芒果U6启动子的筛选与转录活性分析

摘要

U6启动子是成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因组编辑系统中驱动向导RNA(single guide RNA,sgRNA)转录的启动子，其转录活性受物种特性和序列长度的影响，目前芒果(Mangifera indica) U6启动子尚未被鉴定。本研究基于‘四季蜜芒’基因组数据，利用拟南芥(Arabidopsis thaliana) U6启动子保守序列从芒果基因组中筛选出7个U6启动子序列，其保守区域全长均为102 bp，序列比对发现，芒果MiU6启动子的保守序列与拟南芥At U6、苹果(Malus domestica) MdU6、橡胶树(Hevea brasiliensis) pro Hb U6以及番茄(Solanum lycopersicum) Sl U6的启动子序列高度相似，但侧翼序列差异较大。构建以MiU6启动子驱动β-葡萄糖醛酸酶报告基因(β-glucuronidase reporter gene,GUS)的融合表达载体，利用花序侵染法转化野生型拟南芥。GUS染色和酶活鉴定结果显示，4个MiU6启动子(MiU6-2P-1、MiU6-6P-1、MiU6-6P-3和MiU6-7P-2)成功驱动GUS报告基因在拟南芥中表达，其中MiU6-6P-3转录活性最高，其次是MiU6-7P-2和MiU6-2P-1。进一步在转基因烟草(Nicotiana tabacum)和芒果叶片中进行瞬时表达，检测发现MiU6-6P-3和MiU6-7P-2的GUS活性较高。结合以上三种不同的转基因植株GUS活性检测结果，优先推荐使用MiU6-6P-3作为U6启动子，其次是MiU6-7P-2。本研究为构建芒果CRISPR/Cas9基因组编辑系统筛选了候选的U6启动子。

关键词

芒果 / U6启动子 / GUS报告基因 / 转录活性