钩藤水杨酸响应基因UrSTR4参与钩藤碱合成

The Salicylic Acid Responsive UrSTR4 Gene is Involved in Rhynchophylline Biosynthesis in Uncaria rhynchophylla

摘要

钩藤（Uncaria rhynchophylla）是我国传统中药材，其活性成分钩藤碱（RIN）和异钩藤碱（IRN）具有显著药理活性。异胡豆苷合成酶（STR）是RIN和IRN合成的关键酶，但其基因家族在钩藤中的功能分化尚不明确。该研究基于遮阴、乙烯处理下钩藤转录组及全长转录组数据，系统鉴定了27个钩藤STR基因家族成员（UrSTR1~UrSTR27）。进化分析表明，钩藤UrSTR基因家族显著扩张，可能通过功能分化响应不同环境信号。通过外源水杨酸（SA）处理发现，0.6 mmol⋅L^-1 SA处理显著提升钩藤叶片RIN和IRN含量，并强烈诱导UrSTR4基因表达，该基因相对表达水平提高至对照的30.6倍。多序列比对显示，UrSTR4基因编码蛋白虽缺失典型催化位点Glu-309，但与喜树CaSTR3基因编码蛋白具有相似羟基氨基酸残基。为验证其功能，首次建立基于植物活体转化系统的钩藤高效瞬时转化体系，转化最佳条件：8 kPa气压，1 min农杆菌侵染。瞬时过表达UrSTR4基因使RIN和IRN含量分别提高至对照的1.96倍和1.82倍。该研究为钩藤药用成分的代谢调控提供了新靶点，建立的瞬时转化体系为UrSTR基因功能研究提供了技术支撑。

Abstract

Uncaria rhynchophylla is a traditional Chinese medicinal herb， whose active components rhynchophylline（RIN） and isorhynchophylline（IRN） exhibit remarkable pharmacological activities. Strictosidine synthase（STR） is the key enzyme for RIN and IRN biosynthesis， yet the functional divergence of STR gene family in U. rhynchophylla remains unclear. Utilizing transcriptome data of U. rhynchophylla seedlings under shading and ethylene treatments， 27 STR genes（UrSTR1-UrSTR27） were systematically identified in U. rhynchophylla. Evolutionary analysis revealed significant expansion of UrSTR gene family， suggesting functional diversification in response to environmental cues. Exogenous salicylic acid（SA） treatment（0.6 mmol⋅L^-1） markedly increased RIN and IRN contents， while upregulating UrSTR4 expression level by 30.6-fold. Multiple sequence alignment showed UrSTR4 lacked the conserved Glu-309 residue but shared hydroxyl-containing residues with Camptotheca STR3. An efficient transient transformation system（8 kPa pressure， 1-min Agrobacterium infection） was established by using plant living transformation instrument. The transient overexpression of UrSTR4 enhanced RIN and IRN contents by 1.96- and 1.82-fold， respectively. This study identified new targets for metabolic regulation of bioactive compounds in U. rhynchophylla and the established transient transformation system provided technical support for functional research on UrSTR genes.

Graphical abstract

关键词

钩藤 / 异胡豆苷合成酶 / 水杨酸 / 瞬时转化 / 单萜吲哚生物碱

Key words

Uncaria rhynchophylla / strictosidine synthase / salicylic acid / transient transformation / monoter-penoid indole alkaloids

钩藤（Uncaria rhynchophylla）是茜草科（Rubiaceae）钩藤属（Uncaria）多年生木质藤本植物，已收录于欧洲药典。该植物以带钩枝茎入药，富含具有显著药理活性的萜类吲哚生物碱，表现出降压、镇静、抗惊厥、抗癫痫和抗肿瘤等多种功效^［1-2］。近年研究^［3］发现，钩藤属植物含有吲哚生物碱、三萜类、黄酮类等多种活性成分。其中，最新发现钩藤三萜酯类化合物表现出对HIV-1蛋白酶的强效抑制作用，有望开发出耐受性更好的抗逆转录病毒治疗方案^［4］。因其显著的药理活性和丰富的化学成分，钩藤正成为研究热点。

