β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶4在头颈部鳞状细胞癌中的表达规律及功能初探

Preliminary study on the expression pattern and function of β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 4 in head and neck squamous cell carcinoma

摘要

目的 通过生物信息学技术分析筛选转移和非转移型头颈鳞状细胞癌（HNSCC）组织中基因的表达规律，进一步筛选转移相关关键分子。 方法 从癌症基因组图谱数据集中选取了具有明确信息的19例HNSCC转移型和48例HNSCC非转移型患者的相关数据，通过生物信息学技术分析筛选在转移、非转移型HNSCC中上调和下调的差异表达基因，并对其进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书分析和基因本体论分析。其中β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶4（B4GALNT4）因其“调整后的P值”最小从而被选为关键基因，并通过逆转录及定量反转录聚合酶链式反应、蛋白免疫印迹实验对其进行细胞水平验证。 结果 与非转移型HNSCC组织相比，转移型中有76个基因显著下调，99个基因显著上调，其中B4GALNT4基因表达上调最显著。细胞水平检测发现，与转移能力弱的UM-2细胞相比，转移能力强的UM-1细胞中B4GALNT4的mRNA水平和蛋白表达水平均显著增加（P<0.05）；与UM-2细胞相比，UM-1细胞中蛋白O-糖基化的水平也显著增加（P<0.05）。 结论 B4GALNT4在转移型HNSCC组织和细胞中均表达上调，其表达与蛋白质糖基化的水平呈正相关关系，B4GALNT4有望成为一个肿瘤转移防治新靶点。

Abstract

Objective　To screen differentially expressed genes in metastatic and non-metastatic head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) tissues using bioinformatics technology analysis, and to predict potential key genes. Methods　Related data from 19 cases of metastatic HNSCC and 48 cases of non-metastatic HNSCC with clear information were obtained from the Cancer Genome Atlas dataset. The upregulated and downregulated differentially expressed genes in metastatic and non-metastatic HNSCC tissues were screened using bioinformatics technology analysis. Subsequent analysis included cluster analysis, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis, and gene onto-logy analysis. Results indicate that β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase (B4GALNT4) was selected as a key gene due to its smallest “adjusted P value.” This gene was verified at the cellular level using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and Western Blot. Results　Compared with non-metastatic HNSCC tissues, 76 genes were significantly downregulated and 99 genes were significantly upregulated in the metastatic HNSCC tissues. Among which, the B4GALNT4 gene expression was found to be the most significantly upregulated. Cellular-level experiments revealed that, compared to UM-2 cells with weak metastasis capability, the mRNA and protein expression levels of B4GALNT4 in UM-1 cells with strong metastasis capability were significantly higher (P<0.05). In addition, the level of protein O-glycosylation in UM-1 cells was also significantly increased in UM-1 cells compared to UM-2 cells (P<0.05). Conclusion　B4GALNT4 is upregulated in metastatic HNSCC tissues and cells, and its expression is positively correlated with the level of protein glycosylation. Therefore, B4GALNT4 is a potentially new target for the prevention and treatment of tumor metastasis.

Graphical abstract

关键词

头颈部鳞状细胞癌 / 转移 / β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶 4 / 糖基化

Key words

head and neck squamous cell carcinoma / metastasis / β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase / glycosylation

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是一种起源于口腔、鼻咽、口咽、下咽部和喉部黏膜上皮的癌症，是头颈部最常见的恶性肿瘤^[1-3]。HNSCC是全球第六大常见癌症，具有较高的发病率和死亡率，每年约有89万的新发病例和45万的死亡病例，并且发病率预计将会持续升高^[4]。此外，HNSCC患者的5年生存率仅为40%~50%^[1]，其中有50%以上的患者在3年内会发生复发和转移，最常见的是淋巴结转移，亦有远处的肺转移^[5-6]。转移是导致HNSCC患者的长期生存率低的重要原因，因此针对HNSCC转移机制寻找潜在的治疗靶点及生物标志物至关重要。

