超氧化物歧化酶在植物响应干旱、盐碱和冷害中的作用

Roles of Superoxide Dismutase in Plant Response to Drought, Salinity and Cold Stress

摘要

超氧化物歧化酶（SOD）在植物细胞中广泛存在，主要分为Mn-SOD，Fe-SOD以及Cu/Zn-SOD 3大类，它们可以在细胞中发挥不同的防御作用，增强植物的耐受力。此外在蓝细胞和海洋生物中存在的Ni-SOD有待探究。该研究根据SOD所包含金属离子的不同对其理化性质和作用机制进行分析；阐述了在干旱、盐碱、冷害等胁迫下SOD在植物中发挥的作用，并对该酶在未来植物生长发育进程中的作用进行展望，为有关逆境环境下植物生长发育机制的研究提供参考。

Abstract

Superoxide dismutase（SOD） widely presents in plants and can be mainly classified into three categories： Mn-SOD， Fe-SOD and Cu/Zn-SOD. They play different defense roles in cells and enhance plant tolerance. Additionally， Ni-SOD in blue cells and marine organisms remains to be explored. In this paper， the physicochemical properties and mechanisms of action of SOD were analyzed according to the different metal ions contained in SOD， and the role of SOD in plants under stress conditions such as drought， salinity and cold were elucidated， and the role of SOD in plant growth and development in future was prospected， and a reference for studying the mechanisms of plant growth and development under adverse environments was provided.

Graphical abstract

关键词

超氧化物歧化酶 / 蛋白质的理化性质 / 活性氧平衡作用机制 / 抗逆响应

Key words

superoxide dismutase / physicochemical properties of proteins / mechanism of reactive oxygen species homeostasis / tolerance to stress response

在植物生长发育过程中，氧气参与的代谢活动至关重要，且此活动常伴有活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生^［1］。活性氧平衡对植物生长发育起至关重要的作用。干旱、盐碱及冷害等不良因素会导致植物的ROS动态失衡和大量活性氧类产生^［2］。累积的活性氧可对蛋白质、脂质、DNA分子等造成不可逆的损伤，影响膜的生物学功能、DNA复制，甚至可导致细胞凋亡^［3］。植物体内存在的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可催化发生歧化反应，作为第一道防线清除累积的ROS，保护细胞免受氧化损伤^［4］。根据植物细胞中SOD催化中心所包含的金属离子种类，可以将其分为3类：锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）以及铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）^［5］。研究表明，在不同的非生物胁迫下，SOD基因表达模式不同，对增强植物抗逆性也有不同的表现^［6］。

1 SOD的分类与组织分布

在植物细胞中常见的超氧化物歧化酶主要包括Mn-SOD、Fe-SOD以及Cu/Zn-SOD。此外，在一些蓝细菌和海洋生物中发现了镍超氧化物歧化酶（Ni-SOD），在链霉菌属（Streptomyces）和牛肝中分别发现了Fe/Zn-SOD和Co/Zn-SOD^［7］。近年来，在分枝杆菌（Mycobacterium）中发现了只有铜离子的真核纯铜超氧化物歧化酶重复蛋白（Cu-SODs）^［8］。目前，超氧化物歧化酶独特种类的诞生有两类假说：独立进化学说和演化学说。在20亿年前，SOD在原核生物中出现两类：Cu/Zn-SOD和Fe/Mn-SOD。随着基因的进化，Fe/Mn-SOD逐渐演变为Fe-SOD和Mn-SOD，三维构象和氨基酸序列却依然非常接近，然而Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD在晶体结构和催化机制上都表现出非常大的差异^［9］。本研究在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找了水稻（Oryza sativa）的SOD氨基酸序列，接着在SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）网站中进行三维构象的预测。如图1所示，水稻Fe-SOD（A）和Mn-SOD（C）的三维构象具有相似之处，但Cu/Zn-SOD（B）的三维构象与它们有较大差异。这也从侧面支持了独立进化假说。

