新型双荧光素酶启动子报告分析系统的构建与验证

摘要

目的 构建一种多功能的5’双荧光素酶启动子分析报告系统，该系统同时包含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶元件，以弥补传统分析启动子活性时需同时转入双质粒的不足。方法 通过基于PCR的长DNA序列准确合成法（PAS）技术，制备含有双酶切位点的海肾荧光素酶基因和SV40启动子片段，采用重组克隆技术将其插入pGL3-basic质粒中，构建pGL-Duo双荧光素酶启动子分析报告质粒。随后，采用同源重组克隆技术将PGK启动子亚克隆到pGL-Duo质粒的多克隆位点（MCS）区。经酶切分析、DNA测序、293T细胞瞬时转染以及荧光素酶活性检测，验证pGL-Duo双荧光素酶报告系统的功能是否正常。结果 通过酶切分析和DNA测序，确认pGL-Duo报告质粒及其含PGK启动子的版本均构建正确。瞬时转染实验及荧光素酶活性检测显示，PGK启动子能有效启动萤火虫荧光素酶基因表达（P<0.01），双荧光素酶启动子报告分析系统功能正常。结论 成功构建并验证了一种新型双荧光素酶启动子报告分析系统，可为启动子转录活性及转录因子调控研究提供高效且便利的方案，适用于大规模启动子筛选、验证以及转录因子表达调控的研究。

关键词

双荧光素酶 / 质粒 / 基因表达 / 启动子