蛋白质翻译后修饰（post-translational modification，PTM）是蛋白质功能调节的重要方式，在酶的催化作用下，将一些化学基团共价结合到氨基酸的侧链上，从而改变蛋白质的理化性质、构象、结合能力及功能，参与多种生物过程^[7-8]。目前已发现了大量的PTM，包括磷酸化^[9]、乙酰化^[10]、糖基化^[11]、巴豆酰化^[12]和乳酰化^[13]等，其中糖基化与包括癌症在内的人类多种疾病有着密切的联系。糖基化能够影响肿瘤细胞的免疫逃避和转移参与癌症的发生与衍进^[14]。

对于哺乳动物而言，蛋白质糖基化主要分为两类，分别是O-糖基化和N-糖基化，其中O-糖基化最常见，是由N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）转移到丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上引发，形成Tn抗原，该反应可由许多N-乙酰半乳糖胺转移酶（N-acetylgalactosamine transferase，GALNT）所催化^[15]。而GALNT异常的表达会导致癌细胞中蛋白糖基化的异常，进而影响癌症的发展。β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶4（β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 4，B4-GALNT4）是一种GALNT，在多器官癌组织中普遍上调，并通过蛋白糖基化修饰参与基因的翻译后调控^[16]。B4GALNT4还参与GalNAc的形成^[17]，它是一种附着在N-聚糖非还原末端的氨基二糖结构，是与肿瘤密切相关的碳水化合物之一。

1　 材料和方法

1.1　 差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）的数据收集和筛选

从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据下载具有明确临床信息的19例转移型HNSCC患者资料和48例非转移型HNSCC患者资料的RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）数据及其临床信息（表1），所有患者均被明确诊断为转移型HNSCC或非转移型HNSCC。采用R软件的Limma软件包（版本：3.40.2）分析其信使RNA（messenger RNA，mRNA）的差异表达，并对上调和下调的DEG进行聚类分析，并制作火山图和热图。

基于转移及非转移型HNSCC中上调或下调的基因，分析“调整后的P值”以纠正假阳性结果，以“调整后的P值”小于0.05且log2（倍数变化）大于1或小于-1来筛选差异表达的mRNA，其中B4GALNT4因其“调整后的P值”最小从而被选为后续研究的目标分子。

1.2　 DEG功能富集分析

使用R软件包“clusterProfiler”对上调和下调的DEG进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，并绘制可视化的柱状图和气泡图。

1.3　 B4GALNT4在HNSCC中表达水平的分析

1.3.1　 差异表达分析

在48例非转移型HNSCC患者资料中剔除39例复发的HNSCC患者后，选择9例非转移型（记为G1组）、19例转移型（记为G2组）和44例正常患者（记为Normal组）的基因表达信息，使用R软件包统计分析B4GALNT4在3组中的表达差异。

1.3.2　 B4GALNT4在HNSCC细胞中的表达

本研究所用的HNSCC细胞系转移型UM-1细胞和非转移型UM-2细胞均由四川大学华西口腔疾病防治全国重点实验室提供，所有细胞均在含有10%胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司，中国）的Dulbecco’s改良高糖培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（Gibco公司，美国）中培养，孵育条件为37 ℃、5%CO₂。

定量反转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测B4GALNT4 mRNA的表达水平：使用 Total RNA提取试剂盒（简石生物公司，中国）按照制造商的方案提取UM-1和UM-2细胞的总RNA，使用HiScriptⅡ（诺唯赞公司，中国）获取互补DNA（complementary DNA，cDNA），在StepOne Plus Real-Time PCR系统（Applied Biosystems公司，美国）上进行qRT-PCR，相对基因表达值计算为2^-ΔΔCt，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内部对照，本研究所用qRT-PCR引物见表2。

蛋白免疫印迹（western blot，WB）检测B4-GALNT4蛋白的表达水平：收集UM-1和UM-2细胞，并使用含有蛋白酶抑制剂（MCE公司，美国）的放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（碧云天公司，中国）在4 ℃将其裂解15 min，然后在4 ℃以12 000相对离心力（relative centrifugal force，RCF）离心15 min。收集上清并与5×样品上样缓冲液（雅酶生物公司，中国）混合。提取的蛋白质通过10%~15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（so-dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Mil-lipore公司，美国）上，在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h。

