋅L^-1 was not cytotoxic to mouse melanoma cells（cell viability of 89.33%-102.00%）. The high-purity L-POL had good antioxidant， whitening， moisture absorption and other activities， which provided a new idea for the further development and utilization of D. officinale resources in cosmetics or whitening functional foods.

Graphical abstract

关键词

铁皮石斛 / 叶多糖 / 吸湿保湿 / 抗氧化 / 美白活性

Key words

Dendrobium officinale / leaf polysaccharide / moisture-absorption and retention / antioxidation / skin whitening activity

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）植物。铁皮石斛的干燥茎是中国传统具有益胃生津、滋阴清热功效的名贵中药材^［1］，素有“千金草”“软黄金”的美誉^［2］。铁皮石斛的主要活性成分为多糖，此外还富含黄酮、生物碱等活性成分^［3］，具有补胃和中、护肝利胆、明亮眼目、润肺止咳、保护肠胃、降血糖、抗肿瘤和增强免疫力等药理活性^{［1，4-9］}。2023年11月，中华人民共和国国家卫生健康委员会正式将铁皮石斛纳入“按照传统既是食品又是中药材的物质目录”，意味着铁皮石斛的安全性得到进一步证实，以其开发的功效产品安全性较高，具有更广阔的市场空间。

我国是全球第二大化妆品消费国，产业总值达4 026亿元以上^［10］。但是，当前市场上的化学合成类美白产品具有毒副作用，长期使用会导致皮肤病变、头昏、恶心等不良反应，威胁身体健康^［11］。因此，开发以天然产物为主要活性因子、无毒副作用、安全高效的美白产品，成为了当前研究的热点^［12-13］。

铁皮石斛已被研究证明具有潜在的美白、滋补养颜等功效，且其茎提取物已被纳入《已使用化妆品原料目录（2021年版）》，作为原料生产美白产品。但是，当前关于铁皮石斛叶等组织中美白、滋补养颜功能因子的系统研究鲜有报道^［14］，造成铁皮石斛美白、滋补养颜功效、作用机制不明确，严重阻碍其在美白、滋补养颜功能食品或化妆品产品开发方面的运用。其次，目前铁皮石斛资源的应用主要集中在干燥茎部位，叶、根等大量含有多糖活性成分的组织被废弃，造成了资源的严重浪费，不利于进一步发展铁皮石斛精深加工产业和提高其经济效益。铁皮石斛在中国西南部地区分布广泛，特别是恩施等富硒地区的铁皮石斛资源优势得天独厚^［15］。因此，本研究选择恩施地区3年生铁皮石斛作原材料提取叶的多糖，研究其2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）自由基清除、美白、吸湿、保湿活性，为铁皮石斛资源充分开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

3年生铁皮石斛来源于湖北省农业科学院中药材研究所的华中药用植物园（30°18′9.277″N，109°29′1.360″E，海拔426 m）；酪氨酸酶、B16黑色素瘤细胞、α-黑素细胞刺激素（α-MSH）等采购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；常规化学试剂采购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　铁皮石斛多糖提取与纯化

水提醇沉法提取、纯化多糖^［16-17］：取试验材料粉末按质量比1∶30加水90 ℃提取2 h，并过滤浓缩；加4倍体积80%乙醇、4 ℃静置过夜，离心获得粗多糖。粗多糖溶液添加Sevage试剂（体积比5∶1）并振荡、离心纯化，重复以上操作2次，冷冻干燥获得纯化的多糖样品。

1.2.2　铁皮石斛多糖含量测定

苯酚-硫酸法检测多糖含量^［18-19］：反应体系为200 μL待测多糖样品溶液、200 μL 5%苯酚溶液、1 mL浓硫酸，混匀并沸水浴20 min，再冰浴5 min，在490 nm处测吸光值。配置质量浓度为20、40、60、80、100 mg·L^-1的系列标准葡萄糖溶液，同上述操作反应体系，绘制标准曲线，计算多糖含量。

