睡莲种质花粉形态特征

Studies on Pollen Morphological Characteristics of Nymphaea Germplasm

摘要

为探讨睡莲属（Nymphaea）花粉形态特征及其在分类学的意义，以睡莲属5个亚属和2个跨亚属共 113个种或品种花粉为材料，使用扫描电镜对其花粉形态进行观察研究。结果表明：（1）睡莲属植物花粉粒均为单粒，辐射对称，中等大小（10.05~37.04） μm×（21.96~64.83） μm。（2）86份睡莲花粉萌发沟为赤道环槽，23份为远极环槽，4份为远极单槽。（3）花粉外壁纹饰包括平滑型、微疣、粗糙型、瘤状和棒状纹饰型、具小窝型。（4）113份睡莲种质共聚为5个类群，其中广温带亚属萌发沟以远极环槽为主，外壁纹饰以瘤状和棒状为主，可以区别于其他亚属。研究认为，睡莲属不同亚属和跨亚属植物花粉大小、萌发沟类型、外壁纹饰存在一定差异，可以作为分类的辅助参考指标，为睡莲种质亲缘关系及系统发育研究提供孢粉学依据。

Abstract

To explore the pollen morphological characteristics of Nymphaea and their taxonomic significance， the pollen of 113 species or cultivars from five subgenera and two trans-subgeneric hybrids of Nymphaea were used as materials and their pollen morphological characters were observed by scanning electron microscope. The results showed that： （1）The pollen of Nymphaea were all single grains， radially symmetric， and medium size（10.05-37.04） μm×（21.96-64.83） μm. （2）Among them， the pollen germination troughs of Nymphaea in 86 samples were zonoporate， 23 samples were anazonoporate， and 4 samples were anacolpate. （3）The pollen exine ornamentation included smooth， micro verrucous， rough， nodular， baculate， and caveola type. （4）The 113 samples of Nymphaea germplasms were clustered into five groups， of which the subgenus Nymphaea was characterized primarily by anazonoporate germination trough and nodular and baculate exine ornamentation， distinguished it from other subgenera. In conclusion， there were some differences in pollen size， germination trough type， and exine ornamentation among different subgenera and trans-subgeneric hybrids of Nymphaea， which might serve as auxiliary reference indicators for classification and provided palynological evidence for the study of genetic and phylogenetic relationship of Nymphaea.

Graphical abstract

关键词

睡莲属 / 花粉微形态 / 扫描电镜 / 聚类分析

Key words

Nymphaea / pollen micromorphology / scanning electron microscope / cluster analysis

睡莲为睡莲属（Nymphaea）多年生水生草本浮叶植物，属于被子植物基部类群，对于揭示被子植物性状起源和演化具有重要意义。睡莲花色和叶色丰富、花期较长，是重要的水景观赏植物，一些小型品种也可用于家庭盆栽^［1-2］。睡莲还有净化水体的功能，能吸收水体中镍、镉等重金属有害物质及过剩的营养物质^［3-4］。此外，睡莲可用作鲜切花，同时其花朵、嫩叶、叶柄、块茎等部位还具有饮用、食用和药用价值^［5-7］。根据心皮附属物有无可将睡莲属进一步分为5个亚属，分别是古热带亚属（Lotos）、新热带亚属（Hydrocallis）、澳大利亚亚属（Anecphya）、广热带亚属（Brachyceras）和广温带亚属（Nymphaea），亚属间在开花时间、心皮形态、传粉生物学等方面表现出显著差异^［8-9］。除此之外，通过远缘杂交手段已育成两类跨亚属杂交后代：第一类以广温带亚属为母本，广热带亚属为父本，代表品种有‘侦探艾丽卡’睡莲（N.‘Detective Erika’）和‘英仙座流星雨’睡莲（N.‘Perseids’）等；第二类以澳大利亚亚属为母本，广热带亚属为父本，代表品种有‘康弘’睡莲（N.‘Yasuhiro’）和‘凯斯隆’睡莲（N.‘Kaisorn’）等。