孵育一抗（B4GALNT4，1∶1 000，ImmunoWay公司，美国；GAPDH，1∶5 000，武汉三鹰生物公司，中国）后4 ℃过夜。次日，采用Tris盐缓冲液（tris buffered saline tween，TBST）洗涤3次，并用相应的二抗孵育，室温1 h。再用TBST洗涤3次，采用化学发光底物（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒（白鲨生物公司，中国）使蛋白条带可视化并采集图像。

1.4　 B4GALNT4与信号通路相关性的分析

采集G1组和G2组共计28例HNSCC患者B4GALNT4基因表达信息以及KEGG通路的基因列表信息，通过v4.0.3版R软件GSVA包的参数method=‘ssgsea’进行通路评分，最后通过斯皮尔曼相关系数分析B4GALNT4基因表达量与通路评分的相关性，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.5　 HNSCC细胞蛋白糖基化水平与转移能力的相关性分析

另取UM-1和UM-2细胞的蛋白裂解液进行WB实验，检测蛋白糖基化水平，一抗为O糖基化抗体（1∶1 000，景杰生物公司，中国），其余实验步骤同1.3.2。

1.6　 统计学处理

qRT-PCR及WB实验均重复至少3次，结果通过GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析；采用双侧t检验的方法来比较UM-1和UM-2细胞间差异的显著性，以P<0.05记为差异有统计学意义。

2　 结果

2.1　 转移型和非转移型HNSCC中的DEG

通过R软件分析获得了175个DEG，其中在转移型HNSCC中有B4GALNT4、TMSB15A、K-RT7等共99个基因显著上调，有GJB6、SERPIN-B3、KRT3、PI3等共76个基因显著下调（图1A），上调和下调DEG聚类分析结果见图1B。在上调的DEG中筛选“log2（倍数变化）>2”的基因，结果发现共有6个分子：B4GALNT4、TMSB15A、KRT7、PODXL2、RPS4Y1和KRT19，其中B4-GALNT4因其“调整后的P值”最小从而被选为后续研究的目标分子。

2.2　 DEG功能富集分析结果

GO分析结果表明，上调的DEG和下调的DEG分别富集到20条和21条信号通路，其中与肿瘤发生发展有关的有：层粘连蛋白复合物、糖胺聚糖结合和含胶原的细胞外基质等（图2A、B）。KEGG分析结果表明，上调的DEG富集到了11个信号通路，其中WNT信号通路与肿瘤转移有关，而下调的DEG则富集到了9个通路，其中与肿瘤转移相关的有补体和凝血级联信号通路和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路（图2C、D）。

2.3　 B4GALNT4的表达结果

差异表达分析发现，B4GALNT4在转移型组织中的表达显著高于非转移型组织中的表达（图3A）。qRT-PCR结果显示，与UM-2细胞相比，UM-1细胞中B4GALNT4的mRNA表达水平显著升高（图3B）。WB实验结果显示，B4GALNT4在UM-1细胞中的蛋白表达水平明显高于在UM-2细胞中的表达水平（图3C）。以上数据提示，B4-GALNT4的表达与肿瘤转移的能力相关。

2.4　 B4GALNT4与信号通路相关性的分析结果

通路评分结果显示，B4GALNT4与肿瘤转移相关信号通路：细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解、谷胱甘肽代谢、铁死亡呈正相关关系（图4A~C），与糖基化信号通路：糖酵解/糖原异生、黏蛋白型O-聚糖生物合成、甘露糖型O-聚糖生物合成呈正相关（图4D~F）。综上，B4GAL-NT4的表达与肿瘤转移、糖基化均呈正相关关系。

2.5　 HNSCC细胞蛋白糖基化水平与转移能力的相关性

WB实验结果显示，UM-1细胞的蛋白O-糖基化水平明显高于UM-2细胞（图5），综合2.4中的结果推测，B4GALNT4的高表达可能是通过提高蛋白的糖基化水平来影响肿瘤转移能力的。

