绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

徐杨玉; 刘付香; 洪彦彬; 陈小平; 李海芬; 温世杰; 李杏瑜; 李玲; 梁炫强

doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

热带生物学报 ›› 2024, Vol. 15 ›› Issue (06) : 683 -690. DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

徐杨玉, 刘付香, 洪彦彬, 陈小平, 李海芬, 温世杰, 李杏瑜, 李玲, 梁炫强

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摘要

基于绿色木霉中抗菌蛋白质的de-novo质谱测定得到的部分肽段序列，通过BLASTp数据库检索，发现该肽段由碱性蛋白酶基因编码，采取同源克隆技术扩增出目的基因片段。生物信息学分析揭示，TvALP基因（GenBank编号KJ659907）完整开放读码框为1 230 bp，并编码了一个由409个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质的预测分子量约为43 kD，且含有一段由20个氨基酸组成的信号肽。根据分类，该蛋白质属于Peptidase inhibitor＿I9超家族，并且是枯草杆菌蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶S8家族的一个成员。利用双酶切法将测序正确的质粒连接至原核表达载体pET30a中，在宿主菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果在45 kD处显示出1条特异蛋白质条带，与生物性信息预测目的蛋白大小一致，表明切除信号肽的表达质粒pET30a-ΔTvALP（“Δ”表示切除信号肽）在宿主菌BL21(DE3)pLysS中成功表达。经超声波破碎后，蛋白形成了包涵体。但经体外复性技术，未能获得有活性的蛋白进行抗菌机理研究。