睡莲属具有丰富的遗传多样性和广泛的演化路径^［10-13］，为深入理解睡莲属的系统进化，当前研究主要基于形态学^［14-15］、解剖学^［16］及分子生物学^［17-18］等手段。随着全球气候和环境的不断变化，睡莲的叶片、花朵大小及某些质量特性都在逐渐发生改变，不同分布区域的睡莲形态特征展现出显著差异^［19］，因此有必要增加更细微的形态特征观察，以助力睡莲属分类、亲缘关系及系统进化方面的研究。

花粉作为植物独特的器官，是植物遗传信息的直接体现。花粉经过长期进化，形成了稳定的形态特征，如大小、形状、孔径类型和外壁装饰等，这些特征为研究系统分类、追溯起源演化、解析遗传多样性提供了关键证据^［20-21］。花粉特征被认为在植物进化史上占有重要地位，而睡莲属于被子植物基部类群之一^［22］，因此从孢粉学角度研究睡莲属植物对于了解早期被子植物系统进化具有重要意义^［23］。目前已有部分关于睡莲属植物花粉形态的研究，例如，张玉龙^［23］、杨梅花等^［24］、刘子毓等^［25］利用扫描电镜观察睡莲属花粉后，发现睡莲属花粉均为单粒花粉，萌发孔为环槽类型；周庆源^［26］对14个睡莲属植物花粉开展研究，指出睡莲属不同种花粉形态变异很大，花粉槽位置有从远极到赤道的位置变化，花粉表面有光滑型或有各种纹饰；曹婧等^［27］对18种或品种睡莲属植物花粉进行扫描电镜观察并分析，将其聚为4个类群，其中广温带亚属和广热带亚属亲缘关系最近；Zini等^［16］和Zhang等^［19］分别对新热带亚属和广温带亚属各3个睡莲种质花粉粒超微形态观察，发现新热带亚属花粉粒较光滑，而广温带亚属花粉外壁具有棒状和瘤状纹饰。现有研究中涉及睡莲亚属种或品种的数量较少，跨亚属杂交后代花粉特征仍未见报道，需要系统大范围针对睡莲属5个亚属和跨亚属后代的花粉形态特征进行梳理，开展对比研究。

因此，本研究以睡莲属113个种或品种植物花粉为材料，利用扫描电镜（SEM）对其花粉形态、萌发器官、外壁纹饰等进行观察比较，并基于花粉特征进行聚类分析，探讨睡莲种质演化及亲缘关系，为睡莲属亚属间分类鉴定、杂交育种、种质资源创新提供孢粉学参考。

1 材料与方法

1.1　材料

试验材料包括睡莲属植物5个亚属、2个跨亚属共113份花粉样本，其中含36个种和77个品种（表1）。样本采于2023年6—7月，采自中国科学院植物研究所睡莲国家种质资源库，每种材料采集5个单株的新鲜花粉，混合包装好并置于变色硅胶中干燥。

1.2　扫描电镜观察

用洁净棉签轻轻蘸取少许花粉并转移至导电胶上，使用真空镀膜仪（Leica EM ACE600）喷镀，并使用扫描电镜（Hitachi Regulus 8230）进行观察和拍照。花粉照片分别在300~400倍、1 500~ 2 000倍、5 000~8 000倍视野下拍摄代表性的花粉粒群体、极面观、赤道面观和表面纹饰。

1.3　数据处理

每种材料统计10粒花粉，用ImageJ测定其极轴长度（P）和赤道轴长度（E），计算得到平均值、花粉极赤比（P/E）、体积大小指数（\sqrt[]{P\times E}）。利用Microsoft Excel 2010和SPSS 21.0软件进行数据统计和分析，结果用平均值±标准差表示。采用单因素方差分析检验各指标差异。描述性孢粉学术语参照《孢粉学概论》^［28］。

使用SPSS 21.0软件进行系统聚类分析，共基于4个指标，其中包括1个定量指标——体积大小指数，以及3个定性指标——极面形状、萌发沟类型和外壁纹饰。定量指标直接取其数值，定性指标按照性状编号为“1，2，…，n”。聚类方法为Ward法，根据欧氏距离测量。

2 结果与分析

2.1　花粉大小和形状

如表2、图1~2、附表1所示，扫描电镜观察发现，睡莲5个亚属和2个跨亚属共113份供试花粉形态均为单粒，辐射对称，花粉外观为扁球形和超扁球形，极面观为圆形、三角形、长圆形等。

