生孢噬纤维菌内切葡聚糖酶的异源表达及CBM6对其酶学性质的影响

摘要

内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一，但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶，本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm＿1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸，编码蛋白包含一个分泌信号肽、GH5催化结构域、6家族碳水化合物结合模块(CBM6)和一个C末端结构域(CTD)。利用实时荧光定量PCR技术对Sm＿1350在不同碳源条件下的相对表达水平进行了分析，结果表明，Sm＿1350在纤维二糖和滤纸培养基中的表达水平均显著高于在葡萄糖培养基中的表达水平，推测其在CX11降解纤维素过程中发挥一定作用。本研究构建了Sm＿1350及其3种截短突变体，分别为Sm＿1350、Sm＿1350-GH5-CBM6、Sm＿1350-GH5和Sm＿1350-CBM6,并在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明，去除CTD结构域明显提高了目的蛋白的可溶性表达水平。以CMC为底物时，Sm＿1350-GH5-CBM6与Sm＿1350-GH5酶活力分别为(7 000.00±50.00)U/g和(2 542.73±35.03)U/g,表明去除CBM6降低了Sm＿1350-GH5对可溶性多糖的水解能力。酶学性质分析结果显示，Sm＿1350-GH5-CBM6与Sm＿1350-GH5均有较好的pH稳定性，去除CBM6结构域只改变了Sm＿1350-GH5的最适温度，对最适pH以及温度稳定性没有产生影响。此外，Sm＿1350-CBM6具有较强的几丁质结合能力，在蛋白纯化方面具有良好的应用前景。

关键词

内切葡聚糖酶 / 生孢噬纤维菌 / CBM6结构域 / 酶学性质