基于重组酶聚合酶扩增和微流控的病原菌检测方法

摘要

由病原菌感染引发的疾病严重危害人类健康，病原菌的检测技术一直备受研究者的关注。目前的病原菌检测方法存在检测周期长、检测仪器成本高、空间需求大等问题，这些问题极大地限制了资源匮乏地区的病原菌防控，因此研发一种快速准确、低成本、空间需求小的检测方法对病原菌防控具有重要意义。本研究采用磁珠法提取纯化病原菌核酸，再利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术扩增目标片段，最后通过荧光显色实现检测结果的可视化判定。整个实验流程被设计在一张微流控芯片上，应用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等4种重要病原菌的快速检测。结果表明，基于微流控的磁珠法经优化后可在40 min内完成DNA提取纯化，与其他常见的核酸提取方法相比，该方法所得DNA的浓度、纯度和完整性较好，可用于后续PCR等分子生物学实验；基于微流控的RPA法在39℃, 20 min内可完成对病原菌特征基因片段的扩增，本研究利用该方法共检测了18株不同菌种的病原菌，与对照相比，扩增产物荧光显色差异显著，测序结果进一步验证了荧光可视化判定结果的准确性。综上，与传统检测方法相比，基于微流控的磁珠法和RPA技术结合的病原菌检测方法不仅显著缩短了检测周期，而且弥补了传统检测方法的不足。该方法具有设备要求低、空间需求小、集成性好等优势，为病原菌检测提供了一种快速、经济、简便的补充方案。

关键词

重组酶聚合酶扩增 / 微流控 / 磁珠法 / 可视化 / 病原菌检测