葫芦素B通过核因子E2相关因子2/溶质载体家族7成员11/谷胱甘肽过氧化物酶4信号通路诱导舌鳞状细胞癌CAL-27细胞铁死亡

Cucurbitacin B induces ferroptosis in CAL-27 cells derived from tongue squamous cell carcinoma through the signaling pathway involving nuclear factor erythroid 2-related factor 2, solute carrier family 7 member 11, and glutathione peroxidase 4

摘要

目的 观察葫芦素B（CuB）是否诱导舌鳞状细胞癌CAL-27细胞铁死亡，并探讨其可能的机制。 方法 采用不同浓度的CuB（0、5、10、15、20、30 µmol/L）处理CAL-27细胞，使用细胞计数试剂盒（CCK）-8法检测细胞增殖活力，并计算半数抑制浓度（IC50）；细胞克隆实验、细胞划痕实验用于检测不同浓度CuB对CAL-27细胞增殖、迁移的影响；采用不同浓度CuB处理CAL-27细胞，分别检测细胞内活性氧（ROS）、Fe²⁺、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量变化；蛋白印迹法（WB）检测核因子E2相关因子2（Nrf2）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白的表达水平。 结果 CCK-8结果显示：5、10、15、20、30 µmol/L的CuB能显著抑制CAL-27细胞增殖活力，IC50为13.93 µmol/L（P<0.001）。平板克隆实验显示：CuB能够抑制CAL-27细胞的克隆形成能力（P<0.01）。划痕实验显示：葫芦素显著缩短CAL-27细胞的迁移距离抑制迁移能力（P<0.01）。ROS、GSH、MDA及Fe²⁺测定结果显示：与对照组相比，不同浓度CuB干预后CAL-27细胞中ROS、Fe²⁺的荧光强度显著增强，且细胞内GSH含量明显下降，MDA含量则明显上升，诱导细胞氧化损伤，而以上变化可被铁死亡抑制剂铁抑素-1（Ferrostatin-1）逆转（P<0.01）。WB结果显示：不同浓度CuB干预后能够显著下调Nrf2、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平（P<0.05），且铁死亡抑制剂Fer-1可逆转Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达（P<0.05）。 结论 CuB可诱导舌鳞状细胞癌CAL-27细胞发生铁死亡，其机制可能与CuB通过调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。

Abstract

Objective This study aims to observe whether Cucurbitacin B (CuB) induces ferroptosis in CAL-27 cells derived from tongue squamous cell carcinoma and explore its possible mechanism. Methods CAL-27 cells were treated with different concentrations of CuB (0, 5, 10, 15, 20, and 30 μmol/L). Cell proliferation activity was detected using the cell counting kit-8 (CCK-8) method, and the median inhibition concentration (IC50) was calculated. Cell clo-ning and wound healing assays were used to detect the effects of different concentrations of CuB on the proliferation and migration of CAL-27 cells. CAL-27 cells were treated with different concentrations of CuB, and the changes in intracellular reactive oxygen species (ROS), Fe²⁺, GSH, and malondialdehyde (MDA) levels were detected. Western blot (WB) was used to detect the expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), glutathione peroxidase 4 (GPX4), and solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11) proteins. Results CCK-8 results showed that CuB at concentrations of 5, 10, 15, 20, and 30 μmol/L significantly inhibited the proliferation activity of CAL-27 cells, with an IC50 of 13.93 μmol/L (P<0.001). The plate cloning assay demonstrated that CuB inhibited the cloning ability of CAL-27 cells (P<0.01). The wound healing assay revealed that CuB significantly shortened the migration distance of CAL-27 cells and inhibited their migration ability (P<0.01). The results of ROS, GSH, MDA, and Fe²⁺ measurements indicated that, compared with the control group, the fluorescence intensity of ROS and Fe²⁺ in CAL-27 cells significantly increased after CuB intervention at different concentrations. Meanwhile, the intracellular GSH content significantly decreased, and the MDA content significantly increased, which induced cellular oxidative damage. These changes could be reversed by the ferroptosis inhibitor Fer-1 (P<0.01). WB results showed that CuB intervention at different concentrations significantly downregulated the expression levels of Nrf2, SLC7A11, and GPX4 proteins (P<0.05). Furthermore, the ferroptosis inhibitor Fer-1 reversed the protein expression of Nrf2, SLC7A11 and GPX4 (P<0.05). Conclusion CuB can induce ferroptosis in CAL-27 cells derived from tongue squamous cell carcinoma, and its mechanism may be related to the ability of CuB to regulate the signaling pathway involving Nrf2, SLC7A11, and GPX4.