1.2.3　铁皮石斛多糖吸湿性

采用安星亮等^［20］、Li等^［21］的方法并稍作调整。将铁皮石斛茎多糖和L-POL样品各0.1 g、饱和硫酸铵溶液（相对湿度为81%）放置于干燥器中，设置温度（20.0±2.0） ℃，分别在1、2、4、8、12、24、48 h测定样品质量；每组设置3个平行，并用甘油作对照，吸湿率（R_H）计算公式为

R_{\mathrm{H}}=\frac{\left(M_t-M_{\mathrm{0}}\right)}{M_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

式中：M_t 为不同时间段样品质量（g）；M₀为初始样品质量（g）。

1.2.4　铁皮石斛多糖保湿性

采用安星亮等^［20］、Lin等^［22］的方法并稍作调整。取铁皮石斛茎多糖和L-POL样品各0.1 g添加3倍质量的超纯水充分吸湿；在室温条件下将吸湿后的多糖样品放于装有变色硅胶的干燥器中，分别在1、2、6、12、24、48 h测定样品质量；每组设置3个平行，并用甘油作对照，保湿率（R_M）计算公式为

R_{\mathrm{M}}=\frac{M_t}{M_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

1.2.5　DPPH自由基清除率

参照张小琴等^［23］、黄琼和何燕萍^［24］的方法并稍作调整。配制系列质量浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g·L^-1的铁皮石斛茎多糖和L-POL待测样品溶液；设置反应体系：100 μL待测样品溶液、100 μL DPPH溶液，37 ℃下避光反应30 min， 517 nm处测定吸光值。并设置无水乙醇阴性对照组、无菌水空白对照组、抗坏血酸阳性对照组，自由基清除率（R_S）计算公式为

R_{\mathrm{S}}=\frac{A_{\mathrm{0}}-\left(A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{2}}\right)}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}%（3）

式中：A₀为100 μL无菌水+100 μL DPPH吸光值；A₁为100 μL样品（或抗坏血酸）+100 μL DPPH吸光值；A₂为100 μL样品（或抗坏血酸）+100 μL无水乙醇吸光值。

1.2.6　铁皮石斛多糖体外抑制酪氨酸酶活性

参考文献^［25-26］报道方法并稍作调整。配制系列质量浓度为5、10、15、20、25 g·L^-1的铁皮石斛茎多糖和L-POL待测样品溶液；设置200 μL 20 mmol·L^-1 PBS缓冲液、50 μL样品溶液、100 μL 1 mmol·L^-1 底物L-酪氨酸、50 μL 250 U·mL^-1酪氨酸酶反应体系，37 ℃反应10 min、90 ℃灭活10 min、12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液于270 nm处测定吸光值；设置无菌水阳性对照组，无样品和酪氨酸酶阴性对照组。按公式（4）计算抑制率（R_I）

R_{\mathrm{I}}=\frac{\left(A-B\right)}{C}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（4）

式中：A为试验组在270 nm处的吸光值；B为阳性对照组在270 nm处的吸光值；C为阴性对照组在270 nm处的吸光值。

1.2.7　B16黑色素瘤细胞黑色素含量测定

采用NaOH裂解法^［27-29］测定B16黑色素瘤细胞内黑色素含量。B16细胞接种于24孔板，37 ℃、5% CO₂孵育24 h，分别加入含125、250、500 mg·L^-1 样品的培养基1 mL，孵育48 h；胰酶消化收集细胞，加300 μL 1 mol·L^-1 NaOH（10% DMSO）后80 ℃水浴60 min；10 000 r·min^-1离心10 min，取100 μL上清液于450 nm处测吸光值；设置无药物处理的对照组，每组3个平行，黑色素含量计算公式为

\mathrm{黑色}\mathrm{素含}\mathrm{量}=\frac{\mathrm{样品}\mathrm{组}}{\mathrm{对照}\mathrm{组}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（5）