钩藤的主要药用活性成分为单萜吲哚类生物碱（monoterpenoid indole alkaloids，MIAs），包含钩藤碱（rhynchophylline，RIN）及其同分异构体异钩藤碱（isorhynchophylline，IRN）。异胡豆苷（strictosidine）是包括钩藤碱在内的超过2 000种MIAs的共同合成前体，合成过程由异胡豆苷合成酶（strictosidine synthase，STR）催化，通过耦合环烯醚萜途径来源的裂环马钱子苷和吲哚途径来源的色胺后生成，这一过程是MIAs生物合成的重要瓶颈之一^［5］。编码该酶的STR基因被认为是MIAs合成途径中最为重要的关键酶基因。STR基因已在多种生产MIAs的药用植物中被鉴定，包括萝芙木（Rauvolfia serpentina）^［6］、长春花（Catharanthus roseus）^［7］、美丽帽柱木（Mitragyna speciosa）^［8］、短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）^［5］、日本蛇根草（Ophiorrhiza japonica）^［9］和喜树（Camptotheca acuminata）^［10］等。在长春花、短小蛇根草和匍地蛇根草（Ophiorrhiza rugosa）中过表达STR基因均显著提高相应阿玛碱、长春碱和喜树碱等MIAs的积累^［11-13］。这些研究表明，STR基因是研究RIN生物合成的关键基因，遗传操控其表达可有效增强植物MIAs的合成与积累。

在已研究的MIAs资源植物中，除喜树被发现含有3条具有异胡豆苷合成酶活性的CaSTRs外，其他物种通常仅鉴定出1条与MIAs合成相关的STR基因。例如，短小蛇根草转录组中仅发现1条OpSTR，长春花中也只报道了1条参与长春碱合成的关键酶基因CrSTR。但是，近年来，一些团队从不同的研究角度陆续在钩藤中报道了9条UrSTR基因。周浩^［3］最先克隆了1条在钩藤茎和幼嫩叶中高度表达且编码蛋白与OpSTR一致性大于90%的UrSTR。Jiang等^［14］通过大肠杆菌异源表达系统鉴定了UrSTR1和UrSTR5编码蛋白酶活性，并证实其过表达可显著提高钩藤毛状根中MIAs含量^［14］。Yang等^［15］和Guo等^［16］分别利用原核表达系统验证了2条UrSTR基因在体外表达催化异胡豆苷合成。此外，穆德添等^［17］基于“基因组+转录组+代谢组”共表达分析筛选出1条受茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯和低温显著诱导的UrSTR。路星星等^［18］发现MeJA处理可显著上调UrSTR表达，而周浩等^［19］则报道脱落酸处理能诱导UrSTR1~UrSTR4的表达上调，并伴随MIAs含量的增加。Li等^［4］鉴定出1条受遮阴处理诱导的UrSTR，其表达受UrPIF3基因间接调控。由于这些UrSTR基因由不同团队独立命名，导致命名系统混乱，且多数尚未通过转基因试验功能验证。

水杨酸（salicylic acid，SA）是植物中最重要的酚类物质之一，影响种子萌发、气孔运动、色素积累、光合作用、乙烯生物合成、热量产生、酶活性、脱落逆转、养分吸收、开花诱导、膜功能、根瘤形成、代谢活动及植物的整体生长和发育^［20］。同时，SA作为关键的胁迫信号分子，可激活植物防御反应，促进次生代谢产物合成，增强植物抗逆性。外施SA或其衍生物乙酰水杨酸（ASA）在一定程度上能促进紫杉醇、丹参酮、托品烷生物碱、茋类、蒽醌和多酚等次生代谢产物的积累^［21］。在绒毛钩藤（Uncaria tomentosa）中，SA预处理显著提高茎和叶总MIAs含量，并使挥发油和总酚含量分别增加21%和80%^［22］。

