rAAV-PHP.eB病毒包装条件优化及其体外感染能力的研究

doi:10.13417/j.gab.044.001157

基因组学与应用生物学 ›› 2025, Vol. 44 ›› Issue (11) : 1157 -1170. DOI: 10.13417/j.gab.044.001157

韦雅露, 张玉雪, 卿天钰, 何金声, 何榕晏, 长孙东亭, 罗素兰

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摘要

新型腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)血清型AAV-PHP.eB,可高效靶向中枢神经系统(central nervous system, CNS),是治疗CNS相关疾病的重要病毒载体。然而，采用三质粒瞬时转染法制备AAV-PHP.eB血清型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)的转染工艺参数仍缺乏系统探究。因此，本研究针对AAV-PHP.eB血清型病毒的三质粒瞬时转染包装条件，对其中的质粒总量与质粒-PEI Max比例进行优化，通过分析平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)以及利用流式细胞术检测荧光阳性细胞的比例，确定最佳转染条件为质粒总量4μg/孔、质粒-PEI Max比例为1∶3;应用最佳包装条件进行扩大生产制备的rAAV-PHP.eB-zsGreen1/tdTomato病毒粗液经qPCR检测滴度为7.94×10～9 vg/mL和7.09×10～9 vg/mL, SDS-PAGE证实病毒衣壳蛋白分子量符合预期理论值；通过观察荧光感染效果以及分析荧光面积占比，在体外对rAAV-PHP.eB病毒粗液感染能力进行评估，结果表明，两种病毒可有效感染AAV-293及多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞), PCR扩增验证了病毒感染MES23.5细胞后zsGreen1与tdTomato基因成功表达，进一步证明了rAAV-PHP.eB有效感染MES23.5细胞。本研究建立的优化包装体系与体外感染能力的验证，可为基于rAAV-PHP.eB,靶向CNS疾病(如帕金森病)开展基因治疗研究奠定基础。