茵陈苓桂术甘汤调控SIRT1/Nrf2信号通路介导自噬改善AML12肝细胞脂质沉积的机制研究

摘要

目的 探讨茵陈苓桂术甘汤调控SIRT1/Nrf2信号通路介导自噬改善AML12肝细胞脂质沉积的作用机制，为其在中医药临床运用提供依据。方法 体外培养AML12细胞，随机分为空白组、模型组、茵陈苓桂术甘汤低剂量组、茵陈苓桂术甘汤高剂量组。除空白组外，其他各组细胞均加入200μmol/L游离脂肪酸（棕榈酸∶油酸摩尔比例为1∶2）干预24 h完成NASH细胞造模，空白组及模型组加入空白血清，茵陈苓桂术甘汤低剂量组及高剂量组加入不同剂量的含药血清。采用CCK8法检测细胞存活率，Annexin V-FITC/PI双染联合流式细胞术定量检测细胞凋亡率。采用油红O染色检测肝细胞脂质沉积，选择相应含药血清优效剂量进行后续实验，利用肝细胞转录组测序筛选差异基因并通过RT-qPCR法、Western Blot法对通路进行验证，进一步利用siRNA转染沉默差异基因进行验证。结果 与空白组相比，模型组AML12肝细胞油红O染色存在较为明显的脂滴红染，颜色较深，部分脂滴融合呈片状。与模型组相比，茵陈苓桂术甘汤含药血清干预后细胞内脂滴红染明显减少，颜色明显变浅。机制方面，转录组学结果显示，与空白组相比，模型组中4677个基因表达下调，其中SIRT1和Nrf2基因表达下调明显；与模型组相比，中药组共有3640个基因表达上调，其中也包括SIRT1和Nrf2基因，由此提示，SIRT1/Nrf2信号通路可能参与了茵陈苓桂术甘汤含药血清调控AML12肝细胞的作用；这在RT-qPCR与Western Blot中得到了验证，结果显示，模型组小鼠SIRT1/Nrf2信号通路中关键因子SIRT1、Nrf2、LC3、Rab7的表达水平均显著降低（P<0.05）；而经过茵陈苓桂术甘汤含药血清干预后上述各指标均得到显著升高（P<0.01）。而当使用质粒转染沉默SIRT1后，茵陈苓桂术甘汤含药血清的改善作用明显降低（P<0.01），表明茵陈苓桂术甘汤含药血清以SIRT1/Nrf2通路依赖的方式才能发挥治疗作用。结论 茵陈苓桂术甘汤可改善游离脂肪酸诱导AML12肝细胞脂质沉积并调控自噬，其作用机制可能与激活SIRT1/Nrf2通路有关。

关键词

非酒精性脂肪性肝炎 / 茵陈苓桂术甘汤 / SIRT1/Nrf2信号通路 / 脂质代谢 / 自噬

基金资助

国家自然科学基金项目（82074344）