式中：样品组为药物处理组在450 nm处的吸光值；对照组为无药物处理组在450 nm处的吸光值。

1.2.8　B16黑色素瘤细胞活力的测定

采用CCK-8法^［30］检测铁皮石斛多糖对细胞的毒性。B16细胞接种于96孔板，37 ℃、5% CO₂孵育24 h，分别加入含75、150、300 mg·L^-1样品的培养基100 μL，孵育24 h；再加入10 μL CCK-8试剂，置于37 ℃培养箱中反应1 h，450 nm处测吸光值；设置无药物处理的对照组、无细胞的空白组，每组3个平行，细胞活力（R_V）计算公式为

R_{\mathrm{V}}=\frac{\left(A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{0}}\right)}{A_{\mathrm{2}}-A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（6）

式中：A₀为空白组在450 nm处的吸光值；A₁为样品组在450 nm处的吸光值；A₂为对照组在450 nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1　铁皮石斛多糖含量

葡萄糖标准曲线方程为y=0.010 68x+1.064，在质量浓度20~100 mg·L^-1的线性范围内R²=0.999 1。如表1，铁皮石斛茎多糖得率为（13.77±0.19）%，多糖纯度达（90.96±0.38）%；L-POL得率为（13.95± 0.27）%，多糖纯度达（92.14±7.75）%。在铁皮石斛不同组织中，L-POL比茎多糖有更高的糖含量和纯度。

2.2　铁皮石斛多糖吸湿性

在相对湿度81%的环境中，L-POL在8~48 h内的吸湿率增加9.50%（图1），具有一定的吸湿效果；铁皮石斛茎多糖在8~48 h内吸湿率增加7.40%，L-POL与铁皮石斛茎多糖的吸湿效果无显著性差异；但是，L-POL与茎多糖的吸湿效果显著低于阳性对照甘油（P<0.05）。

2.3　铁皮石斛多糖保湿性

在48 h内茎多糖、L-POL保湿率分别为25.88%、25.13%（图2），且与阳性对照甘油（29.84%）无显著性差异（P>0.05），显示了其具有显著的保湿效果。

2.4　DPPH自由基清除活性

如图3B、3C，在1~20 g·L^-1范围，铁皮石斛茎、L-POL对DPPH自由基清除率与浓度成线性正关系（R²分别为0.960 1、0.985 1），其IC₅₀分别2.232、5.880 g·L^-1，L-POL具有较好的DPPH自由基清除活性，但是均弱于阳性药物抗坏血酸（图3A）。

2.5　L-POL抑制酪氨酸酶活性

如图4，L-POL对酪氨酸酶有较为显著的抑制活性，IC₅₀为54.93 g·L^-1。但是，铁皮石斛茎多糖对酪氨酸酶没有抑制活性。

2.6　L-POL抑制B16黑色素瘤细胞黑色素生成

如图5所示，125、250、500 mg·L^-1 L-POL处理组的黑色素含量分别为63.11%、63.40%和62.46%（对照组黑色素含量为100%），在质量浓度125~500 mg·L^-1范围内减少细胞内黑色素含量≥36.60%，显示了L-POL对B16黑色素瘤细胞黑色素生成的显著抑制作用。进一步的细胞色素沉淀检测发现，沉积在L-POL处理组（125~500 mg·L^-1）细胞中的黑色素显著低于对照组细胞，证明了 L-POL能有效抑制黑色素在B16细胞内沉积。

2.7　L-POL对B16黑色素瘤细胞活力影响

3个不同质量浓度（75、150和300 mg·L^-1）L-POL处理组的B16黑色素瘤细胞活力分别为90.33%、89.33%和102%（图6），与对照组（100%）无显著性差异（P>0.05），表明L-POL对B16黑色素瘤细胞没有细胞毒性。

