自噬相关蛋白5对氧-糖剥夺/复氧损伤的心肌细胞线粒体自噬的影响

摘要

目的 观察自噬相关蛋白5(ATG5)对氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)的H9c2心肌细胞线粒体自噬的影响。方法 通过对H9c2心肌细胞进行OGD/R模拟心肌缺血再灌注损伤。H9c2细胞分别进行如下处理：无任何处理(正常对照组),OGD/R模型(OGD/R组),OGD/R+转染空载质粒(OGD/R-vehicle组),OGD/R+转染ATG5过表达质粒(OGD/R-ATG5组),OGD/R+无意义序列干扰RNA(OGD/R-siRNA negative组)和OGD/R+沉默ATG5基因序列处理(OGD/R-siRNA-ATG5组)。应用细胞计数试剂盒(CCK8)检测H9c2细胞增殖；荧光显微镜观察线粒体的活性；应用逆转录荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测ATG5、FUN14结构域包含蛋白1(FUNDC1)、线粒体动力相关蛋白1(DRP1)、视神经萎缩相关蛋白1(OPA1)mRNA与蛋白表达；Western blot法检测微管相关蛋白1A/1B-轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、核孔糖蛋白P62(P62)蛋白表达；电镜观察H9c2细胞线粒体结构与自噬小体的形成。结果 与正常对照组比较，OGD/R组、OGD/R-vehicle组、OGD/R-ATG5组、OGD/R-siRNA negative组和OGD/R-siRNA-ATG5组的H9c2细胞增殖率降低(F=106.35,P<0.05);OGD/R组、OGD/R-vehicle组、OGD/R-siRNA negative组和OGD/R-siRNA-ATG5组线粒体活性降低，OGD/R-ATG5组线粒体活性升高(F=50.74,P<0.05);OGD/R组、OGD/R-vehicle组、OGD/R-ATG5组、OGD/R-siRNA negative组ATG5、FUNDC1、DRP1 mRNA与蛋白表达水平升高，OGD/R-siRNA-ATG5组ATG5、FUNDC1、DRP1 mRNA与蛋白表达水平降低(均P<0.05);全部组别OPA1 mRNA与蛋白表达水平与正常对照组相比降低(F=9.92、24.33,均P<0.05);OGD/R组、OGD/R-vehicle组、OGD/R-ATG5组、OGD/R-siRNA negative组的LC3Ⅱ蛋白表达水平升高，P62蛋白表达水平降低(F=18.07,17.50,均P<0.05),OGD/R-siRNA-ATG5组LC3Ⅱ蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高。与OGD/R组比较：OGD/R-ATG5组细胞增殖率、线粒体活性、ATG5、FUNDC1、DRP1、OPA1 mRNA与蛋白表达水平升高，LC3Ⅱ蛋白表达水平升高，P62与蛋白表达水平降低；OGD/R-siRNA-ATG5组细胞增殖率、线粒体活性、ATG5、FUNDC1、OPA1 mRNA与蛋白表达水平降低，DRP1蛋白表达水平降低，LC3Ⅱ蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高(均P<0.05),OGD/R-vehicle组和OGD/R-siRNA negative组所有指标与OGD/R组的差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 H9c2细胞在OGD/R损伤后出现线粒体分裂与线粒体自噬，ATG5可增强线粒体自噬，减轻心肌细胞OGD/R损伤。

关键词

缺血再灌注损伤 / 线粒体自噬 / 线粒体分裂 / 自噬相关蛋白5 / 心肌细胞H9c2