不同的超氧化物歧化酶分布于不同的亚细胞结构体中。Cu/Zn-SOD由2个亚基组成，每个亚基各包含1个铜离子和1个锌离子，在植物细胞中含量丰富。研究表明：Cu/Zn-SOD主要存在于叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中^［10-13］；Mn-SOD含1个锰离子，主要存在于植物细胞的线粒体和过氧化物酶体中^［14］；Fe-SOD含1个铁离子，主要存在于叶绿体和细胞质基质中^［15］。由于它们在细胞中所处位置的不同，3种SOD在细胞防御中所起作用基本不重叠。

2 不同SOD理化性质与作用机制

SOD是植物体内一种抗氧化酶类，其作用机理为通过催化{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}的歧化反应（2{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}+2H⁺→H₂O₂+O₂）将{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}歧化为H₂O₂和O₂，而H₂O₂又被过氧化氢酶（CAT）分解为H₂O和O₂，从而缓解过量的{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}所造成的氧化胁迫^［16］。

2.1　Cu/Zn-SOD

在Cu/Zn-SOD结构中，多肽链通过折叠形成 1个β-桶^［17］，其中有1个环结构，环是保持β-桶正确折叠的关键^［18］。Cu和Zn位点位于活性位点通道中的β-桶外；金属离子将结构元素连接在一起，并提供催化作用。每个Cu/Zn-SOD亚基中的活性位点包含1个在还原状态下由3个组氨酸连接的Cu离子以及1个由1个天冬氨酸和3个组啶连接的Zn离子，它们的侧链都位于β-桶外。Zn离子配体的组氨酸在处于氧化状态时也与Cu离子连接，因此被称为桥接组氨酸。根据特定的反应步骤，暴露的Cu离子还与水分子和底物/产物/反应中间体/水配位。重要的是空间选择允许超氧化物，但不允许较大的阴离子（如磷酸盐系）进入活性位点^［19-22］。有研究^［23］表明，在Cu/Zn-SOD中Cu的存在是其活性所必需的，它直接与超氧阴离子自由基作用；Zn（Ⅱ）具有调节咪唑基与Cu之间相互作用、稳定活性中心结构的功能，除去酶分子中的Zn（Ⅱ）但保留其中的结合态 Cu（Ⅱ），SOD仍具有活性。有研究^［24］表明拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtCu/Zn-SOD中Cu（Ⅱ）处于酶活性中心，His45和His62残基在催化反应中 起促进底物或质子转移的重要作用，His119残基起辅助作用。His45-Cu-His62核心结构维持了Cu离子氧化还原变化和蛋白质整体酶活性。相比之下，His47残基对SOD催化活性几乎没有影响。通过带正电的残基（如HisCu/Zn-SOD的Lys136和Arg143）将底物引导到活性位点后，底物{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}自由基与Cu²⁺结合。此后Cu²⁺被还原为Cu⁺，{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}转变为氧分子^［25-28］。桥接组氨酸（HisCu/Zn-SOD-His61）质子化，在后步反应中质子化的His61和Cu⁺的一个电子供给{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}，随后还原成过氧化氢或\mathrm{H}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}^［29］。从而，铜离子和桥接组氨酸的链接恢复^［30］。

2.2　Mn-SOD和Fe-SOD

除了大量的氧代谢外，线粒体DNA具有较低的修复效率和组蛋白含量，容易引发氧化损伤^[31]。线粒体是细胞呼吸的主要场所，因此位于线粒体的Mn-SOD在ROS平衡中至关重要。在Mn-SOD和Fe-SOD结构中，有N末端螺旋和C末端α/β结构域。N末端结构域介导多聚体，大多数细菌结构形成二聚体。Mn-SOD和Fe-SOD的活性位点位于N端和C端结构域之间，与Cu/Zn-SOD的活性位点不同之处在于含有单一金属离子。Fe-SOD和Mn-SOD家族的所有成员在序列上密切相关，并采用高度相似的结构：大肠杆菌（Escherichia coli）Mn-SOD是由普遍保守的His26、His81、His171和Asp167 3个组氨酸和1个天冬氨酸侧链构成；人类的Mn-SOD金属离子在应变三角双锥几何结构中是通过4个氨基酸侧链His26、His74、Asp159和His163构成^［32-35］。Fe-SOD和Mn-SOD分子筛选机制与Cu/Zn-SOD相似，都是通过空间位阻和静电操纵限制只有底物超氧化自由基进入，残基His30和Tyr34起到守门残基的作用，特异性地阻断金属离子的进入^［36］。通过定向进化获得Mn-SOD的 2个活性恢复突变C140S和N73S，它们可以使亲本Q143A突变体的活性提高5倍左右^［37］。根据突变相关研究，大部分突变都是活化突变，也就意味着Mn-SOD是被高速调节的以接近扩散限制的速率并以可控的方式去除多余的超氧化物，保持ROS的动态平衡。

