低能量激光对高糖介导的巨噬细胞炎性衰老的作用研究

Low-level laser therapy for hyperglycemia-associated inflammatory senescence in macrophages

摘要

目的 高糖相关的巨噬细胞炎性衰老是诱导其功能障碍及牙周损伤的关键因素，本研究旨在探讨低能量激光治疗（LLLT）对该过程的调理作用。 方法 用不同能量密度的激光处理高糖转低糖环境培养的小鼠骨髓巨噬细胞（iBMDM），评估其吞噬、迁移功能及炎性衰老水平；构建糖尿病小鼠模型，比较单纯胰岛素治疗、单纯LLLT与胰岛素联合LLLT对牙周组织形态及炎性衰老表型的影响。 结果 LLLT增强iBMDM迁移及吞噬能力，并降低炎性衰老标志物的表达；体内实验中，LLLT联合胰岛素治疗改善糖尿病诱导的牙龈黏膜上皮增厚、层次紊乱、上皮钉突缩短及牙槽骨吸收，并减轻局部炎性衰老负荷。 结论 LLLT有效逆转高糖相关的巨噬细胞炎性衰老及其所致的牙周组织损伤，有望成为维护糖尿病患者口腔健康的有效辅助治疗方法。

Abstract

Objective　Hyperglycemia-associated inflammatory senescence in macrophages is a key factor in inducing macrophage dysfunction and periodontal tissue damage. This study aims to explore the regulatory effects of low-level laser therapy (LLLT) on this process. Methods　Bone marrow-derived macrophages (iBMDMs) cultured in a glucose-shift medium were subjected to laser treatments for evaluation in terms of phagocytosis, migration, and inflammatory senescence levels. Meanwhile, a diabetic mouse model was constructed to compare the effects of insulin monotherapy, LLLT monotherapy, and insulin-combined LLLT on the morphology and inflammatory senescence phenotype of periodontal tissues. Results　LLLT enhanced cell migration and phagocytosis in iBMDMs, as well as reduced the expression of inflammatory senescence markers. In the in vivo experiments, LLLT combined with insulin treatment alleviated diabetes-induced gingival mucosal epithelial thickening, disordered stratification, shortened epithelial rete pegs, and alveolar bone resorption. Meanwhile, it reduced the inflammatory senescence burden. Conclusion　LLLT effectively reverses hyperglycemia-associated sustained damage to macrophages and periodontal tissues. Thus, it shows strong potential as an effective adjuvant therapy for maintaining oral health in diabetic patients.

Graphical abstract

关键词

低能量激光 / 巨噬细胞 / 糖尿病 / 炎性衰老

Key words

low-level laser therapy / macrophage / diabetes / inflammatory senescence

糖尿病是代谢相关的慢性炎性疾病，也是一种由衰老细胞和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）影响的继发性衰老状态。衰老细胞在组织中累积，通过分泌SASP，即促炎细胞因子及蛋白酶发挥致病作用，机体在衰老进程中接收来自受损基因组和衰老细胞的炎症信号而呈现低度、无菌、持续的炎症状态，称为炎性衰老^[1-2]。炎性衰老是糖尿病相关牙周损伤的关键机制，高血糖状态下，牙周组织慢性炎症加剧，免疫细胞呈现早期衰老表型，分泌SASP，进一步加剧炎性衰老，诱导牙龈免疫稳态失衡及牙周组织破坏，导致糖尿病患者罹患牙周病的风险显著增加^[3-5]。