本研究基于前期获得的遮阴处理（PRJNA691069）、乙烯处理（PRJNA699101）的钩藤转录组和全长转录组（未发表）数据，系统鉴定钩藤STR基因家族，重点分析已报道的9条UrSTR基因功能特征；探究外源SA对RIN和IRN合成的调控作用，筛选响应SA诱导的UrSTR基因；建立钩藤瞬时转化体系，快速高效地鉴定UrSTR的功能，为阐明钩藤生物碱合成机制和通过基因工程提高活性成分产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料与仪器

试验所用钩藤植株均来自贵州大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室。植物表达载体为携带绿色荧光蛋白GFP基因的植物双基因超表达载体p1305NKGFP^［23］。本研究使用的植物活体转化系统WONBIO-PTS来自上海万柏生物公司；蛋白激发光源LUYOR3415RG来自美国路阳公司；实时荧光定量PCR检测仪器Bio-Rad CFX Manager来自美国BioRad伯乐公司。

1.2　钩藤转录组中 UrSTR 基因的筛选鉴定及生物信息学分析

1.2.1　 UrSTR基因家族成员鉴定

为了了解UrSTR对萜类生物碱的影响，使用遮阴（NCBI SRA accession number：PRJNA691069）、乙烯处理的钩藤转录组（BioProject under the number PRJNA699101）和全长转录组数据鉴定UrSTR基因家族成员。首先，利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）的STR蛋白序列作为查询序列，利用TBtools软件1.120（阈值E<1e^-5）搜索的STR蛋白。然后从pfam数据库（http：//pfam-legacy.xf am.org/）下载STR家族的pamf登录号（PF03360），作为HMMER蛋白数据库HMMER（3.3.2）搜索的种子模型。然后，通过HMMER获得的候选蛋白和BLAST整合，去除重复蛋白，并使用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）、SMART（http：//smart.embl.de）和NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）数据库进一步确认。最后，除去部分不具备典型CDD及ORF不完整的UrSTR蛋白家族成员后，将最终得到的基因序列鉴定为UrSTR基因家族用于后续分析。

1.2.2　 UrSTR基因多序列比对及系统进化树构建

在UniProt（https：//www.uniprot.org）下载OjSTR（日本蛇根草，ACF21007.1）、OpSTR（蛇根草，BAB47180.1）、CrSTR（长春花，CAA37671.1）、NnSTR（茶茱萸，AZZ89575.1）、VmSTR（小蔓长春花，AEY82399.1）、RmSTR（萝芙木，CAA45025.1）、TeSTR（蟾蜍树，AEY82398.1）、CaSTR（喜树，AES93117.1）、MsSTR（美丽帽柱木，ABZ79473.1）、AtSTR （拟南芥）的STR蛋白序列，与UrSTR家族蛋白多序列比对，将多重比对结果导入MEGA-X中，使用邻接（NJ）方法构建具有1 000个自举重复的评估树。使用iTOL在线工具（https：//www.example.com）对NJ树进行可视化和优化，使用DNAMAN（9.0.1.116）软件进行氨基酸序列比对。

1.3　外源SA对钩藤生物碱合成的影响

为探究外源SA对钩藤UrSTR基因表达及生物碱合成的影响，本研究设置0.2、0.4、0.6 mmol·L^-1 3个SA浓度梯度，以半年生钩藤为试验材料，在连续6 d处理过程中，每48 h采集1次植株顶端嫩叶样品，测定次生代谢产物含量。通过分析试验数据，确定促进钩藤RIN和IRN生物碱积累的最佳SA浓度。随后，使用该最佳浓度重新处理钩藤材料，在暗周期前按照相同方法喷洒SA溶液，直至叶片表面均匀布满溶液水珠。分别于处理后2、4、8、12、24 h，与对照组同步从植株相同高度取样，用于检测相关酶基因的表达量。

