液泡型ATP酶在青年和衰老小鼠卵巢中的表达分析

Expression analysis of vacuolar ATPase in the ovaries of young and aged mice

摘要

为探讨液泡型ATP酶（V-ATPase）核心亚基ATP6V1G1和ATP6V0A3在小鼠卵巢衰老过程中的表达特征及潜在功能，从分子、组织和整体水平开展系统研究.利用小鼠衰老数据库分析Atp6v1g1和Atp6v0a3在3月龄与21月龄小鼠多器官中的表达差异，并选取2月龄（青年组）与22月龄（衰老组）雌性C57小鼠各6只，观察体表衰老特征，测定心、肝、脾、肺、肾及卵巢重量并计算器官指数，通过检测血清谷胱甘肽（GSH）与丙二醛（MDA）水平评估氧化应激状态.采用苏木精-伊红（HE）染色观察卵巢结构变化，结合实时定量PCR（RT-qPCR）和免疫组织化学（IHC）分析目标基因的表达水平及蛋白定位.结果显示，Atp6v1g1和Atp6v0a3在不同组织中表达差异明显，部分器官中呈上调趋势.衰老小鼠表现出毛发稀疏、皮肤松弛等老化特征，胸腺和卵巢重量下降，脾和肝重量升高，血清GSH水平降低，MDA升高，提示氧化应激增强. HE染色显示卵巢卵泡数量减少、结构紊乱，颗粒细胞排列疏松.RT-qPCR结果表明衰老组卵巢中Atp6v1g1和Atp6v0a3 mRNA表达显著上调，免疫组化分析显示两种蛋白在卵母细胞与颗粒细胞中呈阳性分布.结果表明，V-ATPase关键亚基在卵巢衰老过程中表达上调，可能通过调控溶酶体功能与细胞代谢状态参与卵巢老化机制，为揭示生殖衰老的分子基础及相关干预策略提供理论依据.

Abstract

To explore the expression characteristics and potential functions of the core subunits ATP6V1G1 and ATP6V0A3 of vacuolar ATPase （V-ATPase） during ovarian aging in mice， a systematic analysis was conducted at the molecular， tissue， and organismal levels. Expression profiles of Atp6v1g1 and Atp6v0a3 across various tissues in 3- and 21-month-old mice were examined using an aging-related transcriptomic database. Female C57BL/6 mice aged 2 months （young group） and 22 months （aged group） were selected （n = 6 per group）. Aging phenotypes were recorded， and the weights of major organs including heart， liver， spleen， lung， kidney， and ovary were measured to calculate organ indices. Oxidative stress status was assessed by measuring serum levels of glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA）. Histological changes in ovarian structure were evaluated using hematoxylin and eosin （HE） staining. Quantitative real-time PCR （RT-qPCR） was employed to detect mRNA expression levels of the target genes， and immunohistochemistry was used to analyze protein localization. The results showed diverse expression patterns of Atp6v1g1 and Atp6v0a3 across different tissues， with upregulation observed in several organs. Aged mice exhibited typical signs of senescence such as sparse fur and loose skin， along with significantly reduced thymus and ovary weights， and increased liver and spleen weights. Serum GSH levels were markedly decreased and MDA levels elevated in the aged group， indicating enhanced oxidative stress. HE staining revealed decreased follicle numbers， disrupted tissue architecture， and disorganized granulosa cell arrangement in aged ovaries. RT-qPCR analysis demonstrated significant upregulation of Atp6v1g1 and Atp6v0a3 mRNA levels in aged ovaries. Immunohistochemical staining showed positive expression of both proteins in ovarian follicles， primarily localized in oocytes and granulosa cells. These findings suggested that key subunits of V-ATPase were upregulated during ovarian aging and might play important roles by modulating lysosomal function and cellular metabolism. The results provided experimental evidence for elucidating the molecular mechanisms underlying ovarian aging and offered a theoretical basis for potential intervention strategies in reproductive aging.