低能量激光治疗（low-level laser therapy，LL-LT）指波长范围为380~1 070 nm，输出功率低于0.5 W的红外/近红外光^[6]。LLLT能够有效穿透至深层组织，刺激光受体，发挥消炎、镇痛及促进愈合的生物调节作用。近年来，LLLT在正畸牙移动^[7]、软组织成型^[8-9]、种植体周围炎^[10-11]、拔牙创愈合^[12-13]、牙周非手术治疗^[14]、根管消毒^[15]、口腔黏膜病^[16-17]和三叉神经痛^[18]等口腔疾病诊疗中展现出潜力。糖尿病患者易患反复发作、迁延不愈的顽固性牙周炎，且传统治疗术后感染风险较高，而LLLT能够减少细菌负荷并改善牙周及血糖指标^[19]。课题组前期通过建立糖尿病牙周炎小鼠模型，发现LLLT可能经葡萄糖转运蛋白1（gluco-setransporter1，GLUT1）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路抑制牙周组织早期衰老，延缓牙周炎进展^[20]。另有研究^[21]表明，糖尿病小鼠牙周组织中衰老巨噬细胞浸润增加，高糖刺激后的巨噬细胞表现出衰老表型和功能障碍，提示巨噬细胞是高血糖诱导牙周组织炎性衰老和免疫失衡的关键效应细胞。然而，目前尚缺乏LLLT对单纯高糖状态下巨噬细胞功能、炎性衰老水平及牙周组织增益的探讨。

因此，本研究的目标是探究LLLT对单纯高糖因素引起的巨噬细胞功能失调、促炎促衰老表型，以及牙龈组织异常改变的影响，旨在为糖尿病患者口腔健康维护的激光辅助治疗提供新的理论依据。

1　 材料和方法

1.1　 主要试剂与设备

胎牛血清（Gibco公司，美国）、杜式改良的 Eagle 培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；Gibco公司，美国）；活/死细胞染色试剂盒（APExBIO公司，美国）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8；Abmole公司，美国）；β-半乳糖苷酶衰老细胞染色（sencscence β- galactosidas staining kit，SA-β-GAL；碧云天公司，中国）；红色荧光微球（Sigma-Aldrich公司，美国）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ；Sigma-Aldrich公司，美国）；4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA，塞维尔公司，中国）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS；塞维尔公司，中国）；含吐温的Tris缓冲盐溶液（tris-buf-fered saline with tween，TBST；塞维尔公司，中国），细胞核染色液（diamidino-2-phenylindole，DAPI；塞维尔公司，中国）；脱钙液（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA；塞维尔公司，中国）；苏木精染色液（塞维尔公司，中国）；分化液（塞维尔公司，中国）；结晶紫染色液（碧云天公司，中国）；免疫染色封闭液（碧云天公司，中国）；50X抗原修复液（碧云天公司，中国）；显影液（enhanced chemiluminescence，ECL；碧云天公司，中国）；白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β；华安公司，中国）抗体；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A抗体（CDKN2A，p16；CST公司，美国）；周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1A抗体（CDKN1A，p21；Proteintech公司，美国）。

小鼠骨髓巨噬细胞（immortalized mouse bone marrow-derived macrophages，iBMDM，富衡生物公司，中国）；L-929小鼠成纤维细胞（L-929 mou-se fibroblastic cell，L-929）和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（mouse mononuclear macrophages cell，RAW264.7）由四川大学口腔疾病全国重点实验室提供；C57BL/6J野生型小鼠（雄性，6周龄）购自南京大学模式动物研究中心。

半导体激光，波长980 nm，光纤输送，光纤直径400 μm（博激世纪公司，中国）；μCT 50系统（IX73型）、OlyVIA软件、共聚焦显微镜（FV3000型）、倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；蛋白电泳仪、显影仪（Bio-Rad公司，美国）；Image J软件（NIH公司，美国）