1.4　钩藤瞬时转化体系的建立

1.4.1　超表达载体的构建

本研究采用的植物表达载体p1305NKGFP由商业载体pCAMBIA1305.1改造^［23］而来，通过替换葡萄糖苷酸酶GUS基因为绿色荧光蛋白GFP基因，同时在pCAMBIA1305.1骨架上插入整合pBI121的CaMV35S-GUS-NOST表达框而来，所以p1305NKGFP载体是同时携带GUS和GFP基因的植物双基因超表达载体。为构建STR4表达载体，通过BamHⅠ和SacⅠ酶切去除p1305NKGFP中的GUS片段。设计特异性引物（含BamHⅠ和SacⅠ酶切位点），PCR扩增获得STR4基因片段，并将其定向克隆至载体原GUS区域，成功构建35S：：STR4植物表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌（Escherichia coli）DH5ɑ感受态细胞，经测序验证正确后，用于后续试验。所用引物序列详见表1。

1.4.2　植物活体转化系统法

该方法借助植物活体转化系统，利用气压作用，促使受试植物或组织迅速形成微小通道，以便需导入植物的物质能够通过这些通道进入组织并实现转化。本研究采用携带绿色荧光蛋白的植物表达载体p1305NKGFP为转化对象，以农杆菌EHA105介导。选择生长状况良好，叶片幼嫩的半年生钩藤植株。将植株倒置于菌液中，在8 kPa的气压下分别进行30 s、1 min、2 min、3 min渗透处理。转化完成后，暗培养2 d。随后，将植株转入正常光照培养。在后续的观察过程中，利用蛋白激发光源LUYOR 3415RG照射植株，并佩戴LUYOR LUV-30A观察眼镜观察荧光情况。

1.5　钩藤生物碱的提取和测定

准确称取约0.2 g（精确到0.000 1 g）试样于15 mL透明离心管，加入1.2 mL氨水，放置振荡器充分振荡混匀1 min，静置30 min，随后加入12.35 mol·L^-1甲醇和7.80 mol·L^-1二氯甲烷各4 mL，室温超声30 min，4 000 r·min^-1离心10 min，转移上清液于新的离心管中，氮气吹干，4 mL甲醇溶解，涡旋，取上清液过0.22 μm滤膜，作为供试品溶液。在岛津LC-60A高效液相色谱仪器上采用HPLC法测定钩藤生物碱含量。色谱条件如下：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%氨水溶液（体积比7∶3）；采用等度洗脱模式；流速设定为1.0 mL·min^-1；柱温控制在40 ℃；进样体积为20 μL。钩藤碱和异钩藤碱的标准品购于索莱宝科技有限公司。通过建立标准曲线进行定量分析，将样品峰面积代入回归方程计算得到提取液中钩藤碱和异钩藤碱的质量浓度。

1.6　 UrSTR 基因的分子检测

为评估UrSTR基因表达水平，使用RNA提取试剂盒（诺维赞生物科技，北京）从钩藤（根、茎、叶、花、钩）及SA处理的钩藤叶中提取总RNA，并按照PrimeScript^RT试剂盒（Takara Bio，大连）说明书反转录成cDNA。采用Beacon Designer软件设计mTAs生物合成途径基因特异性qPCR引物，引物序列详见表1。采用实时荧光定量PCR技术分析mTAs生物合成途径基因的表达谱，以GAPDH作为内参基因，使用SYBR Premix EX Taq试剂盒（Takara Bio，大连）在Bio-Rad实时PCR系统上，分别检测UrSTR在各组织的表达水平及SA处理下UrSTR基因表达情况。采用2^-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1　 UrSTR 家族成员鉴定

2.1.1　 UrSTR基因筛选

基于遮阴处理、乙烯处理的钩藤转录组、全长转录组共鉴定出27条STR基因，命名为UrSTR1~ UrSTR27，其中，UrSTR1~UrSTR6的命名与Jiang等^［14］的报道保持一致。分析发现（表2）：UrSTR1~ UrSTR14的氨基酸残基长度与其他植物STR基因相近，提示其功能保守性。值得注意的是，UrSTR10和UrSTR14具有完全相同的编码区特征（341个氨基酸），但非编码区差异显著，推测其为基因复制后调控功能分化的结果。UrSTR1~UrSTR14编码蛋白整体呈现典型STR酶特征，而UrSTR15~UrSTR27多为短开放阅读框（ORF），可能具有调控功能。