Graphical abstract

关键词

衰老 / 卵巢 / 液泡型ATP酶 / ATP6V1G1 / ATP6V0A3 / 氧化应激

Key words

aging / ovary / vacuolar ATPase / ATP6V1G1 / ATP6V0A3 / oxidative stress

在雌性生殖系统中，卵巢作为核心生殖器官，其功能状态直接影响雌性的生殖健康^［1］.随着年龄增长，卵巢会经历渐进性的功能衰退，这一过程伴随着一系列复杂的生理变化^［2］.溶酶体作为细胞内重要的调控中心，在卵巢功能维持和衰老进程中扮演着关键角色^［3］.溶酶体是一种膜性细胞器，主要负责维持细胞内环境稳态和代谢产物的降解^［4］，其内部含有多种水解酶，能够高效分解大分子物质和细胞成分^［5-6］.通过吞噬、融合及分解等机制，溶酶体可精确调控细胞内代谢废物的清除和外来病原体的降解，从而确保细胞正常的代谢活动和稳态平衡^［7］.溶酶体通过参与细胞自噬过程，选择性清除受损或衰老的细胞器，这一功能对维持细胞活力具有决定性作用^［8］.然而，随着细胞衰老进程的推进，溶酶体功能会出现显著衰退.这种功能紊乱主要表现为：细胞内代谢平衡失调^［9］、水解酶异常释放^［10］以及氧化应激水平升高^［11］.这些病理变化不仅加速了细胞衰老的进程^［12］，还可能通过正反馈机制进一步恶化溶酶体功能障碍，形成恶性循环.在卵巢衰老过程中，这种溶酶体功能的进行性衰退可能直接影响卵泡发育和卵母细胞质量，从而加速生殖功能的退化.

溶酶体功能异常会显著影响卵巢细胞的代谢稳态和信号转导网络，从而加速卵巢功能的衰退进程^［13］.液泡型ATP酶（V-ATPase）作为溶酶体膜上的关键质子泵，是由胞质V1催化结构域和膜结合V0结构域组成的多亚基复合体^［14］.该酶通过主动转运质子至溶酶体内^［15］，在建立和维持溶酶体最佳pH环境方面发挥着不可替代的作用^［16］.这种精确的pH调控是溶酶体水解酶发挥最佳活性、实现大分子降解、营养感知和物质转运等生理功能的重要保障^［17］.ATP6V1G1和ATP6V0A3作为V-ATPase的亚基，在维持溶酶体功能和细胞代谢平衡中具有重要作用^［18］.通过比较青年和衰老小鼠卵巢组织中这些亚基基因的表达和定位，可以深入揭示溶酶体在卵巢功能维持中的分子机制及其与衰老的关联性.尽管已有研究表明V1G1和V0A3亚基能够调控V-ATPase的酶活性和溶酶体生物发生^［19］，但它们在生殖系统中的时空表达特征及其在生长繁殖中的具体功能仍不清楚.因此，系统研究衰老过程中溶酶体功能的变化规律，不仅有助于阐明生殖衰老的分子机制，还可能为开发延缓衰老、改善生殖健康和提高生育能力的干预策略提供新的理论依据.

本研究基于衰老数据库分析3月龄与21月龄小鼠组织中Atp6v1g1和Atp6v0a3的表达差异，采用t检验进行统计学评估.实验选用2月龄和22月龄C57雌鼠，系统比较其表型参数、器官系数及氧化应激指标.通过卵巢H&E染色分析组织形态变化，结合RT-qPCR和免疫组化技术检测这两个V-ATPase的核心元件在卵巢中的表达与定位差异，旨在探索这些V-ATPase亚基在卵巢衰老过程中的潜在作用.

1 材料

1.1 试验动物及处理

选取雌性C57BL/6小鼠12只，其中青年组6只（2月龄），衰老组6只（22月龄），购自成都达硕实验动物有限公司.采样前48 h腹腔注射PMSG 10 IU以诱导同步发情.先经眼眶静脉丛采血，室温静置30 min凝血后以3 000 g、10 min、4 °C离心，分装血清置于-80 ℃保存.随后行颈椎脱臼法处死小鼠，在冰上迅速无菌取材.取出双侧卵巢，去除脂肪体后以冰冷生理盐水轻柔漂洗并吸干表面液体；按预先设定的侧别分配：右侧卵巢置入预冷无RNA酶离心管液氮速冻，转存于-80 ℃，用于RNA/蛋白及氧化应激相关检测；左侧卵巢置于4%多聚甲醛于4 ℃固定24 h.其余器官按研究目的分别行液氮速冻或4%多聚甲醛固定保存.