1.2　 激光对糖尿病小鼠牙周组织的影响

1.2.1　 糖尿病小鼠模型建立及激光处理

所有小鼠按照。将30只小鼠随机分为5组，每组6只：对照组、糖尿病组、糖尿病+胰岛素组、糖尿病+ LLLT组、糖尿病+胰岛素+LLLT组。经适应性喂养，腹腔注射链脲佐菌素（STZ；120 mg/kg，溶解于pH=4.5柠檬酸磷酸盐缓冲液）诱导糖尿病小鼠模型。对照组小鼠注射等量的生理盐水。每周监测小鼠随机血糖，随机血糖大于16.7 mmol/L纳入为糖尿病。待糖尿病病程稳定4周，对糖尿病+胰岛素组、糖尿病+胰岛素+LLLT组小鼠进行控糖治疗，即腹腔注射胰岛素（每天20~30 U/kg，持续4周）。糖尿病+LLLT组和糖尿病+胰岛素+ LLLT组小鼠接受牙龈局部半导体激光照射。在临床实践中，牙周辅助LLLT的能量密度通常为1~10 J/cm²，频率为每周1~2次，疗程依据病情而定，一般为4~6周^[22-23]。因此，本研究体内激光参数为：波长980 nm，功率0.1 W，时间10 s，光斑面积0.33 cm²，能量密度3 J/cm²，治疗频率每周2次，持续4周。

1.2.2　 牙槽骨显微CT扫描（Micro-CT）

各组小鼠处死收样，将下颌骨组织放入样本管，上样于μCT 50系统，以8 μm精度逐层扫描。利用SCANO Visualizer软件进行三维重建，SCANO Evaluation软件（V6.5-3）分析第二磨牙与第三磨牙牙槽间隔的骨体积分数（bone/volume fration，BV/TV）。

1.2.3　 牙龈组织苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）

小鼠上颌骨用4% PFA固定24 h，浸泡于EDTA溶液中进行脱钙，并以3 d 1次的频率更新脱钙液。经脱水、透化、浸蜡及包埋等制作石蜡切片。65 °C烘箱烤片后脱蜡至水，依次浸泡于苏木精染液、分化液、伊红染色中进行细胞核及细胞质染色，脱水、透明、封片后于扫片机观察。OlyVIA软件进行测量。

1.2.4　 小鼠牙龈组织免疫染色

将小鼠上颌骨石蜡切片浸泡于二甲苯及梯度乙醇中脱蜡水化，沸水中进行抗原修复15 min，经破膜、封闭后，滴加一抗4 °C孵育过夜。PBS润洗，DAPI及荧光二抗混合，避光孵育1 h，PBS洗涤后封片，于共聚焦显微镜下观察、采图。

1.3　 正常糖状态下不同能量激光对细胞功能的影响

1.3.1　 细胞培养及激光处理

L-929细胞和iBMDM细胞均在含10%胎牛血清和25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂的环境下培养。将细胞接种于六孔板，贴壁后行激光处理（980 nm）。具体地，使激光探头垂直于孔板底部，以不同的输出功率和相同照射时间，将细胞分为3、6、18和30 J/cm²通量的4个实验组，对应的输出功率为0.1、0.2、0.6和1 W。根据能量密度公式及孔板底面积：能量密度（J/cm²）=功率（W）*时间（s）/光斑面积（cm²），计算得出各组照射时间为132 s。

1.3.2　 活/死细胞染色及细胞增殖能力检测

使用活/死染色试剂盒表征激光在正常状态下对细胞活力的影响。具体地，将iBMDM细胞接种于六孔板，待细胞贴壁，实验组细胞辅以激光照射。24 h后，收集细胞，PBS洗涤并重悬，将200 μL细胞悬液（1×10⁵个/mL）与100 μL染色液混和，并在37 °C下避光孵育15 min。使用荧光显微镜，在490 nm 激发波长下检测荧光，同时监测活细胞（Calcein-AM）和死细胞（PI）。

使用CCK-8试剂盒检测正常状态下激光对细胞增殖能力的影响。将iBMDM细胞接种于96孔板（5 000个/100 μL/孔），于孵箱培养24 h后，各实验组辅以激光照射，继续培养24 h及48 h。弃去原培养基，加入100 μL预先制备的CCK-8工作液（含10 μL CCK-8原液和90 μL DMEM培养基），避光孵育2 h，多功能酶标仪检测450 nm光密度（optical density，OD）值，通过实验孔与对照孔的吸光度比值，计算相对细胞活力。每组设置5个复孔。