2.1.2　 UrSTR基因系统进化树

为探究钩藤UrSTR基因家族的进化关系，对27条UrSTRs进行系统发育分析。通过MEGA软件构建系统进化树（图1A），包含拟南芥AtSTR1~AtSTR14、钩藤UrSTR1~UrSTR27及喜树、长春花等MIAs合成物种的STR基因。结果显示：UrSTR家族分为8个亚家族，G1-a和G3-c亚家族UrSTR成员间亲缘关系紧密，暗示它们在功能上可能存在相似性或冗余性。在类群G2、G3-a、G3-b、G3-d中都有AtSTR分布。钩藤UrSTRs有11个成员（UrSTR1、UrSTR5、UrSTR8、UrSTR11、UrSTR17、UrSTR20、UrSTR21、UrSTR22、UrSTR23、UrSTR24、UrSTR25）分布在类群G1-a中，1个成员（UrSTR7）位于类群G1-b中，2个成员（UrSTR10、UrSTR14）分布在类群G1-c中，2个成员（UrSTR6、UrSTR19）分布在类群G3-a中，1个成员（UrSTR4）分布在类群G3-b中， 6个成员（UrSTR2、UrSTR3、UrSTR13、UrSTR15、UrSTR16、UrSTR18）分布在类群G3-c，4个成员（UrSTR9、UrSTR12、UrSTR26、UrSTR27）分布在类群G3-d中。对文献中已报道的9条UrSTRs（UrSTR1~UrSTR9）进一步与合成MIAs的物种中的STR进行亲缘关系分析（图1B）。UrSTR1、UrSTR5已通过转基因发根证明能促进钩藤碱合成，所以，其与能促进喜树碱合成的OjSTR和OpSTR聚为一支，UrSTR8是与UrSTR5序列高度相似的同源基因，一致性达到98.55%。UrSTR7虽未进行超表达功能验证，但VIGS（virus-induced gene silencing）降低表达后RIN含量降低，所以，其与促进长春碱合成的长春花CrSTR聚为一支。剩下的UrSTR2、UrSTR3、UrSTR4、UrSTR6、UrSTR9单独聚为一支。这一支虽不包含功能验证的STR，但相对来讲，与喜树碱合成途径的CaSTR亲缘关系较近。据此推测，这个进化分支中也可能存在参与钩藤碱合成的STR成员，并将后续分析重点放在这一分支。

2.1.3　氨基酸比对

通过多序列比对分析UrSTR1~UrSTR9与功能已知的CrSTR、OjSTR、CaSTR和RmSTR（图2）。比对结果显示，多数生物碱合成相关STR（包括UrSTR1、UrSTR5、UrSTR7、UrSTR8）在RsSTR 309位点均保守存在Glu残基。然而，唯一高大乔木来源的喜树CaSTR在这一位点却不是保守的谷氨酸，而是性质完全不同的含羟基苏氨酸。钩藤中上述UrSTR2、UrSTR3、UrSTR4、UrSTR6、UrSTR9这一分支和CaSTR一样缺失了这个保守位点，代之以性质相近的含羟基丝氨酸。这一发现支持本研究的假设：与CaSTR同源的UrSTR亚家族可能参与钩藤碱生物合成。

2.2　钩藤碱和异钩藤碱HPLC分析体系

为后续检测分析钩藤生物碱成分，采用高效液相色谱法，通过标准品与样品色谱图的对比分析，实现目标化合物的定性与定量检测。钩藤碱和异钩藤碱标准品的保留时间分别为9.3、13.1 min，色谱峰对称性好，分离度达到1.5以上，表明色谱条件设置合理（图3A）。样品色谱图（图3B）与标准品在相同保留时间（偏差小于0.2 min）处出现特征峰，证实样品中存在目标生物碱成分，对照样品色谱图中相应峰面积显著小于处理组（图3C）。基于保留时间比对和标准曲线色谱外标法，准确鉴定了钩藤碱和异钩藤碱，在1~100 mg·L^-1浓度范围内显示良好的线性关系。以生物碱质量浓度为自变量，峰面积为因变量进行线性回归分析。线性回归方程分别为钩藤碱y=46.718x+2.917（R²=0.999 7）；异钩藤碱y=45.267x-2.710 4（R²=0.999 9）。

