甲基黄嘌呤N₇-脱甲基酶CdnC的可溶性表达及其酶学性质

摘要

以实验室前期筛选得到的咖啡因降解菌Paraburkholderia caf feinilytica CF1产的甲基黄嘌呤N₇-脱甲基酶CdnC为研究对象,通过密码子优化和pMAL-c5X表达载体成功可溶性表达并纯化出N₇-脱甲基酶蛋白,并对该酶进行酶学性质表征。CdnC底物专一,与氧化还原酶CdnD及谷胱甘肽硫转移酶CdnE共同作用脱去7-甲基黄嘌呤的N₇位甲基,不能作用于咖啡因3,7-二甲基黄嘌呤和1,7-二甲基黄嘌呤的N₇位甲基。SDS-PAGE和分子筛层析确定CdnC-MBP是一个分子质量为76.3 ku的单倍体蛋白。对CdnC进行酶学性质表征,其最适反应温度为30℃,最适反应pH为8.0,pH稳定区间为7.0～8.0。对CdnC的最适缓冲体系进行筛选,确定其最适缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl+50 mmol/L NaCl（pH 8.0）。本实验成功实现了N₇-脱甲基酶的可溶性表达,并确定了CdnC在咖啡因降解中的功能。

关键词

咖啡因 / 甲基黄嘌呤N₇-脱甲基酶 / 咖啡因降解菌 / 单倍体蛋白