1.3.3　 Transwell迁移实验及划痕实验

Transwell迁移实验检测iBMDM细胞的迁移能力。iBMDM接种于孔板中并于贴壁后接受激光处理，收集细胞并重悬于无血清DMEM培养基，将等量细胞接种至Transwell孔板上室，并于下室补充含20%血清的DMEM培养基，培养12 h。4% PFA固定10 min后，置于0.1%结晶紫溶液染色30 min。PBS润洗并用棉签擦去上室内表面未迁移的细胞。于显微镜观察上室外表面已迁移的细胞。

划痕实验检测L-929细胞迁移能力。先用马克笔在六孔板底部绘制参考线，再将L-929细胞以5×10⁵个/孔的密度接种，待细胞生长密度达80%以上，用200 μL枪尖垂直参考线划痕，PBS洗涤脱落的细胞，并进行激光照射，分别于0、14、24及48 h后观察并于固定的观察点采图。Image J软件分析划痕面积，计算迁移率。

根据不同能量激光对细胞功能的影响，筛选合适的激光能量用于后续实验。

1.4　 高糖状态下激光对巨噬细胞功能及炎性衰老水平的影响

1.4.1　 细胞培养及激光处理

将iBMDM细胞分为6组：对照组、高糖组、高糖转低糖组、高糖转低糖+激光组（3、6、18 J/cm²）。对照组和高糖组细胞分别使用含25 mmol/L及45 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基，连续培养6 d。高糖转低糖组，先用含45 mmol/L葡萄糖的培养基培养3 d，后转为含25 mmol/L葡萄糖的培养基继续培养3 d。高糖转低糖+激光组即在高糖转低糖后辅以不同能量激光照射，于4、6 d各照射1次。各组细胞每2 d换液1次。

1.4.2　 Transwell 迁移实验

实验步骤同1.3.3。

1.4.3　 荧光微球吞噬实验

将红色荧光微球用1%牛血清蛋白以1∶100稀释，37 °C下孵育30 min，超声5 min，获得微球工作液。各组细胞接种于含细胞爬片的六孔板内，高糖及激光处理后每孔加入200 μL工作液，避光孵育1.5 h。随后，PBS洗涤细胞，4% PFA固定10 min，破膜液通透15 min，免疫染色封闭液封闭30 min，DAPI染色液染细胞核5 min，绿色荧光标记的抗α-Tubulin染料染细胞骨架30 min。使用共聚焦显微镜观察并采图。

1.4.4　 SA-β-GAL衰老细胞染色

依据试剂盒说明书建议，选择RAW264.7细胞进行染色。高糖及激光处理后，弃旧培养液并用PBS洗涤，于1 mL SA-β-GAL固定液中室温下固定15 min。PBS洗涤，于1 mL染色工作液中37 °C下孵育过夜。显微镜观察并采集图像，用Image J软件进行细胞计数。

1.4.5　 蛋白免疫印迹（western-blot，WB）检测炎性衰老因子表达

提取细胞总蛋白。弃去孔板内旧培养基，PBS润洗，加入总蛋白提取液［RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液+1%蛋白酶抑制剂+1%磷酸酶抑制剂］冰上裂解10 min。4 ℃超声、离心后取上清，加入5X SDS上样缓冲液于100 °C金属浴10 min。蛋白上样，200 V电泳30 min，400 mA转膜30 min。封闭30 min后加入一抗4 °C孵育过夜。TBST洗涤3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL显影液孵育1 min后曝光。

1.5　 统计学分析

采用Graphpad Prism 9.0软件进行数据分析和作图。所有数据行方差分析及正态性检验，必要时进行校正。组间差异采用t检验，P值小于0.05被认为具有统计学意义。多组比较则通过单因素方差分析（one-way ANOVA）。利用G*Power 3.1软件进行样本量计算及功效分析。