2.3　外施水杨酸对MIAs合成和 UrSTR 表达量的影响

SA处理2 d，处理组（0.2、0.4 mmol·L^-1 SA）与对照组的RIN和IRN含量无显著差异（图4A），而0.6 mmol·L^-1 SA处理组RIN和IRN含量显著高于对照组，说明短期内0.6 mmol·L^-1 SA是促进RIN和IRN积累的响应剂量；SA处理4、6 d，0.6 mmol·L^-1 SA处理对RIN和IRN积累相较于0.4 mmol·L^-1 SA处理具有更大的促进作用，所以，0.6 mmol·L^-1 SA是促进RIN和IRN合成的适宜浓度。

为探究SA对RIN合成途径中关键酶基因的影响，采用0.6 mmol·L^-1 SA处理钩藤植株后，利用qRT-PCR检测UrSTR1~UrSTR9基因表达。其中，UrSTR4表达量上调最为显著，其次是UrSTR3，UrSTR3和UrSTR4表达量在处理后4 h开始显著上调，8 h达到峰值，分别为对照组的30.7倍和15.3倍，24 h后恢复至基础水平（图4B）。以上结果暗示：UrSTR4可能响应SA促进RIN和IRN合成。

对UrSTR基因在各组织表达情况进行探究，结果表明：UrSTR4表达量在茎和叶中最高，其次为根中，花和钩中的表达量相对较低，除UrSTR1、UrSTR2外其余UrSTR基因基本符合这个趋势（图4C）。

2.4　 UrSTR4 瞬时转化超表达提高RIN和IRN含量

为研究SA对钩藤碱合成的影响及其与UrSTR4表达相关性，克隆了UrSTR4（GeneBank：PV693401）并构建过表达载体，分析其在RIN和IRN合成中的功能。由于钩藤缺乏稳定遗传转化体系，本研究建立了瞬时转化体系以快速验证基因功能。以GFP为报告基因评估转化效率。结果显示，农杆菌渗透叶片30 s至3 min后，荧光信号在第2天达峰，第4天消失（图5A）。所有荧光信号几乎都出现在叶脉处。在30 s转化时间下（图5A），仅有微弱绿色荧光信号，这可能是由于农杆菌进入植物组织的量有限，导致转化效率较低。1 min处理组信号最强（图5Ab）。2 min和3 min处理组初期信号较强，但后期因农杆菌污染导致组织病变，信号减弱（图5Ac、5Ad）。1 min处理组信号稳定且污染最小，为后续基因功能研究提供了可靠体系。

为验证UrSTR4的功能，采用植物活体转化系统法，在钩藤叶片中进行UrSTR4的瞬时过表达。钩藤UrSTR4表达量是对照的2.58倍（图5B）。与此同时，RIN和IRN的含量分别提高至对照的1.96倍和1.82倍（图5C）。

3 讨论

钩藤是一种重要的传统中药材，具有显著的商业价值。欧洲药典规定的活性成分钩藤碱（RIN）和异钩藤碱（IRN）属于单萜吲哚生物碱（MIAs），该类别还包括长春碱、长春新碱和喜树碱等抗癌药物。大多数MIAs的生物合成以异胡豆苷为前体（喜树例外，使用异胡豆苷酸）。尽管RIN的异胡豆苷上游合成途径已明确，但下游机制仍不清楚，这制约了其工业化生产。关于RIN合成途径基因的研究相对滞后，直至2022年才开始陆续报道上游途径基因。STR催化异胡豆苷的合成，是整个MIAs合成途径中最重要的关键酶，所以STR基因作为研究钩藤MIAs合成的突破口，研究较多。萝芙木、长春花、短小蛇根草和日本蛇根草等MIAs资源植物中均只发现1条功能性的STR，但在钩藤中已零星报道的就有9条UrSTRs。类似地，钩藤的PIF基因家族也显著扩张，其转录组中鉴定到28个UrPIFs基因，远超拟南芥等物种^［24］。基因组测序揭示钩藤含有41个UrSTRs基因拷贝，多数呈串联重复分布，表明其扩张可能源于染色体重复事件。本研究综合分析了实验室前期获得的遮阴处理、乙烯处理的钩藤转录组和全长转录组数据，共鉴定到27条UrSTRs基因家族成员，大多数与其他物种中的STR一致，均具备典型的STR保守结构域，且亲缘关系也较为接近。