Graphical abstract

关键词

葫芦素B / 铁死亡 / 舌鳞状细胞癌 / 核因子E2相关因子2/溶质载体家族7成员11/谷胱甘肽过氧化物酶4信号通路

Key words

cucurbitacin B / ferroptosis / oral squamous cell carcinoma / nuclear factor erythroid 2-related factor 2/solute carrier family 7 member 11/glutathione peroxidase 4 signaling pathway

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其中舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）尤为常见且预后较差，它占全球每年新诊断癌症病例的1.8%^[1]。研究^[2]发现，饮酒、吸烟及咀嚼槟榔是导致TSCC的主要病因，三者具有协同效应，目前TSCC的治疗方法主要仍是手术治疗、放射治疗（外照射放射治疗或近距离放射治疗）和化学治疗（顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛等药物）为主。尽管近几十年来使用了各种治疗方法，但是治疗效果仍不理想，患者容易产生耐药性，其5年总生存率（overall survival，OS）仍约为50%，且易引起淋巴结转移及复发^[3]，故寻找新的药物对治疗TSCC具有重要意义。

铁死亡是由Dixon等^[4]于2012年首次提出的一种新型细胞死亡方式，研究^[5]表明，铁死亡与细胞自噬和细胞凋亡、细胞焦亡等存在明显不同，它是一种铁依赖和活性氧（reactive oxygen species，ROS）依赖的细胞死亡，并且伴随细胞形态变化，包括线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂和线粒体膜浓缩，这些细胞异常是强烈的膜脂过氧化作用导致质膜选择透过性丧失和氧化应激的发生。通过诱导肿瘤细胞发生铁死亡，可以切断肿瘤的血液供应，激发免疫系统的攻击，并提高肿瘤细胞对其他治疗的反应^[6]。研究^[7-9]表明，多种实验试剂（如厄拉斯汀）、已被批准的药物（如索拉非尼、柳氮磺胺吡啶等）以及电离辐射和细胞因子均能诱导铁死亡并抑制肿瘤生长。特别是铁死亡诱导剂在联合放化疗及免疫治疗时，能显著增强抗肿瘤效果^[10]。

葫芦素B（cucurbitacin B，CuB）是从葫芦科植物中分离得到的一种活性单体，具有广泛的生物活性和药理作用。在抗肿瘤研究^[11]中，CuB已被证实能够通过多种信号通路抑制多种肿瘤的增殖。研究表明，CuB能够诱导细胞发生铁死亡。例如，在针对非小细胞肺癌的研究^[12]中，CuB通过靶向信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，促进了癌细胞的铁死亡，从而抑制了肿瘤的生长。在关于肝癌细胞的研究^[13]中，CuB也被发现能够诱导细胞铁死亡，进而抑制肝癌细胞的增殖，CuB诱导铁死亡的具体机制尚未完全阐明，但已有一些研究提供了线索。例如，CuB可能通过降低谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的活性或表达，促进脂质过氧化物的积累，从而诱导细胞铁死亡。GPX4是细胞内唯一能够还原脂质过氧化物的酶，其失活是铁死亡发生的关键步骤之一。此外，CuB还可能通过影响铁代谢、抗氧化体系等其他途径来诱导铁死亡，这些途径的具体作用机制仍需进一步深入研究。本研究拟探讨CuB抑制TSCC细胞CAL-27的增殖与细胞铁死亡的关系和可能的作用机制，以期为未来TSCC的治疗和新药的开发提供理论依据。

1　 材料和方法

1.1　 细胞株

人TSCCCAL-27细胞株，批号：CL-0265，购于中国武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2　 试剂