2　 结果

2.1　 LLLT改善糖尿病小鼠牙周组织异常形态

下颌骨三维重建（图1）可见，糖尿病组牙槽骨釉牙骨质界至牙槽嵴顶间距增加，根分叉处骨质吸收明显。X线片可见第二、三磨牙接触点到牙槽间隔的距离增加，骨密度降低，骨小梁紊乱。胰岛素治疗组见骨组织形态缺陷得到一定程度改善，而辅助激光治疗组见牙槽骨吸收显著改善，骨密度增加。BV/TV分析显示：与糖尿病组相比，胰岛素治疗增加BV/TV指数（差异有统计学意义，P<0.05），单纯LLLT组及胰岛素联合LLLT组增益效果差异有统计学意义（P<0.001），但单纯胰岛素注射与辅助LLLT组间差异无统计学意义（P>0.05）。

组织染色（图2）显示：糖尿病组黏膜上皮增厚（差异有统计学意义，P<0.001）、细胞数量增加，且上皮钉突消失。与对照组相比，胰岛素治疗后上皮黏膜仍较厚（差异有统计学意义，P<0.05），且上皮钉突形态无明显改善，单纯LLLT组牙龈黏膜上皮形态趋于正常，但与单纯胰岛素组差异无统计学意义（P>0.05），胰岛素联合LL-LT后，上皮钉突延长，牙龈上皮厚度显著变薄（差异有统计学意义，P<0.05）。结果表明，糖尿病对牙周软硬组织形态结构的不利影响在血糖恢复正常后难以逆转，辅助LLLT能够一定程度缓解高糖诱发的持久不利影响，有效改善牙龈上皮物理屏障异常改变。

2.2　 LLLT减轻糖尿病诱导的小鼠牙周组织炎性衰老负荷

组织免疫染色结果（图3）所示：糖尿病组小鼠牙周组织高水平表达炎性衰老标志物p21和IL-1β，证明糖尿病诱导牙周组织炎症、衰老表型，与课题组前期研究结论一致，但胰岛素治疗后，牙龈组织中p21、IL-1β阳性细胞仍高水平浸润，提示前期高糖环境引发的长期促炎促衰老效应在控糖后仍难以逆转。单纯LLLT组有效减少p21因子表达丰度，但IL-1β因子仍高水平表达。胰岛素联合LLLT治疗后，糖尿病小鼠牙龈组织中炎症衰老相关因子的表达显著减轻。

2.3　 LLLT对细胞增殖活性及迁移能力无显著抑制

为明确激光治疗的能量安全窗口，本研究采用阶梯式能量设计（3、6、18、30 J/cm²），系统评估不同能量密度在正常状态下对细胞行为的影响。活/死细胞染色结果（图4A）可见，与对照组相比，6 J/cm²和18 J/cm²组活细胞数目（绿色荧光）无显著差异，而30 J/cm²组死细胞（红色荧光）数目增加。CCK-8结果（图4B）进一步表明，低能量组（3、6 J/cm²）24~48 h均未影响增殖活性（P>0.05），而30 J/cm²组在48 h出现显著细胞毒性（差异有统计学意义，P<0.05），提示其光毒性阈值。细胞功能分析揭示激光的能量依赖性双相效应：高能量组（18、30 J/cm²）显著抑制L-929细胞划痕愈合和iBMDM迁移，而低能量组（3、6 J/cm²）在维持L-929正常修复能力（P>0.05）的同时，特异性增强iBMDM迁移活性（P<0.05）（图5）。综合上述结果，本研究界定≤18 J/cm²为安全治疗边界，30 J/cm²为光毒性临界值，最终选择3、6、18 J/cm²用于后续实验。

2.4　 低能量激光促进高糖环境下巨噬细胞吞噬、迁移能力

Transwell迁移实验（图6）显示：与对照组相比，高糖环境未显著抑制巨噬细胞迁移能力（差异无统计学意义，P>0.05），而3 J/cm²和6 J/cm²激光干预显著促进了细胞迁移率（差异有统计学意义，P<0.05）。

荧光微球吞噬实验（图7）显示：高糖环境下巨噬细胞吞噬荧光微球数目减少，且该损伤在移除刺激后仍持续存在，而辅助3、6 J/cm²能量密度的激光显著逆转巨噬细胞吞噬功能障碍。