大量扩增的UrSTR基因家族可为代谢途径提供灵活性，可能存在功能冗余或与环境和胁迫应答有关，从而使植物能够根据需要调节次生代谢产物的种类和数量。之前已发现RIN的合成和积累对外界环境因素比较敏感，多种环境因子和激素（或胁迫信号分子）如低光照^［25］、干旱^［26］、茉莉酸甲酯^［18］和ABA^［19］都能激活RIN生物合成途径，诱导途径关键酶基因表达，导致RIN和IRN积累。如ABA诱导UrSTR4、UrSTR6、UrSTR8、UrSTR9的表达上调^［19］，MeJA轻微上调UrSTR8表达水平^［18］，UrSTR7受到乙烯和遮阴处理的强烈诱导^［25］。SA是广为熟知的胁迫相关的信号分子，经常被用作刺激子激活次生代谢合成。本研究发现，0.6 mmol·L^-1 SA处理可显著提高钩藤RIN和IRN的含量，并强烈诱导UrSTR4表达，基因表达量上调约30倍，这暗示SA可能通过调控UrSTR4的表达，促进钩藤生物碱的积累。

UrSTR4在亲缘关系上和钩藤近缘物种中已验证活性的STR并不亲近，如短小蛇根草、日本蛇根草和美丽帽柱木STR，甚至没有和已知活性的STR聚在相同的进化分支，而是归属于另一个分支。氨基酸序列比对还发现，UrSTR4在相对于罗芙木Glu-309的位置并不具备保守的Glu功能位点，反而和喜树CaSTR3具有相似的氨基酸残基。Yang等^［27］已证实CaSTR3具有STR活性，能够催化裂环马钱子苷与色胺缩合生成异胡豆苷。鉴于异胡豆苷是萜类生物碱合成途径的关键中间体，推测即使缺乏Glu-309位点，相关STR基因仍可能参与生物碱的生物合成过程。基于这一发现，推测UrSTR4可能同样具有促进RIN合成的功能。

基因功能研究通常采用瞬时表达和稳定遗传转化2种策略。瞬时遗传转化具有操作简单、周期短、转化效率高等优势，在基因功能研究中备受青睐。同时，钩藤的稳定遗传转化体系尚未建立，因此，本研究成功构建了以植物活体转化仪为媒介的钩藤瞬时超表达体系，用于快速鉴定UrSTR4功能。过表达UrSTR4使RIN和IRN含量分别提高至对照的1.96倍和1.82倍，表明其参与生物碱合成，且SA可能通过调控关键酶基因表达促进RIN积累。SA诱导的RIN和IRN增幅较小，这与幼苗期本底生物碱含量较高有关^［18］。钩藤RIN含量与苗龄呈负相关，6月龄的钩藤苗本底生物碱含量已经较高，所以受诱导后提高幅度有限。