CuB分子式：C₃₂H₄₆O₈，浓度≥99.50%；Fer-rostatin-1（MCE公司，美国）。杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清（Gbico公司，美国）；青-链霉素、结晶紫（Biosharp公司，中国）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8检测试剂盒（华晓基因科技有限公司，中国）；ROS分析试剂盒（凯基生物技术股份有限公司，中国）；Fe²⁺探针（同仁化学公司，日本）；谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂检测盒、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂定量盒（上海碧云天生物科技有限公司，中国）；抗体核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、GPX4（武汉三鹰公司，中国）。

1.3　 仪器

细胞恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；酶标仪（BioTek公司，美国）；电泳槽、电泳仪（Bio-RAD公司，美国）；自动曝光机（上海天能科技有限公司，中国）；低速高速离心机（Eppendorf公司，德国），生物倒置显微镜（OLYMPUS 公司，日本）。

1.4　 方法

1.4.1　 CAL-27细胞培养

将细胞接种在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合溶液的完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中，待细胞生长至80%~90%时传代，用于后续实验。

1.4.2　 细胞增殖活性检测

取对数期CAL-27细胞进行细胞计数后，以每孔8×10³个细胞的密度接种于96孔板，37 ℃培养箱中继续培养24 h，待细胞过夜贴壁后，将细胞分为空白组、对照组和药物处理组，对照组有细胞、加培养基不加药（0 µmol/L），药物组分别以终浓度为2.5、5、10、15、20、30 µmol/L的CuB处理细胞24 h，向每孔加入CCK-8试剂，将培养板放入培养箱中孵育2 h，使细胞与CCK-8试剂充分反应后使用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度（optical density，OD）值，计算细胞存活率，并用GraphPad软件计算半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值。

1.4.3　 细胞迁移能力检测

取对数生长期的CAL-27细胞以每孔4×10⁵个细胞的密度接种到6孔板中，待细胞完全贴壁后用200 µL移液器针尖进行线性划痕，磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）清洗3遍后拍照，标记好位置。分别加入浓度为0、10、15、20 µmol/L的Cu B溶液进行孵育，持续24 h后再次使用倒置显微镜观察相同位置细胞迁移情况并计算细胞划痕愈合率。

1.4.4　 细胞克隆能力检测

取对数生长期的CAL-27细胞计数后按照每孔1×10³个细胞的密度接种到6孔板中，隔天按照（0、2.5、5、10、15、20、30 µmol/L）的CuB处理CAL-27细胞24 h后更换培养基，后续使用完全培养基培养14 d，其间每隔2~3 d更换1次培养基。当观察到肉眼可见的细胞群落，并且在显微镜下确认每个克隆团达到50~80个细胞时，终止培养。随后，使用PBS缓冲液洗涤3次，再用无水乙醇固定20 min。弃去无水乙醇后，再次用PBS缓冲液洗涤3次，然后用0.1%的结晶紫溶液染色10 min。回收结晶紫后，用低速流动水清洗6孔板，室温下晾干，最后进行拍照并计算不同浓度细胞的克隆形成数量。

1.4.5　 铁死亡相关生化指标检测

收集CAL-27细胞，严格按照相应试剂盒说明书操作，分别测定细胞ROS、Fe²⁺、GSH及MDA水平，并且为进一步验证CuB是否诱导CAL-27细胞发生铁死亡，后续用Fer-1（10 µmol/L）及CuB联合孵育CAL-27细胞，分别测定相关指标。

1.4.6　 蛋白印迹法检测铁死亡相关蛋白表达

取对数生长期的CAL-27细胞以4×10⁵接种6孔板中，待细胞过夜贴壁后，按0、2.5、5、10、15、20、30 µmol/L的CuB处理CAL-27细胞24 h。加入放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，裂解细胞并提取总蛋白。进行电泳将蛋白质分离后进行转膜。再加入5%脱脂奶粉封闭后，分别加入Nrf2、SLC7A-11、GPX4一抗，4 ℃孵育过夜。加入对应二抗孵育2 h后，先后置Tris-盐酸缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）溶液漂洗10 min和显色剂中30 s，将膜置于化学发光法（en-hanced chemiluminescence，ECL）化学成像系统内进行显影，并用ImageJ软件分析各组蛋白条带灰度值，并且为进一步验证CuB是否诱导CAL-27细胞发生铁死亡，后续用Fer-1（10 µmol/L）及CuB联合孵育CAL-27细胞，分别测定铁死亡相关蛋白相对表达量。

