靶向线粒体和过氧化物酶体载体的构建及在心肌缺氧模型中的应用

摘要

目的 构建用于特异性标记线粒体和过氧化物酶体的重组腺病毒载体，并研究在缺氧条件下心肌细胞中以上两种细胞器的变化。方法 通过PCR技术，构建pShuttle-Mito-EGFP和pShuttle-mCherry-Peroxisome质粒。Sanger测序检测目的片段。包装及扩增重组腺病毒，氯化铯梯度离心法纯化病毒，梯度稀释法确定病毒滴度。体外分离并提取的SD乳鼠原代心肌细胞（rat cardiomyocytes,RCM），分别感染pAd-Mito-EGFP和pAdmCherry-Peroxisome病毒24 h后，验证其是否能够特异性地标记目标细胞器。RCM分别感染pAd-Mito-EGFP和pAd-mCherry-Peroxisome病毒，分为常氧组和缺氧组，处理24 h后，观察线粒体和过氧化物酶体分布的变化。同时感染两种病毒的RCM也进行同样处理，观察细胞器数量、形态及位置关系的变化。结果 DNA测序验证pAd-Mito-EGFP和pAd-mCherry-Peroxisome重组腺病毒构建成功。经测定，重组腺病毒的滴度约为9×108PFU·mL-1。荧光标记可以正确标记细胞质中网格状线粒体和点状分布的过氧化物酶体，与常氧培养条件下相比，缺氧刺激后线粒体出现碎片化且丰度降低（P均<0.05），单个细胞中过氧化物酶体数量减少（P<0.01）。计算皮尔森相关系数（PCC）和曼德斯共定位系数（MCC）显示，与常氧培养条件下相比，缺氧刺激后两种细胞器相关系数和重叠值均减小（P均<0.05）。结论 成功构建特异性标记线粒体和过氧化物酶体的腺病毒载体，心肌缺氧后这两种细胞器的丰度减少且位置关系减弱。

关键词

线粒体 / 过氧化物酶体 / 心肌细胞 / 缺氧