3 讨论与结论

铁皮石斛叶生物量占到总生物量的40%以上，在常规的生产过程中铁皮石斛叶一般作为生产废料，关于其生产利用的研究报道较少^［31］。然而，有研究^［32］发现，铁皮石斛叶含有多糖、黄酮、氨基酸、生物碱、中长链脂肪酸、维生素、挥发性成分、矿物质等多种药理活性和营养成分，具有重要的开发价值。张春花等^［33］利用色谱柱层析法从铁皮石斛叶中分离化学成分，共分离鉴定得到4-羟基苯乙酮、对羟基苯甲醛、丁香醛、α-萘酚、香草 酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、cyclomargenol等12个活性次级代谢产物，其中cyclomargenol具有很强的体外抗炎活性。杨东梅等^［34］利用高效液相色谱法测定贵州铁皮石斛叶多糖的分子质量，鉴定单糖组成，发现铁皮石斛叶多糖有2个主要组分（分子质量分别为54 012、210 ku），由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖组成（物质的量比为0.26∶0.16∶0.01∶0.06∶0.51），此外还发现铁皮石斛叶多糖能显著降低斑马幼鱼体内血脂含量（P<0.05）。黄琼和何燕萍^［24］采用超声波协同微波方法提取铁皮石斛叶多糖，得率为14.03%，但是该操作生产成本较高，不利于工业化放大。本研究采用水提醇沉的简化工艺，以无污染的水和无毒副作用的乙醇为提取溶剂，从铁皮石斛叶中提取L-POL得率≥13.77%、纯度≥90.96%；高得率、高纯度的多糖可直接作为深加工产品的原料，具有更为广阔的开发前景。

铁皮石斛多糖具有较好的美白、保湿效果，卫梦尧^［35］研究了铁皮石斛茎多糖的相对分子质量，发现在短时间（24 h）内相对分子质量小的多糖吸湿性更好，长时间段内与透明质酸的吸湿效果接近，在24 h之后，相对分子质量中等的多糖保湿效果比其他多糖更好。本研究首次发现L-POL具有较好的吸湿性和保湿效果（吸湿率≥9.50%，保湿率≥25.13%），且其保湿效果与阳性药物甘油无显著差异，证明其可以运用于美容养颜产品，能够锁住水分，帮助皮肤吸收活性成分，改善美容产品性能，在天然健康的护肤品或美白功效食品领域具有潜在的开发前景。曹雪原等^［36］采用蒸馏水加热回流提取铁皮石斛叶多糖，并发现其具有较好的DPPH自由基清除活性（IC₅₀为0.6 g·L^-1）。本研究通过水提醇沉工艺获得的纯化后多糖（纯度≥90.96%）也具有较好的DPPH自由基清除活性（IC₅₀为2.232 g·L^-1）。此外，本研究还发现L-POL的DPPH自由基清除活性强于铁皮石斛茎多糖（5.880 g·L^-1）。高纯度的L-POL（纯度≥90.96%）对酪氨酸酶有较好的抑制活性（IC₅₀ 54.93 g·L^-1）， 在细胞水平，其对B16黑色素瘤细胞黑色素合成具有显著的抑制作用（质量浓度125 mg·L^-1，抑制率≥36.89%），在75~300 mg·L^-1质量浓度范围内，对B16黑色素瘤细胞没有毒害作用（细胞活力为89.33%~102.00%）。招敏聪等^［37］发现铁皮石斛提取物具有酪氨酸酶抑制活性，但是没有研究提取物中的活性成分和含量。已有文献^［26］报道 500 mg·L^-1的铁皮石斛茎多糖对B16细胞黑色素合成抑制率为32.36%；本研究提取的高纯度多糖在质量浓度为125 mg·L^-1时，对黑色素合成的抑制率就达36.89%，具有更高的抑制活性。

目前，作为主要原料，铁皮石斛茎多糖已被广泛应用于上市的美容养颜、美白保湿的化妆品中，如面膜、润肤水、唇膏、沐浴乳等。因此，L-POL优良的抗氧化、美白、吸湿、保湿活性的发现为充分挖掘铁皮石斛经济价值、药用价值，促进在化妆品或美白功效食品领域中的开发利用提供了新的思路。

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基金资助

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21)

湖北省重点研发计划项目(2020BCA059)

恩施州技术支撑科技计划项目(XYJ2023000044)