1.2 主要药品与试剂

PMSG（宁波第二激素厂）；DEPC 水（Vazyme）；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme）；苏木精染液（Servicebio）；伊红染色试剂盒（Solarbio）；石蜡（上海国药集团）；RNA 提取试剂盒（Biosharp）；MDA 检测试剂盒（Biosharp）；GSH 检测试剂盒（Biosharp）；中性树脂（Biosharp）；4%多聚甲醛（Biosharp）；ATP6V1G1兔抗（武汉三鹰生物）；ATP6V0A3兔抗（武汉三鹰生物）；羊抗兔二抗（Beyotime）.

2 方法

2.1 衰老数据库信息检索

在衰老数据库（https：//twc-stanford.shinyapps.io/maca/）中检索了Atp6v1g1和Atp6v0a3基因在3月龄与21月龄小鼠多个器官中的表达数据.基于检索结果，对上述基因在不同年龄阶段各器官中的表达差异进行分析.

本研究同时包含“公开数据库分析”与“动物实验验证”两部分，数据库分析采用3月龄与21月龄样本；动物实验采用2月龄与22月龄小鼠.根据衰老研究中常用的小鼠生命阶段划分，2~3月龄作为青年阶段，而20~24月龄作为衰老阶段，因此本研究的2/3月龄与21/22月龄分别处于同一生命阶段^［20］.

2.2 小鼠器官指数的测定

将小鼠先进行体重称量，其后进行眼眶取血以及处死.打开小鼠腹腔，迅速按顺序收集卵巢、输卵管、子宫、脾、肾、肝、胸腺、心、肺以及腿肌等，称量器官重量并拍照记录各器官的形态.

2.3 微板法检测MDA、GSH水平

GSH和MDA含量采用微板法进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行. GSH测定中，将酶标仪预热，波长调至412 nm，按浓度梯度（300、200、100、50、25 µg/mL）配制标准溶液.于96孔板中分别加入标准液、小鼠血清样品或蒸馏水20 µL，随后依次加入试剂一（140 µL）和试剂二（40 µL），混匀静置2 min后，在412 nm处读取吸光值（OD）.MDA测定中，将标准品稀释至1、2、5、10、20、50 µM.分别在离心管中加入100 µL标准液、小鼠血清或PBS，再加入200 µL MDA检测工作液，混匀后于100 ℃金属浴中加热60 min，冷却至室温后，1 000 g离心10 min.取200 µL上清转移至96孔板，在532 nm处检测OD值.记录A测定、A标准与A空白值，计算ΔA= A测定 - A空白，并根据标准浓度与ΔA标准绘制标准曲线，进而计算样品中GSH与MDA的实际含量.

2.4 H&E染色

将预先置于4%多聚甲醛（PFA）中固定24 h以上的青年组与衰老组小鼠卵巢取出，按照常规组织学步骤进行石蜡包埋与H&E染色.组织经70%、80%、90%、95%及100%梯度乙醇脱水，随后经二甲苯透明后浸蜡，石蜡包埋.采用石蜡切片机制备5 μm厚组织切片，依次进行苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，H&E）染色.在光学显微镜下观察卵巢的组织结构变化，比较其随年龄变化所呈现的退行性改变.

2.5 总RNA提取和实时荧光定量PCR

小鼠卵巢组织经液氮充分研磨后置于总RNA提取试剂中，使用高通量组织研磨仪进一步裂解组织.随后加入氯仿（体积为总RNA提取试剂的1/5），涡旋振荡15 s后置于冰上静置5 min.经4 ℃、12 000 rpm离心15 min，收集最上层无色水相并转移至新管中.加入等体积异丙醇混匀，室温静置5 min，再次以4 ℃、12 000 rpm离心10 min，弃上清.沉淀使用75%乙醇洗涤，重复洗涤步骤2次，之后空气干燥并溶解于DEPC水中.测定RNA浓度与纯度后用于后续反转录反应.

