基于hyperCas12a和DddA的水稻碱基编辑技术的建立

摘要

目前基于单链DNA脱氨酶和CRISPR/Cas9介导的植物碱基编辑系统已经可以高效地实现基因组上特定碱基替换并在作物缺陷型基因矫正和内源基因定向演化中得到了广泛应用，在此基础之上，识别TTTV PAM(protospacer adjacent motif)的Cas12a可以作为识别NGG PAM的Cas9的补充。虽然在植物中CRISPR/Cas12a介导的碱基编辑技术已有报道，但都是用单链DNA脱氨酶和CRISPR/Cas12a系统相连接，本研究基于实验室前期大量研究基础，尝试将双链DNA脱氨酶引入CRISPR/Cas12a介导的水稻(Oryza sativa)碱基编辑系统中以对其进行优化。首先将高效的Cas12a变体hyperCas12a与高效单链DNA脱氨酶(TadA9或hAID*Δ)相结合，构建了碱基编辑工具rBE92和rBE94,然后将双链DNA脱氨酶DddA的无毒突变体DddA-GSVG引入rBE92和rBE94中，构建了碱基编辑工具rBE92e/f和rBE94e/f,并利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的水稻稳定遗传转化体系对各个碱基编辑工具的编辑活性进行详细评估。在由hyperCas12a与高效单链DNA脱氨酶(TadA9或hAID*Δ)架构的rBE92和rBE94中，经根癌农杆菌介导的水稻稳定遗传转化测试未在靶点处检测到预期碱基编辑事件；而进一步将DddA-GSVG引入rBE92和rBE94中获得新编辑工具rBE92e/f和rBE94e/f,并在水稻中检测其编辑效率，其中rBE92f在Pita基因处成功检测到了编辑效率为4.16%的C-to-T/G编辑事件，rBE94e在OsMPK13基因处成功检测到了编辑效率为1.04%的A-to-G编辑事件，编辑窗口为PAM序列3′端第10位至第16位。本研究表明将双链DNA脱氨酶DddA引入CRISPR/hyperCas12a介导的水稻碱基编辑系统可以在水稻中识别TTTV PAM并完成预期的碱基编辑，该研究为优化和丰富水稻碱基编辑工具提供又一新的方向，有助于在水稻中实现启动子或终止子等富含T的序列区域的碱基编辑和定向演化。

关键词

水稻 / CRISPR/hyperCas12a / DddA / 碱基编辑