2.3　Mn-SOD、Fe-SOD以及Cu/Zn-SOD之间的进化关系

上文提到Mn-SOD和Fe-SOD的活性位点相同，三维构象类似，与Cu/Zn-SOD较为不同；但三者的分子筛选机制类似。为了能够直观地体现它们之间的进化关系，本研究在NCBI中获取了拟南芥的SOD氨基酸序列，构建了拟南芥与其他物种SOD之间的进化树（见图2）。拟南芥与瑞典拟南芥（KAG75462541 Arabidopsis suecica）的Fe-SOD亲缘关系较为接近；与萝卜（XP 0184335161 Raphanus sativus）的Mn-SOD亲缘关系较为接近；与丛林拟南芥（XP 0028809451 Arabidopsis lyrata subsp. Lyrata）的Cu/Zn-SOD亲缘关系较为接近。

2.4　Ni-SOD

Ni-SOD形成右旋4-螺旋束，组装成外径约为60 Å的球形均六聚体结构和20 Å深的中心空腔。每个亚基包含1个从4个螺旋束突出的N-末端钩状结构，并螯合单个Ni离子；2个Ni离子之间的最近距离为23 Å，排除了之前提出的双核Ni-Ni活性位点。9个残基的基序His-Cys-X-X-Pro-Cys-Gly-X-Tyr形成了新的钩状结构^［38］，此结构在各类SOD酶中催化不同的金属离子有不同的氧化还原电位（E^θ值范围从Ni²⁺/Ni³⁺氧化还原对的2.26 V到Cu²⁺/Cu⁺的0.15 V），它们不同的蛋白质结构必须精确而不同地调节各自金属离子的反应性，以优化SOD的歧化（最佳E^θ约为0.35 V）^［39］。蛋白质对金属反应性的控制对于Ni-SOD来说尤其重要，因为Ni的氧化还原对远远超出了使其能够与超氧化物底物反应的范围^［40］，其中连接Ni的半胱氨酸配体可能参与了降低氧化还原电位的作用^［41］。催化金属的还原电位被优化以促进歧化的机制尚不明确，仍待解析。

Ni-SOD是独立进化的，但它采用了与其他SOD类似的策略来限制对活性位点的访问。除了Fe-SOD和Mn-SOD的门控酪氨酸外，还利用空间位阻和静电操纵的组合来控制超氧化物底物的进入^［42］。

3 SOD的胁迫应答

植物在其生长发育过程中可能遭遇多种生物和非生物胁迫，如病虫害、干旱、盐碱、重金属、冷害、光照等。在多种胁迫下，植物体内的ROS动态平衡可能遭到破坏，超氧化物歧化酶的活性升高可加速清理ROS，保护细胞免受损伤。

3.1　超氧化物歧化酶在植物抗旱胁迫中的作用

干旱作为限制植物生长的主要非生物胁迫之一，目前呈现出常态化发展的趋势，对植物的影响十分深刻^［43］，主要体现在植物的萌发、生长、代谢过程以及养分运输等方面^［44］。当植物遭受干旱胁迫时，会产生大量的活性氧类，当活性氧产生和清除的平衡遭到破坏时，就会大量积累，进而使膜脂过氧化，并对植物细胞产生伤害，可严重影响植物的生长发育甚至致其死亡^［45-46］。对于植物细胞来说，增强和维持抗氧化酶的活性，避免对光合机构、膜系统等造成伤害是其抵御逆境伤害的重要途径^［47］。王梦姣等^［48］研究发现，过表达转MbCSP基因的拟南芥，在干旱条件下SOD活性始终高于野生型。牟舒敏等^［49］研究发现，转Cu/Zn SOD & APX基因的甘薯（Dioscorea esculenta）通过提高抗氧化酶活性，可以有效降低膜脂损伤，维持叶片中较高的光合色素水平，从而保持较高的光合能力来增强抗旱性。马涛等^［50］研究发现，植物受到干旱胁迫后，抗旱性越强的品种，其超氧化物歧化酶活性越强，上升幅度越大，Hahn等^［51］认为超氧化物歧化酶上升幅度越大的品种，更容易受到干旱胁迫的影响。在杨芮^［52］的研究中提到，不同品种的红掌（Anthurium andraeanum）对干旱胁迫的反应不尽相同，超氧化物歧化酶活性最稳定的品种抗旱能力最强。在干旱条件下，与野生型相比，过表达ScMnSOD基因的拟南芥体内的活性氧积累明显减少^［53］。宋晓宏等^［54］克隆了毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）GpSOD基因，在干旱试验中发现，GpSOD蛋白与毛尖紫萼藓响应干旱胁迫的过程密切相关，该结果为进一步寻找抗氧化胁迫基因提供了前提条件。