反转录使用商业试剂盒按照说明进行.将1 µg总RNA与4 µL 4× gDNA Wiper混合液于200 µL离心管中混匀，加入无RNA酶水补足至16 µL，在PCR仪中42 ℃孵育2 min以去除基因组DNA.随后加入4 µL 5× HiScript Ⅱ Q RT SuperMix Ⅱ，混匀后继续反应.反转录程序为：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，获得cDNA产物. qPCR反应以所得cDNA为模板，体系总量为10 µL，包含：cDNA 1 µL，上游引物0.5 µL，下游引物0.5 µL，2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 µL，ddH₂O 3 µL.扩增条件为：94 °C预变性2 min，随后45个循环，每循环包括94 ℃变性15 s，60 ℃退火及75 ℃延伸20 s.每个样本设置3次技术重复以确保数据的准确性与重复性.

使用2^－ΔΔCt法计算各基因的相对表达量.根据NCBI中小鼠的基因序列设计基因的引物，所有引物都由成都擎科生物技术有限公司合成.内参基因为β-actin引物，见表1.

2.6 免疫组织化学

将经4%多聚甲醛（PFA）固定24 h的青年组与衰老组小鼠卵巢组织依次进行脱水、石蜡包埋，并制备5 μm厚石蜡切片.切片经常规脱蜡水化后，置于柠檬酸缓冲液中进行抗原修复.修复完成后，切片置于3%过氧化氢溶液中，室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化酶活性，随后用PBS冲洗干净.接着，使用3%BSA封闭液在室温下封闭非特异性抗原位点30 min.吸去封闭液后，分别加入一抗ATP6V1G1（1∶100）和ATP6V0A3（1∶100），于4 ℃条件下孵育过夜.次日回温后，PBS洗涤去除未结合一抗，加入相应二抗，室温孵育50 min.洗去二抗后，滴加新鲜配制的DAB显色液，显色后用苏木精复染，依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后中性树胶封片.

2.7 数据分析

所有数据使用 GraphPad Prism 8 进行统计与作图.组间比较采用双侧非配对 Student’s t 检验，数据以均值 ± 标准差（mean ± SD）表示.P< 0.05为差异显著（*），P< 0.01为极显著（**），ns代表差异不显著.

3 结果与分析

3.1 基于衰老数据库中 V-ATPase 核心元件的组织特异性表达分析

基于公开衰老数据库的比对，3月龄与21月龄小鼠多组织（骨骼肌、大脑、肺等）中Atp6v1g1与Atp6v0a3的表达呈年龄相关差异（图1）.图1-A显示，Atp6v1g1在21月龄小鼠的骨骼肌与皮肤中上调，而在肠系膜脂肪组织中下调；图1-B显示，Atp6v0a3在心与肾中上调.上述结果表明，V-ATPase各亚基在不同组织中呈差异化的年龄响应.

3.2 衰老对小鼠主要器官形态的影响

对2月龄与22月龄雌鼠的外观进行比较（图2-A）显示（红圈为对比区域）：青年组在标注区被毛连续且致密、反光度较高；衰老组在对应区域可见被毛稀疏或局灶性脱毛，毛干较粗糙、反光度下降.此外，对两组小鼠的体重进行了统计分析（图2-B），结果显示尽管衰老组小鼠的平均体重略高于青年组，但差异无统计学意义（P > 0.05）.进一步对小鼠进行解剖，按顺序选取了卵巢、输卵管、子宫、脾、肾、肝、胸腺、心、肺以及腿肌，对其进行称量记录并拍照记录各器官的形态.选取了一组青年与衰老小鼠的器官对比情况进行展示，见图2-C.从形态上对青年小鼠和衰老小鼠的器官进行观察，形态观察显示，青年与衰老小鼠的器官存在差异：衰老组卵巢表面可见瘀斑，青年组卵巢表面较为光整；衰老组输卵管与子宫呈萎缩，青年组未见明显变形且质地较柔软；青年组脾、肾、肝、胸腺、心与肺大小基本正常、结构较致密、色泽较鲜明，衰老组上述器官出现不同程度的形态改变并伴色泽减退；青年组腿肌较为紧实、张力较高，衰老组骨骼肌较为瘦弱，张力降低.