花粉粒极轴长度为10.05~37.04 μm，赤道轴长度为21.96~64.83 μm。‘艾伯特·徳·莱斯唐’睡莲花粉最大，体积指数为48.95；其次是‘盛世’睡莲和‘阴阳’睡莲，体积指数分别是47.54和41.66；‘黄金国’‘曼谷粉豹’‘巴拿马太平洋’睡莲花粉 最小，体积指数依次为14.91、15.75、15.77（附表1）。花粉粒极赤比为0.36~0.72，按照花粉形状P/E分级标准，供试睡莲花粉P/E为0.5~0.88的占78.76%，呈扁球形，其余睡莲种质花粉为超扁球形，P/E小于0.5。

睡莲亚属及跨亚属间花粉形态特征比较见表3。结果可见，5个亚属和2个跨亚属的极轴长、赤道轴长、体积大小指数均存在极显著差异（P<0.01），极赤比差异不显著（P>0.05）。其中，澳大利亚亚属与广热带亚属跨亚属杂交后代花粉的极轴长度、赤道轴长度、体积大小指数均是最大的，其次为澳大利亚亚属，二者间无显著差异。广温带亚属与广热带亚属的跨亚属杂交后代 花粉的极轴长度、赤道轴长度、体积大小指数 均最小。5个亚属花粉由大到小依次为澳大利 亚亚属、古热带亚属、广温带亚属、新热带亚 属、广热带亚属，其中澳大利亚亚属花粉大小极显著高于其他4个亚属，而其他4个亚属间无显著差异。

2.2　花粉萌发器官

‘斑叶’蓝星睡莲、‘黑美人’睡莲、‘蓝美人’睡莲、延药睡莲不同于其他睡莲属植物，为远极单 槽萌发沟；其余109个睡莲种质花粉的萌发沟是环绕花粉的一个圆形槽，其中86个为赤道环槽， 23个为远极环槽（表2、附表1）。进一步结合亚属及跨亚属分析发现，呈现远极环槽类型的均为广温带亚属，且广温带亚属中76.67%花粉为远极环槽萌发沟。除了4个广热带亚属睡莲花粉为单槽萌发沟外，其他广热带亚属花粉（占89.19%）均为赤道环槽。

2.3　花粉外壁纹饰

供试睡莲花粉外壁纹饰存在一定差异，具有不同类型（表2、图1~2）。根据花粉表面纹理特征和表面附属物起伏结构，睡莲属的花粉外壁纹饰可以归纳为以下几个主要类型。

平滑型：花粉外壁表面相对平滑，无明显的纹饰或附属物。供试样品有37份属于该类型，占32.74%。古热带亚属、新热带亚属、澳大利亚亚属花粉外壁主要为平滑型。

微疣、粗糙型：整体稍粗糙，外壁具有微小疣状突起，同时形成不同的起伏结构，包括浅波状、皱波状、颗粒突起等。42份样品属于该类型。广热带亚属的花粉外壁以此类型为主，该亚属37个种或品种中，微疣、粗糙型花粉外壁纹饰占72.97%，该亚属其他花粉为平滑型。

瘤状和棒状纹饰型：外壁密集分布瘤状和棒状突起，瘤状主要呈现圆形或椭圆形的形态，而棒状突起长短不一，尾部稍钝。23份样品属于该类型。广温带亚属花粉外壁以此类型为主。30个广温带亚属种或品种中，有23个具有瘤状和棒状外壁纹饰。

具小窝型：外壁近平滑，均匀分布孔形内凹状小窝。11份样品属于该类型。广温带亚属与广热带亚属的跨亚属杂交后代除‘洛璃’睡莲花粉外壁微疣、粗糙外，其他花粉外壁均为具小窝类型。

