嗜虫书虱几丁质合成酶2基因的克隆与功能研究

摘要

研究嗜虫书虱(Liposcelis entomophila)几丁质合成酶2(Liposcelis entomophila chitin synthase 2,LeCHS2)基因的表达模式及其在嗜虫书虱发育过程中的生物学功能，以期为嗜虫书虱的防治及特异性杀虫剂的新靶标筛选提供理论基础。本研究克隆获得了LeCHS2,其完整的编码区序列(coding sequence, CDS)为4 524 bp,编码1 507个氨基酸，运用生物信息学软件分析发现，其具有17个跨膜结构域，预测蛋白分子的质量为172.9 kDa,理论等电点为6.24,不具有信号肽。LeCHS2的氨基酸序列与其他8种昆虫几丁质合成酶2(chitin synthase 2, CHS2)的同源性为49.05%～53.67%。系统发育树显示，LeCHS2与人体虱(Pediculus humanus corporis)CHS2亲缘关系最近。实时定量PCR(real time quantitative PCR)检测LeCHS2基因在嗜虫书虱不同发育阶段和不同组织部位的表达模式，发现LeCHS2在嗜虫书虱的中肠和后肠中高表达，说明该基因主要在中肠、后肠中发挥作用；若虫期的表达量高于成虫期的，在若虫期第1天、第11天表达量最高。为研究LeCHS2的功能，本研究采用壳聚糖(chitosan, CS)与三聚磷酸钠(tripolyphosphate, TPP)交联产生纳米级递送载体，形成CS-TPP-dsLeCHS2的复合物进行RNA干扰(RNA interference, RNAi)。连续饲喂CS-TPP-dsLeCHS2 24、 48、 72、 96 h后，LeCHS2基因表达量显著降低，实时定量PCR检测其干扰效率，LeCHS2基因表达量分别下降79.4%、 47.0%、 40.0%和25.0%,连续饲喂8 d后嗜虫书虱的存活率为56.6%。干扰LeCHS2后，对腹部外部形态观察发现，嗜虫书虱的体长缩短了17%,腹部厚度减少了18%,体重显著下降；组织切片观察发现，围食膜缺失导致肠道上皮细胞裸露，说明LeCHS2的功能与中肠围食膜的形成有关，对其生长发育至关重要。研究结果表明采用饲喂法干扰LeCHS2后对嗜虫书虱围食膜的形成有破坏作用，从而影响其进食和消化吸收，使其生长发育受阻并最终死亡。

关键词

嗜虫书虱 / 几丁质合成酶2 / 基因功能 / RNA干扰 / 围食膜