器官重量及器官指数（器官重量/体重）比较见图3~图4.结果显示，衰老的影响具有器官特异性.与青年组相比，衰老组输卵管重量降低、胸腺重量极显著降低，而肝重量升高；脾、肾、心与肺重量均极显著升高.器官指数方面，输卵管与子宫指数降低、胸腺指数极显著降低；脾与心指数升高，肾与肺指数极显著升高.这些结果表明，衰老对不同器官的影响存在明显差异.

3.3 衰老对小鼠血清氧化应激标志物的影响

为评估衰老相关的氧化应激，检测了血清中的谷胱甘肽（GSH）与丙二醛（MDA）（图5）.与青年组相比，衰老组 GSH 水平显著降低，MDA水平极显著升高（图5）.上述结果表明，衰老伴随抗氧化能力下降（GSH减少）与脂质过氧化增强（MDA升高）.

3.4 H&E染色揭示卵巢组织年龄相关病理变化

H&E染色显示，青年组与衰老组小鼠卵巢组织存在差异（图6）.青年组切片中，各级卵泡（原始、初级、次级）分布较密，结构完整，卵泡膜清晰，颗粒细胞层排列紧密；间质可见较丰富的血管网络与有序结缔组织，细胞外基质结构完整.相比之下，衰老组出现退行性改变：总体卵泡数量减少，残留卵泡形态异常，表现为卵泡壁结构紊乱、颗粒细胞层疏松，并可见卵泡壁破裂、核固缩及卵母细胞空泡变性等病理征象.上述组织学特征反映卵巢组织结构完整性受损.

3.5 衰老对小鼠卵巢组织Atp6v1g1和Atp6v0a3基因表达的影响

RT-qPCR检测结果显示，青年组与衰老组小鼠卵巢组织中V-ATPase亚基基因表达存在显著差异（图7）.与青年组相比，衰老组小鼠卵巢组织中Atp6v1g1和Atp6v0a3基因的mRNA表达水平则呈现显著上调.

3.6 衰老对小鼠卵巢组织ATP6V1G1和ATP6V0A3蛋白定位与表达的影响

对青年小鼠和衰老小鼠的卵巢组织进行免疫组化切片染色，使用了两种抗体分别是ATP6V1G1和ATP6V0A3.图8展示了两种蛋白在卵巢组织中的定位情况，其中左侧为组织全貌图（低倍放大），中间和右侧为选定区域的局部放大图（高倍视图）.染色结果显示，在两组卵巢组织中两种抗体均呈现出不同程度的阳性表达，阳性信号主要分布于卵泡结构（包括卵母细胞与颗粒细胞）及其邻近细胞，整体以卵泡区域为主.

4 讨论

综合上述结果，衰老对小鼠机体产生了广泛影响.本研究主要发现：（1）数据库比对显示，溶酶体相关基因Atp6v1g1和Atp6v0a3在3月龄与21月龄小鼠的多组织间存在年龄相关表达差异，且变化不一致；（2）青年和衰老小鼠实验证实，衰老显著影响整体健康、器官功能及氧化应激水平；（3）卵巢组织学分析揭示衰老导致卵泡数量减少并出现结构异常等特征；（4）分子实验表明，Atp6v1g1和Atp6v0a3在衰老卵巢中的mRNA水平上调.这些结果提示溶酶体相关基因可能通过调控卵巢功能参与衰老进程.下文将深入探讨这些发现.