2.4　聚类分析

花粉形态聚类分析结果表明（图3），113个睡莲共聚为5个类群。类群Ⅰ包含18个睡莲，均呈扁球形、赤道环槽萌发沟，外壁纹饰为平滑型，古热带亚属的6份种质和新热带亚属的5份种质均在该类群。类群Ⅱ共有23份花粉，包括澳大利亚亚属和广热带亚属的10个杂交后代、8个澳大利亚亚属和5个广热带亚属；该类群花粉粒大小为5个类群最大，极轴长、赤道轴长和体积大小指数均显著大于其他4个类群，花粉萌发沟均为赤道环槽。类群Ⅲ包含26个睡莲，其中广温带亚属和广热带亚属的12个杂交后代均在此类群；该类群花粉粒较小，极轴长、赤道轴长和体积大小指数均为5个类群中最小的，极面形状均为圆形，萌发沟均为赤道环槽类型。类群Ⅳ包含19份种质，包括14个广热带亚属和5个广温带亚属；极面形状以三角形和长圆形为主，萌发沟均为赤道环槽类型，花粉外壁微疣、粗糙。类群Ⅴ包含27个睡莲，其中23个是广温带亚属，具有远极环槽萌发沟，花粉外壁均为瘤状和棒状纹饰；其他4个是广热带亚属，为远极单槽萌发沟及微疣、粗糙、皱波状外壁纹饰。

3 讨论

睡莲属是睡莲科（Nymphaeaceae）中最大的属，划分为5个亚属。睡莲属花粉的形态特征丰富，形状以扁球形和超扁球形为主，与刘子毓等^［25］的研究结果一致，也有研究^［26-27］认为睡莲属花粉以扁球形和球形居多。试验结果的差异可能源于花粉粒制备方法的不同，本研究采用自然干燥法处理花粉样本，力求保持花粉的原始状态，然而，前人^［25］的研究中多使用2.5%戊二醛溶液来固定花粉，这种方法虽然有其独特优势，但会导致花粉吸收一定的水分而发生膨胀，可能会造成一些细微结构失真^［25］。此外先前文献^{［24，27］}中的睡莲属材料数量有限，本研究共统计了113份花粉材料，数量较大，统计到呈超扁球形的花粉占21.24%。

通过对睡莲5个亚属花粉形态指标进行比较发现（表3），澳大利亚亚属的花粉最大（体积大小指数为33.68±6.44），极显著大于其他亚属花粉 （P<0.01），古热带亚属和广温带亚属花粉大小居中（体积大小指数分别为25.63±1.08和25.41±3.74），新热带亚属和广热带亚属花粉最小（体积大小指数分别为23.93±3.58和22.81±4.65）。这一结果与刘子毓等^［25］对5个亚属16种睡莲属植物花粉大小的排序结果总体一致，仅与其中新热带亚属和广温带亚属的大小顺序相反，这可能与刘子毓等^［25］样本数量少（新热带亚属2种，广温带亚属1种）导致的误差有关。目前关于睡莲花粉的研究鲜有涉及跨亚属杂交种，本研究进一步结合2个跨亚属花粉比较，发现澳大利亚亚属和广热带亚属的杂交后代花粉粒也较大（体积大小指数为36.44±5.86），虽然数值大于澳大利亚亚属，但二者无显著差异；另一个跨亚属组合——广温带亚属和广热带亚属的杂交后代花粉最小（体积大小指数为17.62±1.55），均极显著小于5个亚属的花粉。上述花粉大小的差异可以作为区分睡莲属不同亚属及跨亚属的一个重要指标。此外，花粉大小在被子植物系统进化过程中，呈现由大到小的进化趋势^［29］，可以推测澳大利亚亚属睡莲可能处于较原始的位置，而广热带亚属睡莲进化程度较高，这与利用分子手段得到的睡莲属进化关系有一定的区别^［22］。

植物花粉的萌发沟特征可以作为植物系统进化过程的一个标志。Walker^［29］研究指出花粉演化过程中其萌发沟具有如下规律：远极单槽为原始类型，远极环槽花粉由其演化而来，而赤道环槽则是花粉演化的最进化形态。本研究的113份供试材料中，延药睡莲（编号B49）、‘斑叶’蓝星睡莲（编号B53）、‘蓝美人’睡莲（编号B7）、‘黑美人’睡莲（编号B64）等4份属于广热带亚属的睡莲花粉萌发沟呈远极单槽，是最原始类型，与之前一些研究结果不同，如张玉龙^［23］报道的延药睡莲、杨梅花等^［24］报道的‘蓝美人’睡莲萌发沟呈赤道环槽，这可能与花粉某些形态特征受居群、个体及地理环境等多种因素的影响而表现出的复杂性有关^［30］。此外，23份睡莲花粉为远极环槽萌发沟，均属于广温带亚属，是较原始类型，此前杨梅花等^［24］研究的3种广温带亚属睡莲花粉萌发孔也均为远极环槽。其他86份睡莲均为赤道环槽，是较进化类型。