3　 讨论

HNSCC是人类头颈部最常发生的恶性肿瘤之一，在头颈部癌症病例中占比超过90%，早期就能发生淋巴结转移，肿瘤细胞通过淋巴结向远处转移与HNSCC的预后不良存在密切关系^[18]。越来越多的研究^[19]表明，肿瘤蛋白和肿瘤抑制因子的表达及功能受到多种蛋白质翻译后修饰的调控，肿瘤的代谢和生长与蛋白质翻译后修饰密切相关。对于HNSCC而言，蛋白质糖基化的改变被认为是其中一个重要特征^[20]。此外随着研究的深入，不仅仅是蛋白质，蛋白的糖基化模式和底层糖基化酶的水平在HNSCC中也发生了变化^[20]。蛋白质糖基化是一个非常复杂的多步骤过程，其可参与HNSCC的发生发展^[21-23]，但目前还未见到B4GAL-NT4调控糖基化在HNSCC中的相关报道^[24-26]，本研究发现，B4GALNT4高表达会升高蛋白的糖基化水平，其可能与HNSCC转移能力的增强有关。

本研究通过分析从公共数据库获取的信息，初步筛选出了转移型和非转移型的HNSCC中表达差异的基因，并对这些基因进行了GO富集和KEGG通路分析，结果发现这些DEG富集到了与肿瘤转移相关的糖胺聚糖结合、WNT、VEGF等信号通路，提示在其中可能存在某个关键基因，调控肿瘤的转移。随后综合考虑差异倍数和P值进行筛选，在上调的DEG中发现了一个与糖基化相关的基因——B4GALNT4。B4GALNT4是一种 N-乙酰半乳糖胺转移酶，其可通过糖基化修饰参与基因的翻译后调控，调控肿瘤的发生发展。通过相关性分析还发现，B4GALNT4的表达水平与肿瘤转移、蛋白糖基化水平均呈正相关关系。基于此，推测B4GALNT4在转移HNSCC中的高表达可能会导致蛋白质糖基化水平的升高。因此，随后在转移能力不同的一对HNSCC细胞系中检测了B4GALNT4的mRNA和蛋白表达水平，并比较了两类细胞中蛋白的糖基化水平，结果均符合预期，与非转移型细胞相比，在转移型细胞中蛋白的糖基化水平显著升高。

有研究^[27]表明，B4GALNT4过表达抑制了人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，本研究则发现，B4GALNT4表达水平更高的细胞，其侵袭性更强，且笔者推测B4GALNT4很可能是一个具有器官特异性的基因，在HNSCC中作为潜在的肿瘤促进分子，影响肿瘤的转移能力。

据报道^[15]，GALNT表达时的错误定位和异常表达均会导致肿瘤细胞的糖基化水平异常，进而影响肿瘤的发展。例如，GALNT2表达时重新定位到内质网后，会增强乳腺肿瘤细胞的迁移^[28]，GALNT2过表达则抑制了肝细胞癌细胞的恶性行为^[29]。而B4GALNT4作为一种GALNT，其表达升高可能是导致HNSCC发生转移的一个重要原因，至于B4GALNT4表达时是否发生定位错误，还需更深入地研究。虽然本研究的样本涵盖了不同病理分期和临床特征，但仍有不足之处存在，总体的样本量偏小，后续需要多中心的临床样本数据进行验证。

综上，本研究发现转移型HNSCC中B4GAL-NT4表达升高，并显著增强了蛋白质糖基化水平；此外还在公共数据库分析中发现，B4GALNT4对HNSCC患者的远期生存影响较大，而远期生存跟肿瘤转移密切相关。本研究为O-糖基化在HNSCC发展机制中的作用提供了新的见解，并且提示B4GALNT4有望成为转移型HNSCC新的潜在治疗靶点。

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基金资助

国家自然科学基金(82273320)

国家自然科学基金(82472686)