既往研究与当前数据一致表明，年龄增长对机体产生广泛影响.对 C57雌性小鼠的表型观察显示：与青年组相比，衰老组被毛更为干燥、器官重量及其相对指数（器官重量/体重）常用于评估生长发育与器官状态；既往在药理性衰老模型中报道体重、脾与肾重量升高^［21］，本研究未观察到体重差异，但在脾、肾、肝、心、肺及胸腺等器官的重量与指数上检测到显著差异，提示年龄增长伴随多器官层面的结构与质量变化.氧化应激被认为是衰老的重要生物学标志^［22］；D-半乳糖诱导的衰老模型提示 MDA、ROS 等指标升高而抗氧化酶活性下降^［23］，与此相应，自然衰老小鼠的血清检测显示 GSH 降低、MDA 升高，指向抗氧化能力减弱与脂质过氧化增强^［24］ .在生殖系统方面，恒河猴研究显示随年龄增长卵泡定位与卵巢表面结构发生改变^［25］；本研究的H&E观察亦见衰老小鼠卵泡数量减少与形态退行.总体而言，年龄相关改变在外观、器官层面与分子水平上呈累积表现，为理解衰老机制与干预提供了参照.

近年研究提示，溶酶体功能是影响细胞寿命的重要因素之一^［26］.作为细胞内重要的调控中心，溶酶体不仅参与多种已知的衰老相关过程，还可能通过尚未完全阐明的机制直接影响寿命调控.在机体衰老进程中，溶酶体功能障碍导致的衰老细胞累积已被证实会显著破坏组织稳态和生理功能^［18］.特别值得注意的是，研究发现溶酶体腔室pH值的异常降低是衰老相关溶酶体功能障碍的核心特征，这种酸性环境的紊乱会通过干扰氨基酸储存等关键代谢途径损害线粒体功能，从而加速细胞衰老进程^［27］.在这一调控网络中，V-ATPase作为维持溶酶体酸性环境的质子泵，通过调控跨膜质子转运在决定溶酶体pH稳态中发挥着不可替代的作用^［28］.ATP6V1G1和ATP6V0A3作为V-ATPase的关键功能亚基，通过协同作用维持包括溶酶体在内的多种细胞器腔室的酸性微环境^［19］.特别是，这些亚基通过调控V-ATPase的组装和活性，直接参与溶酶体酸化过程的精细调控，从而影响溶酶体的水解酶活性和自噬功能^［29］.有研究利用实时荧光标记ATP6V1G1，并且利用共聚焦显微镜及透射电子显微镜观察，最后证明了V1G1与囊泡内的酸化是密切相关的^［30］.V1G1亚基位于V1催化结构域，直接参与ATP水解和能量转换过程，其表达水平直接影响V-ATPase的质子泵活性^［31］.与之相对应，Atp6V0A3则构成V0跨膜结构域的核心组分，负责形成质子传导通道^［32］.研究发现Atp6V0A3则参与调节V1-V0结构域的组装效率^［33］.ATP6V1G1在破骨细胞中高度富集，通过酸化微环境促进骨吸收^［34］；还有证据说明V0A3亚基不仅与细胞酸化密切相关，还参与了囊泡的胞吐作用^［35］.与上述认识相呼应，在所检测的小鼠组织中，Atp6v1g1与Atp6v0a3的年龄相关表达在不同组织间变化方向不一致；在卵巢中，两者在 mRNA 与蛋白水平均呈上调.这种选择性上调提示溶酶体功能发生了适应性改变，可能是为了应对衰老过程中细胞内废物累积增加、代谢产物降解需求增强等变化，从而维持衰老细胞的稳态.这些发现为理解v-ATP酶在衰老过程中的调控机制提供了新见解.总的来说，系统解析溶酶体相关基因在衰老中的表达变化并进行功能验证，有望加深对细胞衰老应答的理解，并为后续研究与潜在干预提供参考.

5 结论

衰老引起小鼠表型、器官以及氧化应激水平变化，同时导致其卵巢中V-ATPase核心元件Atp6v1g1和Atp6v0a3在mRNA水平上调，这表明V-ATPase相关基因在卵巢中的表达可能参与了衰老相关的生理变化，提示V-ATPase在调控卵巢功能及其衰老过程中发挥关键作用.

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基金资助

四川省自然科学基金项目(2025ZNSFSC0170)

西南民族大学研究生创新科研项目(YCZD2024045)