花粉外壁纹饰的演化规律，从光滑到颗粒状、棒状、刺状，最终至条纹状和网状，反映了植物进化的一般趋势^{［20， 25］}。本研究中睡莲属花粉按照外壁纹饰可分为4种类型。供试材料花粉外壁纹饰存在显著多样性。古热带亚属、新热带亚属、澳大利亚亚属外壁较为平滑，说明它们在睡莲属植物中较为原始、进化程度较浅，与Zini等^［16］关于新热带亚属的研究结果一致。广热带亚属花粉外壁多微疣、粗糙、呈皱波状，进化程度中等。广温带亚属花粉外壁具瘤状和棒状凸起，与Zhang等^［19］研究结果一致，该亚属进化程度较高。曹婧等^［27］分析了来自4个亚属的18份睡莲花粉，认为进化上从原始到高等依次是古热带亚属、澳大利亚亚属、广热带亚属、广温带亚属，本研究在进一步充实数据的基础上，得出了一致的结论，表明睡莲属花粉的形态特征在揭示该属植物的演化路径方面具有重要的参考价值，也进一步证实了睡莲属植物在进化过程中遵循着一定的规律性发展模式。值得注意的是，本研究首次报道杂交后代的花粉形态，发现广温带和广热带亚属杂交后代的花粉外壁不同于各亚属，且与父母本均不同，呈现近平滑并具有小窝式样，周庆源^［26］的研究中提到睡莲科中有该类型外壁纹饰，但文中未见该样式的具体实例，本研究相对应图片可作为补充。

通过对113种睡莲属植物基于花粉形态特征的聚类分析发现，各花粉形态分类与基于植物学特征的形态分类之间存在一定程度的一致性^［8］。在花粉大小和外壁纹饰特征上，睡莲属植物呈现遗传多样性与丰富性，不同亲缘关系的材料间存在显著差异，这些差异在一定程度上能够反映出亚属内部亲缘关系的紧密程度。例如，类群Ⅱ由体积大小指数较大的澳大利亚亚属，以及澳大利亚亚属和广热带亚属的杂交后代组成，这些材料的亲缘关系较近。类群Ⅲ则由体积大小指数较小的26份材料组成，包括广温带亚属和广热带亚属的杂交后代。类群Ⅴ以广温带亚属为主，该类群的23个广温带亚属花粉萌发沟均为远极环槽，且花粉外壁纹饰均为瘤状、棒状等，这些特征可以作为广温带亚属识别或鉴定的分类依据。类群Ⅳ和类群Ⅴ中均包含来自广温带和广热带亚属的部分种或品种，显示这2个亚属亲缘关系较近，通过人工授粉等手段，已证实这2个亚属可以成功杂交并获得跨亚属后代^［17］。古热带亚属（除L91外）和新热带亚属聚在类群Ⅰ里，Wiersema^［31］发现这2个亚属的花粉最相似，均为表面光滑、躯壳状环带粗糙，并认为它们的花粉类型有共同起源，本研究聚类结果也证明二者亲缘关系较近。睡莲属的孢粉学特征在一定程度上能反映亚属内亲缘关系的远近，但仅凭这些形态学证据还不足以明确睡莲种质具体的亲缘关系，因为植物在进化过程中可能会受到多种因素的影响，如基因突变、杂交、基因流等。这些因素可能导致植物在形态上发生变化，但并不一定会在孢粉学特征上表现出来，还需要结合分子证据进行综合分类，以便更准确地揭示植物间的亲缘关系，这需要进一步的研究和探索。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32102413)

中国科学院战略生物资源能力建设项目(KFJ-BRP-017-44)