由于钩藤的重要药用价值和日渐增长的市场需求，其活性成分钩藤碱的生物合成获得了越来越多研究者的关注。为阐明合成途径及鉴定关键酶基因STR，多个研究团队基于各自建立的转录组数据鉴定了STR基因，导致命名系统存在重复和混乱。本研究系统整理了已报道STR基因序列，并对其功能特征进行了分类归纳。UrSTR1~ UrSTR6的命名遵循了Jiang等^［14］的报道。其中，UrSTR1的功能鉴定最充分，其原核表达产物能催化异胡豆苷的生成，在钩藤发根中超表达使4种MIAs含量提高至对照的2.6~3.0倍。UrSTR5对钩藤碱合成的作用最大，钩藤发根中超表达使4种MIAs含量提高至对照的5.5~7.0倍^［14］。UrSTR6和穆德添等^［17］报道中的UrSTR、Mu等^［28］报道中的UrSTR，以及周浩等^［19］报道中的UrSTR2为同一条（NCBI基因登录号为OP669354），该基因组织表达谱和对应组织的MIA含量谱具有非常高的相似性，在MIA含量高的花和钩、茎中高表达，在MIA含量低的根中低表达，而且受MeJA、乙烯和低温的诱导，但是该基因未进行酶活和转基因功能验证。本研究发现，UrSTR4表达受SA强烈诱导；其瞬时超表达可显著提升RIN和IRN含量。综合以上研究，目前已明确鉴定到UrSTR1、UrSTR4和UrSTR5这3条UrSTR基因是钩藤碱生物合成的关键酶基因。

另外，还有2条UrSTR基因也极有可能参与钩藤碱的合成，需要后续进行转基因功能验证。一条是UrSTR8（NCBI基因登录号为OL310251），编码的蛋白序列与UrSTR5一致性极高，达到98.55%，而且和已功能验证的UrSTR1/5、OjSTR和OpSTR聚在相同的进化分支。该基因在茎中表达量最高，根中最低，与钩藤碱含量分布情况类似，叶中的表达水平随着叶片的成熟逐渐降低，并且受到ABA和MeJA轻微但显著的上调^［18-19］。经鉴定，另一条UrSTR家族成员UrSTR7（NCBI登录号：ON125563）编码蛋白具有异胡豆苷合成酶活性^［29］。该基因在遮光条件下表达量显著上调，分别达到对照的12.2倍和9.8倍^［24-25］。进一步研究表明，UrSTR7的表达受到钩藤碱生物合成正调控转录因子UrPIF3的间接激活^［4］。由于有多条STR基因涉及钩藤碱的合成，后续还需研究这些UrSTRs基因是否存在功能冗余或是否响应不同的环境或处理条件，如能够诱导钩藤碱合成的干旱^［26］、低光强^［25］、中等海拔^［30］和SA浓度等。

综上所述，本研究通过瞬时超表达鉴定了UrSTR4是钩藤碱生物合成途径的关键酶基因，其表达量的提高能增强钩藤碱的合成，外源SA处理通过上调UrSTR4基因表达，促进钩藤碱的合成与积累。钩藤瞬时超表达体系为后续筛选和验证更多参与RIN合成的关键基因提供了可靠的技术手段，为解析钩藤生物碱合成的分子机制奠定了基础。

4 结论

本研究系统鉴定了钩藤中27个异胡豆苷合成酶（STR）基因家族成员（UrSTRs），其显著扩张暗示该家族可能通过功能分化参与环境适应性调控。研究发现，UrSTR4作为调控钩藤碱（RIN）和异钩藤碱（IRN）生物合成的关键酶基因，在0.6 mmol·L^-1水杨酸（SA）诱导下表达量显著上调30.6倍，且与RIN和IRN的积累呈正相关。通过建立优化的钩藤瞬时转化体系（8 kPa气压，1 min农杆菌侵染），证实UrSTR4过表达可使RIN和IRN含量分别提高至对照的1.96倍和1.82倍。值得注意的是，UrSTR4虽缺乏典型Glu-309催化位点，但其保守的羟基氨基酸残基特征与喜树CaSTR3相似，提示存在非经典催化机制。本研究阐明UrSTR4作为SA响应型RIN/IRN生物合成的关键调控因子，同时，建立的瞬时转化技术为钩藤功能基因组学研究提供了有效工具，为单萜吲哚生物碱的代谢工程及药用成分的遗传改良提供理论依据和技术支撑。

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基金资助

贵州省基础研究（自然科学）项目（黔科合基础-ZK［2022］一般096,黔科合基础MS［2025］667,黔科合基础-ZK［2024］一般502）

国家自然科学基金项目(32460146)