甘蔗杆状病毒绝对荧光定量检测方法的建立与应用

摘要

为建立甘蔗杆状病毒（sugarcane bacilliform virus,SCBV）的绝对荧光定量PCR检测方法，并测定甘蔗不同组织部位中SCBV载量，本研究从SCBV基因组保守区（SCBV-ORF1）设计特异性扩增引物，构建重组质粒pMD19T-SCBV-P1作为阳性质粒标准品，以其为模板建立SCBV绝对荧光定量PCR检测方法。测试该方法的灵敏性、特异性和稳定性，并用该方法测定甘蔗种质不同组织中SCBV载量。结果表明，将含有SCBV基因组序列的重组质粒10倍比稀释成标准品，以其为模板进行荧光定量PCR，获得标准曲线y=-3.339 7×log（x）+32.05，相关系数r²=0.999；表明Cq值与标准品浓度拷贝数的对数呈线性关系。研究建立的绝对荧光定量PCR方法展现出高灵敏度特征，其检测下限可达到7 copies·μL^-1，相较于常规PCR检测法，该方法的灵敏度提高了近100倍。该方法特异性高，可特异检测SCBV；重复性良好，批内和批间的变异系数均在0.11%～0.90%。甘蔗不同组织部位SCBV累积水平存在显著差异，其中正4叶SCBV载量显著高于其他组织部位（P<0.05）。本研究建立了能灵敏特异检测SCBV的绝对荧光定量PCR方法，为SCBV的诊断提供一种高效的定量检测方法，明确了甘蔗中SCBV检测的最佳采样部位是正4叶。

关键词

甘蔗杆状病毒 / 绝对荧光定量PCR / 病毒载量 / 检测