基于化学蛋白质组学技术揭示雷公藤甲素抑制肺周细胞衰老的作用机制

摘要

目的 借助化学蛋白质组学技术寻找雷公藤甲素（triptolide,TPL）治疗肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）的蛋白靶点，对其药理作用的分子机制展开探究，进而为新药开发以及药物在临床上的应用给予实验方面的参考。方法 通过细胞培养、给药，采用CCK-8方法检测雷公藤甲素对小鼠肺微血管周细胞（SNPM-M175）增殖的影响。借助流式细胞术检测雷公藤甲素对肺微血管周细胞凋亡情况的影响。利用点击化学反应和凝胶电泳技术检测雷公藤甲素能否占据雷公藤甲素探针（TPL-p）在肺微血管周细胞内的蛋白结合位点。利用串联质谱标签（TMT）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对雷公藤甲素抗IPF的关键靶点进行定量分析，并且结合生物信息学分析探究雷公藤甲素治疗肺纤维化可信度较高的靶标蛋白，并对其进行生物信息学分析，明确其作用靶点。采用LC-MS/MS技术分析雷公藤甲素给药组与模型组小鼠肺纤维化组织的差异蛋白表达谱。Western Blot法测定肺组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)及Smad3蛋白表达。结果 肺成纤维细胞增殖的抑制关键在于诱导肺微血管周细胞凋亡，检测到雷公藤甲素对肺微血管周细胞凋亡有影响。结果显示，对照组、TPL 20μmol/L组、TPL 10μmol/L组、TPL 5μmol/L组肺微血管周细胞凋亡率分别为5.82%、8.39%、21.46%、58.37%。TPL 20μmol/L给药能有效抑制肺微血管周细胞衰老。在给药雷公藤甲素12 h后进行活性氧（ROS）检测，结果显示相比于对照组，细胞内ROS水平在TPL 5μmol/L组、TPL 10μmol/L组、TPL 20μmol/L组均有显著提升（P<0.001）。TPL-p探针所占据肺微血管周细胞中蛋白的半胱氨酸残基结合位点能被雷公藤甲素竞争占据。与对照组比较，TPL 20μmol/L组、TPL 10μmol/L组、TPL 5μmol/L组小鼠肺组织中TGF-β1和Smad3蛋白表达显著增加（P<0.01）；与TPL 5μmol/L组比较，TPL 20μmol/L组可显著降低TGF-β1蛋白的表达（P<0.05），且显著下调肺组织中Smad3蛋白的表达（P<0.05）。结论 雷公藤甲素通过靶向TGF-β1和Smad3抑制肺微血管周细胞衰老，可能为抗肺纤维化提供新的策略。

关键词

化学蛋白质组学 / 雷公藤甲素 / 肺纤维化 / 肺周细胞 / 衰老 / 作用机制