海胆Trf重组基因的原核表达及细菌结合特性与抑菌活性

摘要

利用无缝克隆技术通过定点突变构建了载体pET-29b(+)-Trf-E1(292P)-His,并进行原核表达和纯化，得到仅为单体形式且表达量较高的重组蛋白TRF-E1(292P),纯度超过90%。将纯化后TRF-E1(292P)作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA法测定抗体效价为1∶51 200。利用蛋白免疫印迹技术，发现随着重组蛋白质量浓度的增大，其与大肠杆菌结合量逐渐增大，与灿烂弧菌、假交替单胞菌和蜡样芽孢杆菌都具有一定结合能力，但未检测到与枯草芽孢杆菌的结合。通过FITC标记的TRF-E1(292P)与灿烂弧菌结合确定TRF-E1(292P)的饱和浓度，发现在饱和浓度FITC标记的TRF-E1(292P)质量浓度为50μg/mL条件下，未标记的TRF-E1(292P)的加入不影响FITC标记的TRF-E1(292P)与灿烂弧菌的结合，荧光强度保持稳定，表明TRF-E1(292P)与灿烂弧菌结合后没有被替换，两者结合具有不可逆性。抑菌活性结果表明，TRF-E1(292P)处理后，大肠杆菌、灿烂弧菌、假交替单胞菌和蜡样芽孢杆菌的细菌浓度显著降低，在0.25μg/μL处理12 h条件下，细菌浓度分别降至对照组的84.55%、73.10%、51.71%、63.20%,但对枯草芽孢杆菌的生长没有明显抑制作用，且在0～0.25μg/μL,随TRF-E1(292P)质量浓度的增大对细菌生长的抑制作用增强。

关键词

海胆Trf重组基因 / 定点突变 / 多克隆抗体 / 异硫氰酸荧光素 / 抑菌活性