1.5　 统计学方法

采用Graph Pad Prism V.10软件进行单因素方差分析或者t检验进行分析，所有数据以至少3次独立实验的平均值±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　 结果

2.1　 CuB降低CAL-27细胞增殖活性

与对照组相比，随着CuB浓度升高，CAL-27细胞活力逐渐降低，并呈现出剂量依赖性，CuB作用于CAL-27细胞24 h的IC50为13.93 µmol/L，故后续实验选择0、10、15、20 µmol/L展开（图1）。

2.2　 CuB抑制CAL-27细胞迁移能力

与对照组相比，加入CuB处理24 h后CAL-27细胞的迁移能力明显减弱（P<0.01），对照组和CuB 10、15、20 µmol/L实验组的迁移率分别为：62.23%±0.43%、57.85%±0.26%、50.26%±0.47%、36.96%±0.51%，并且抑制能力呈现出剂量依赖性（图2）。

2.3　 CuB抑制CAL-27细胞克隆能力

与对照组相比，随着CuB浓度逐渐升高，细胞克隆数明显降低，对照组和CuB 10、15、20 µmol/L的克隆数分别为：（277±4.58）（251.33±5.69）（194.67±6.51）（79.67±4.73）个，且差异具有统计学意义（P<0.001），可见CuB能够显著抑制了CAL-27细胞的增殖能力（图3）。

2.4　 CuB增加细胞内ROS、Fe²⁺、MDA含量并且降低细胞内GSH含量

与对照组比较，CuB（10、15、20 µmol/L）剂量组细胞内ROS、Fe²⁺的荧光强度明显增强（P< 0.01）（图4A~D），表示细胞内ROS、Fe²⁺浓度明显增多，相应的细胞内GSH含量明显降低（图4E），且脂质过氧化产物MDA的积累明显增多（P<0.01）（图4F）。

2.5　 Fer-1联合CuB可逆转细胞内ROS、Fe²⁺、GS-H、MDA含量改变

CAL-27细胞中ROS、Fe²⁺荧光强度与对照组相比显著降低（P<0.05）（图5A~D），细胞内GSH及MDA含量被显著逆转（P<0.001）（图5E、F），由此可见，CuB诱导CAL-27细胞发生了铁死亡。

2.6　 CuB可抑制细胞内铁死亡相关蛋白的表达

与对照组相比，CuB（10、15、20 µmol/L）剂量组细胞中Nrf2、SLC7A11、GPX4含量明显下降（P<0.01）。

结果表明，CuB降低了铁死亡相关蛋白表达，通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路诱导CAL-27细胞铁死亡（图6）。

2.7　 Fer-1联合CuB可逆转细胞内铁死亡相关蛋白的表达

15 µmol/L CuB作用CAL-27细胞24 h后显著抑制了铁死亡相关蛋白Nrf2、SLC7A11、GPX4的表达，加入Fer-1后与对照组相比相关蛋白表达量显著上升（P<0.05）（图7）。

3　 讨论

现代药理研究^[14-17]表明，CuB具有抗肿瘤、保肝、抗炎、提高机体免疫等多种生物活性，其通过多种信号传导途径可抑制非小细胞癌、乳腺癌、结直肠癌以及前列腺癌等。目前已有研究^[18]表明，CuB能够抑制头颈部鳞状细胞癌的增殖，但主要集中在细胞凋亡方面，对于CuB是否能够诱导TS-CC细胞发生铁死亡的报道尚未见。本研究旨在通过评估不同浓度CuB对TSCC细胞CAL-27的毒性效应及相关铁死亡标志物的变化，初步揭示CuB通过诱导铁死亡途径对TSCC细胞的抑制作用。

铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，其特点是由铁依赖的脂质过氧化物积累导致的细胞死亡，与凋亡、坏死等传统细胞死亡方式存在显著差异，铁代谢失衡与脂质过氧化现象的加剧，构成了铁死亡的2个核心代谢特征^[19-21]。鉴于此，那些涉及铁代谢与脂质代谢调控的基因，能够通过直接或间接的分子机制，影响细胞内铁负荷的调节脂质过氧化反应的进程，进而实现对铁死亡过程的精细调控^[22]。此外，GSH作为体内至关重要的非酶类抗氧化物质，其在防止脂质过氧化方面展现出了不可替代的作用。GSH作为GPX4的关键辅因子，能够催化并转化有毒的脂质过氧化物为无害的醇类物质，从而有效遏制脂质过氧化的连锁反应^[23]，并且可利用谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）将氧化型谷胱甘肽（glutathione synthetase，GSSG）还原为GSH，保护细胞免受氧化应激的损害^[24]。铁死亡相关基因筛选共有3个候选基因选出，分别是Nrf2、SLC7A11、GPX4。有研究^[25-26]表明，Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白的失活被视为铁死亡发生的重要标志，故研究Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路显得尤为重要。Nrf2可诱导抗氧化系统的SLC7A11与GPX4表达，这些抗氧化蛋白能够清除脂质ROS，从而直接避免铁死亡，作为重要的抗氧化转录因子，Nrf2可通过激活一系列含有ARE基因序列的靶基因来降低ROS水平，维持细胞的ROS相对稳态，这些基因负责一部分调节GSH代谢^[27]，另一部分负责酶促抗氧化系统，因此，Nrf2被普遍认为是细胞抗氧化反应的主要调节剂^[28]。SLC7A11作为一种关键的膜转运蛋白，扮演着半胱氨酸-谷氨酸反向转运体的角色，在细胞内外物质交换中发挥着不可或缺的作用^[29]。这一转运体主要负责将细胞外的半胱氨酸转运至细胞内，同时将细胞内的谷氨酸释放到细胞外，从而维持细胞内半胱氨酸的稳态，这对于多种细胞功能至关重要，特别是与氧化防御系统密切相关^[30-31]。GPX4存在SLC7A11的下游调控路径中，是谷胱甘肽过氧化物酶家族的一员，对于清除细胞内由氧化应激产生的过氧化氢及其他过氧化物至关重要，GPX4通过催化GSH与这些有害的过氧化物反应，生成无毒的产物从而保护细胞免受氧化损伤^[32]。因此，GPX4的活性直接关联到细胞的抗氧化能力和生存状态。当Nrf2和SLC-7A11的表达受到抑制时，细胞内的半胱氨酸供应减少，进而影响GPX4的活性，导致细胞抗氧化能力下降，这种情况下，细胞内累积的ROS无法被有效清除，ROS水平显著升高，触发了铁死亡的机制^[33-35]。综上所述，Nrf2、SLC7A11、GPX4之间的复杂相互作用构成了细胞应对氧化应激和铁死亡的重要调控网络。理解这一网络的工作原理，不仅有助于揭示细胞死亡机制的多样性，还可能为癌症治疗、神经退行性疾病等氧化应激相关疾病的治疗提供新的策略。

本研究通过应用不同浓度的CuB对CAL-27细胞进行处理，并采用CCK-8检测法，明确揭示了CuB对CAL-27细胞的抑制作用呈现出显著的剂量依赖特性，进一步观察发现，随着CuB浓度的升高，可诱导CAL-27细胞内Nrf2呈现下降趋势，并下调下游蛋白SLC7A11与GPX4蛋白的表达水平，且铁死亡抑制剂Fer-1可逆转其变化，这是细胞铁死亡途径中的关键分子变化。此外，本研究还深入探讨了CuB处理对CAL-27细胞内多种生化指标的影响。结果显示，随着CuB浓度的梯度增加，细胞内ROS、MDA及Fe²⁺的含量显著上升，而GSH的含量则逐渐降低，并且CuB作用于铁死亡相关指标可以被铁死亡抑制剂有效逆转。综上所述，CuB可以诱导TSCCCAL-27细胞发生铁死亡，其机制可能是通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路来实现的。然而，本研究还存在一些局限性，只进行了TSCC细胞的体外细胞学研究，缺乏相关动物模型实验，后续研究可考虑增加小鼠皮下移植瘤模型、免疫组化以及增加细胞株等实验，进一步验证CuB诱导铁死亡的潜力，为TSCC的临床治疗开辟新的视角。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究项目(KJ2021ZD0088)