3.2　超氧化物歧化酶应答植物盐碱胁迫的作用机制

植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽还原酶（glutathione peroxidase，GR）等，这些抗氧化酶的活性与植物对盐碱胁迫的耐受性相关，是维持氧化还原稳态所必需的^［55］。研究表明，在NaCl胁迫下花花柴（Karelinia caspia）的抗氧化酶（SOD、APX）活性和非酶抗氧化剂含量均显著提高，随着NaCl浓度的提高，相关酶和非酶抗氧化剂合成基因（KcCu/Zn-SOD、KcAPX6、KcHCT、KcHPT1、Kcγ-TMT、KcF3H、KcSAMS和KcSMS）的表达也上调。这些反应有利于清除过量的ROS，维持H₂O₂和{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}水平的稳定^［56］。石亚飞等^［57］发现碱胁迫下水稻幼苗的抗氧化酶活性增强，同时相关的抗氧化酶基因表达也增强，从而抵御活性氧对细胞的伤害。

研究^［58］发现，在长期进化过程中盐生植物可获得一种适应性生化机制，使其可以在高盐环境中长期保持高活性状态。Zhang等^［59］研究发现，在低浓度胁迫下，盐胁迫和碱胁迫对五脉山黧豆（Lathyrus quinquenervius）的影响比较相似，而在高浓度碱胁迫下Na⁺失衡，H₂O₂和丙二醛积累，诱导细胞内氧化胁迫，显著提高了SOD的活性。另外，盐生植物比非盐生植物具有更高的盐胁迫适应能力，是因为盐生植物中的SOD水平比非盐生植物中的SOD水平更高，SOD活性增强能够抵抗盐碱胁迫造成氧化失衡的危害^［60］。这些研究对于盐碱地的开发利用具有积极意义。

活性氧清除系统中抗氧化酶基因表达及抗氧化酶活性与植物对抵御盐胁迫的能力密切相关。宋世伟等^［61］对盐碱胁迫下野大麦（Hordeum brevisubulatum）的检测中发现，对照组与试验组野大麦相比，SOD活性呈较大幅度的增强；在转录层面发现，SOD编码基因表达上调。付畅等^［62］将获得的研究显示，西伯利亚蓼（Polygonum siberianum）PsMn-SOD基因表达的酵母菌，在NaCl、Na₂CO₃和NaHCO₃胁迫下，与对照菌株相比，SOD活性增强。由此说明，植物可通过上调SOD转录水平、提高SOD表达活性等方式来抵御盐碱毒害。李蔚等^［63］利用西伯利亚蓼PsnsLTP基因转化烟草（Nicotiana tabacum）发现，在盐碱胁迫下，SOD和POD活性以及上升幅度要高于野生型，从而使转基因烟草具有较好的生长性状和较强的抗病能力。盛艳敏等^［64］发现，当向日葵（Helianthus annuus）受到盐碱胁迫时，SOD活性随pH升高而增强。李子英等^［65］研究表明，当盐浓度为150 mmol·L^-1，pH低于9.51时，盐柳1号（Salix psammophila ‘Yanliu No.1’）幼苗SOD活性显著提升。由此说明，SOD活性的增强可有效清除植物体内活性氧，减轻其对生物膜结构的伤害，使植物对盐碱毒害环境有更好的适应性。