2.5　 低能量激光缓解高糖诱导的巨噬细胞长期炎性衰老状态

SA-β-GaL衰老细胞染色结果（图8）显示：高糖刺激后阳性细胞数目增加，去除高糖刺激后，阳性率无显著降低（P>0.05），辅助3、6和18 J/cm²激光照射后，衰老细胞数目明显减少（P<0.05），与对照组水平相当（P>0.05）。

WB结果（图9）显示：炎性衰老标志物p16、p21和IL-1β在高糖及高糖转低糖组表达丰度均呈增加趋势，与高糖组相比，6 J/cm²激光组降低p21因子表达（P<0.05），3 J/cm²激光组降低p16及IL-1β因子表达（P<0.05）；与高糖转低糖组相比，18 J/cm²激光组下调p21因子表达（P<0.05），3、6和18 J/cm²显著下调IL-1β因子表达（P<0.001）。进一步验证，LLLT能够改善高糖介导的巨噬细胞炎性衰老表型。

3　 讨论

本研究聚焦高糖相关的巨噬细胞炎性衰老及牙周损伤，利用高糖处理的iBMDM细胞模型及STZ诱发的糖尿病小鼠模型，探讨了LLLT在高糖环境下的生物调节效应。研究发现：激光存在能量依赖性双向调控效应，30 J/cm²的激光触发光毒性效应，而3 J/cm²和6 J/cm²的LLLT抑制高糖环境下巨噬细胞炎性衰老表型，并恢复其吞噬与迁移功能。在糖尿病小鼠模型中，辅助LLLT有效改善牙龈上皮物理屏障受损及炎性衰老损伤。提示，LLLT可能通过改善高糖介导的巨噬细胞炎性衰老及功能失调，从而缓解糖尿病相关的牙周损伤。

糖尿病已成为全球性健康问题，严重威胁人类健康并加剧社会经济负担。其中，牙周损伤是糖尿病公认的并发症。牙龈上皮作为抵御病原体入侵、维持牙周稳态的首道防线^[24-25]，在糖尿病状态下，牙龈上皮屏障功能的破坏扰乱牙周稳态，引起牙周致病菌侵袭增加，激活免疫细胞大量释放炎症介质及基质代谢酶，导致继发性软硬组织破坏增加^[26]。本研究通过糖尿病小鼠模型证实了已有文献^[27-28]的观点，即高糖环境诱导牙龈组织结构破坏（如牙龈上皮增厚、细胞数量增加、层次紊乱及上皮钉突缩短）和下颌骨骨密度降低，且胰岛素虽能恢复血糖水平，却无法逆转前期高糖环境引发的牙周组织损伤，而单纯LLLT治疗具有重塑局部组织形态的趋势，且胰岛素联合LLLT后，能够改善高糖环境介导的牙龈上皮物理屏障损伤。

LLLT作为一种新兴的光基治疗手段，其核心机制“光生物调节”涉及红外至近红外光区域的能量吸收，该过程已被证实能够促进线粒体ATP生成、促进细胞信号传导及生长因子合成，同时有效减轻氧化应激。多项随机对照研究表明，LLLT疗效与糖尿病患者的血糖控制水平（以糖化血红蛋白HbA1c为指标）相关。在HbA1c水平较高（HbA1c>7%）的患者中，LLLT在短期内（3个月）对HbA1c水平的改善更显著^[29-30]。在HbA1c水平中等（HbA1c>6%）的患者中，LLLT对牙周指标（如探针深度和附着水平）的改善效果更为突出^[31-32]。在HbA1c水平较低（HbA1c<7%）的患者中则疗效有限^[33]，提示需基于代谢状态动态调整治疗参数。然而，LLLT的临床应用仍面临以下挑战^[34]。1）能量密度窗口需精准把控。不同细胞类型在不同组织背景下对不同能量密度激光的反应有所差异。研究者^[35]探讨了红光（650 nm）及近红外光（808 nm）对体外巨噬细胞活性的影响，发现较低能量密度（0.1~3 J/cm²）的激光促进细胞活性，而较高能量密度（18~30 J/cm²）的激光因过度激活细胞内活性氧而抑制细胞活性。2）设备参数标准化不足可能影响疗效重现性。3）在伴发系统性疾病（如癌症）人群中的长期安全性仍需前瞻性研究验证^[36-40]。鉴于此，本研究在体外实验中选择3、6、18和30 J/cm²能量密度的激光，采用每天1次、持续4 d的照射频率，初步探究了其对iBMDM细胞的生物调节作用。研究结果揭示了激光能量对细胞行为的双相效应：高能量（18、30 J/cm²）激光可能通过物理损伤主导抑制作用，而低能量（3、6 J/cm²）激光则通过调控高糖状态下的细胞炎症衰老表型及功能障碍发挥保护作用。这种能量依赖的差异化效应为精准光疗提供了理论依据。

