基于FPN1/xCT/GPX4/ACSL4信号通路探讨癫痫清含药血清对小胶质细胞铁死亡影响

摘要

目的 研究癫痫清含药血清（DXQ）调节FPN1/xCT/GPX4/ACSL4信号通路对小胶质细胞铁死亡的影响。方法 小胶质细胞分别设置为Con组、Erastin组(0.01 mmol·L^-1 Erastin)、Fer-1组(0.001 mmol·L^-1 Fer-1)、DXQ-L组（5%DXQ）、DXQ-H组（10%DXQ）、Era+Fer-1合并组(0.01 mmol·L^-1 Erastin+0.001 mmol·L^-1 Fer-1)、Era+DXQ-L组(0.01 mmol·L^-1 Erastin+5%DXQ)、Era+DXQ-H组(0.01 mmol·L^-1 Erastin+10%DXQ)。利用CCK-8法考察细胞存活率；免疫荧光法检测胱氨酸/谷氨酸反向转运体（System Xc^-,xCT）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）蛋白表达水平；Western Blot法检测铁死亡关键蛋白GPX4、长链酰基辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase 4,ACSL4）、铁调节转运蛋白1（ferroportin 1,FPN1）、xCT表达；线粒体膜电位法测定线粒体膜电位；活性氧（reactive oxygen species,ROS）探针法检测细胞内ROS含量，亚铁离子试剂盒检测细胞内亚铁离子(Fe²⁺)含量；在此研究基础上，沉默小胶质细胞GPX4基因，分别设为si-NC组、si-GPX4组、si-NC+DXQ-H组、si-GPX4+DXQ-H组，RT-qPCR法测定GPX4 mRNA表达，Western Blot法检测ACSL4、xCT、FPN1、GPX4蛋白水平；免疫荧光法检测GPX4及血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）的共表达。结果 与Con组相比，Erastin组GPX4、xCT、FPN1蛋白表达下调，线粒体膜电位水平下降，ACSL4表达、ROS释放量、Fe²⁺含量升高（P<0.05）；与Erastin组相比，各给药组可增加GPX4、xCT、FPN1蛋白及线粒体膜电位水平，降低ACSL4表达、ROS释放量及Fe²⁺含量（P<0.05）;GPX4基因沉默后，与si-NC组相比，si-GPX4组GPX4 mRNA表达下降；GPX4、xCT、FPN1、HO-1蛋白水平显著降低，ACSL4蛋白水平、MDA含量升高；与si-GPX4组相比，si-GPX4+DXQ-H组可逆转上述情况。结论 DXQ可通过FPN1/xCT/GPX4/ACSL4信号通路，调控抗氧化损伤相关蛋白，抑制小胶质细胞铁死亡。

关键词

小胶质细胞 / 铁死亡 / 癫痫清含药血清 / GPX4 / 活性氧 / Erastin