3.3　超氧化物歧化酶在植物冷害胁迫下的活性氧清除作用

冷害是温度低于植物最适温度下限（0 ℃以上的低温）所导致的一种常见的生理失调^［66］。与冻害相比，冷害症状没有那么明显。主要机理：低温改变细胞膜的膜相，抑制了细胞功能的正常运行，进而影响植物生长发育^［67］。植物在遭受冷害时，体内ROS含量随之增高，给植物带来细胞损伤^［68］。在长期遭受冷害等不良因素胁迫过程中，植物形成了一套调节体内ROS含量的复杂系统，在这个系统中SOD是不可缺少的一部分。

同一株植物不同组织器官对冷害的抗逆性不尽相同。魏臻武等^［69］在研究苜蓿（Medicago sativa）抗寒能力的过程中发现，苜蓿根、茎和叶片经抗寒锻炼SOD活性变化不一致，叶中SOD活性水平低于根茎。有研究表明，植物果实成熟的不同阶段对冷害的敏感程度有所区别，Wang等^［70］通过研究“红阳”猕猴桃（Actinidia chinensis cv. ‘Hongyang’）果实的3个成熟阶段对果实冷害、抗氧化能力和能量代谢的影响发现Ⅱ期和Ⅲ期果实较Ⅰ期果实对冷害的耐性更强，具有更高的超氧化物歧化酶含量。另有研究表明，同一物种的不同品种对冷害胁迫的应答也不尽相同。Kabay^［71］通过研究不同大豆（Glycine max）发现，敏感大豆和耐低温大豆经过相同处理后，在SOD含量上存在显著差异，耐低温大豆的SOD含量高于敏感品种的大豆，说明SOD活性升高可以增加植物的耐寒性。

自然条件下，季节变化可能导致植物体内产生大量的活性氧。为了有效清除累积的活性氧，SOD等酶的含量也会随之增加。关雪莲等^［72］研究发现3种卫矛属（Euonymus）植物在10—12月叶片SOD含量持续上升，丙二醛（MDA）含量逐渐下降，说明SOD对MDA具有消除作用；但在12月—次年1月SOD含量下降而MDA含量逐渐上升，这在一定程度上说明植物体内的调节作用是有限的，不能无限地缓解MDA对植物的损害。

另有研究表明，一些转基因植株与野生型植株相比具有更强的抗寒能力。刘荣梅等^［73］在研究低温胁迫对转基因烟草的影响中发现转RD29A-CBF3基因烟草的SOD活性高于野生型烟草，这对在分子方面研究植物抗寒具有借鉴作用。

4 总结与展望

当植物遭受逆境胁迫时，其体内的活性氧自由基动态平衡被破坏，导致活性氧迅速积累。作为细胞内植物防御机制的重要组成部分，SODs构成了抵御非生物胁迫产生过量ROS及其反应产物的第一道防线，高等植物中的SODs大多对外源性刺激具有高度反应。由于不同的SOD分布于不同的亚细胞结构体中，因此，常见的Mn-SOD、Fe-SOD及Cu/Zn-SOD在植物细胞中发挥功能不冲突，可有效减缓过量活性氧带来的损伤。

近年来，研究人员利用SOD的酶活性，其在抗旱、耐盐碱作物改良中得到广泛应用。本研究团队克隆了水稻OsZFP6基因并构建植物表达载体，进行同源转化，研究过表达和野生型株系在不同胁迫条件下的生长差异。试验发现，在碱性盐和H₂O₂逆境下，过表达OsZFP6的水稻表现出较强的耐受性，体内MDA和H₂O₂含量均低于野生型。因此OsZFP6基因可能直接或间接地通过调节SOD等相关抗氧化酶基因表达清除累积的过氧化物。此研究对于含有ZFP6基因的物种改良具有一定的理论和实践意义^［74］。另外，在一些植株的运输贮存、农业生产中，SOD也有很大的应用前景。通过SOD基因遗传转化技术培育高抗逆性农作物新品种，利用克隆基因与表达技术实现SOD的大规模发酵生产也是目前的研究热点之一。

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基金资助

东北林业大学校级教改课题项目(DGYYJ2022-21)

科技基础资源调查专项(2021FY100403)