高血糖诱导的持续慢性低度炎症状态，即炎性衰老，是糖尿病相关并发症发生发展的潜在机制。巨噬细胞作为维持牙周稳态的前哨细胞，其功能失调及炎性衰老表型在伴糖尿病牙周炎进展中发挥关键作用。课题组前期研究^[41]证实，高糖环境通过GLUT1途径促进巨噬细胞衰老，进而增加微环境中的SASP水平，诱发牙周组织衰老。通过间歇性高糖模型，研究^[42]发现早期血糖波动经胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）依赖的M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）核转位诱导巨噬细胞吞噬、趋化功能障碍及代谢重编程，加剧牙周组织炎症反应。另有研究^[43]探讨了高糖环境下巨噬细胞胞葬功能的变化，发现高糖下调胞葬作用关键调节因子沉默调节蛋白6（sirtuin 6，SIRT6），损害巨噬细胞识别并清除程序性死亡细胞的功能，引发凋亡中性粒细胞的积聚和持续性炎症应答，加速牙周组织破坏。此外，高血糖状态不仅抑制巨噬细胞的胞葬、趋化及抗原呈递功能^[20]，还会经NLR家族CARD结构域蛋白4（NLR family CARD domain containing 4，NLRC4）磷酸化途径致其焦亡，诱导其向M1促炎表型转变，引发周围成纤维细胞早衰及牙周组织炎性衰老^[14]。因此，本研究聚焦于高糖刺激下巨噬细胞功能障碍和炎性衰老表型，并探讨了LLLT在此过程中的调理作用。结果表明，在高糖刺激下的巨噬细胞吞噬功能失调，并表现出IL-1β、p21表达丰度增加及β-半乳糖苷酶活性增加，提示细胞呈炎性衰老特征，在移除高糖刺激后，相关负面效应仍存在，而辅助LLLT能够有效清除高糖介导的促炎促衰老长期效应。

然而，本研究尚存在以下局限性：仅采用单一参数及固定照射频率，未涵盖常用波段或动态参数调整方案，且基于无菌性糖尿病模型的结论难以模拟牙周组织的复杂微环境。此外，因LLLT通过光生物调节直接作用于局部牙周组织，而胰岛素通过全身血糖控制间接调控组织微环境，后者的疗效存在滞后性，因此，为期4周的短期观察窗口可能掩盖二者的疗效差异。再者，部分指标回顾性功效分析显示统计功效略小于参考值，提示样本量不足限制结果的稳定性，然而严格控制的实验条件与观察到的显著效应提供了有价值的初步证据。未来的研究应深入探究伴糖尿病牙周炎等不同疾病状态下，不同参数激光对牙周免疫稳态的影响及其潜在机制，并通过临床研究验证其长期疗效，以指导临床实践。综上，本研究为糖尿病牙周损伤的血糖控制-LLLT联合干预提供了实验依据，但其临床转化仍需参数优化与机制探索的双重驱动。

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基金资助

国家自然科学基金(82470985)

四川省自然科学基金(2024NSFSC0548)