苦荞麦总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性评价

Optimization of tartary buckwheat flavonoid extraction process and evaluation of antioxidant activity

摘要

为优化苦荞麦总黄酮提取工艺，基于响应面分析法优化超声辅助复合酶提取方法，以3组平行试验验证工艺有效性，借助DPPH与ABTS⁺·自由基清除率实验评价粗提与纯化样品的抗氧化活性.响应面优化确定最佳工艺为：纤维素酶与果胶酶比例1∶1，超声功率400 W，提取温度42 ℃，液料比25 mL/g，时间40 min，在此条件下总黄酮提取率达9.42%.采用6种不同类型大孔树脂对苦荞粗提液进行分离纯化并对比吸附率，其中HPD-100树脂吸附率最高，提取纯度为（78.08±2.6）%.抗氧化实验结果显示，在黄酮浓度相同的情况下，纯化样品的自由基清除率明显高于粗提物（P<0.05）.实验结果表明苦荞麦总黄酮工艺优化有效，黄酮抗氧化活性良好.

Abstract

To optimize the extraction process of total flavonoids from tartary buckwheat， ultrasonic-assisted compound enzyme extraction was optimized based on response surface methodology in this study. The effectiveness of the process was verified by three groups of parallel experiments. The antioxidant activities of crude and purified samples were evaluated through DPPH and ABTS⁺· free radical scavenging rate experiments.The optimal process was determined via response surface optimization as follows： cellulase-to-pectinase ratio of 1∶1， ultrasonic output power of 400 W， extraction temperature set at 42 ℃， liquid-to-solid ratio controlled at 25 mL/g， and extraction time maintained for 40 min. Under these conditions， the total flavonoid extraction rate reached 9.42%.Six different types of macroporous resins were used for separation and purification of the tartary buckwheat crude extract. Their adsorption rates were compared. Among them， HPD-100 resin showed the highest adsorption rate， and the purity of the extracted product was （78.08±2.6）%.Results of antioxidant experiments indicated that at the same flavonoid concentration， the purified sample exhibited a significantly higher free radical scavenging rate compared to the crude extract （P<0.05）. This scavenging effect was similar to that of Vc.In conclusion， the optimized process was effective， and the flavonoids exhibited good antioxidant activity.​

Graphical abstract

关键词

苦荞麦 / 总黄酮 / 超声波 / 复合酶 / 提取工艺 / 抗氧化活性

Key words

buckwheat / total flavonoids / ultrasonic waves / complex enzymes / extraction process / antioxidant activity

苦荞麦（Fagopyrum tataricum L.Gaertn）广泛种植于高海拔地区以及偏远、寒冷地区，是一种药食同源类型的杂粮植物^［1-2］.黄酮类化合物是苦荞具有许多功能活性的物质基础之一，此类化合物在结构上具有丰富性，在生物活性方面展现出多方面的潜力^［3-4］，已经成为当前天然药物开发与研究的前沿领域.黄酮类化合物不仅赋予苦荞抗氧化能力，还通过调节脂质代谢、抑制炎症因子释放、改善胰岛素敏感性等机制发挥作用^［5-9］.这些功能使黄酮类化合物在预防慢性疾病、开发功能性食品和天然药物方面具有重要价值^［10］.

传统的黄酮类化合物提取方法例如溶剂提取法和热回流法等，存在效率低下、耗时长、溶剂用量大且成本较高等问题，极大地限制了黄酮的提取率^［11］.超声辅助提取法利用超声波技术通过空化效应加速细胞破碎，从而缩短提取时间并降低能源消耗^［12］，耿敬章^［13］利用超声辅助提取法提取苦荞黄酮，提取率为2.96%；魏增云等^［14］采用超声辅助提取苦荞壳总黄酮，提取率为2.02%.近年来，将超声与其他方法联用提取黄酮类化合物的方法越来越常见.复合酶提取法技术则利用酶的特异性，高效降解细胞壁中的纤维素等成分，释放活性物质，提升提取效率^［15］.超声辅助复合酶法结合超声波的空化作用与酶的专一性有效破坏苦荞麦细胞组织细胞壁，促使纤维素酶与果胶酶进入细胞内部来分解破坏细胞间质，使细胞内活性成分更容易溶解扩散，通过二者协同有效提高苦荞麦黄酮的提取效率.刘媛洁等^［16］利用超声辅助复合酶法在纤维素酶：果胶酶为3∶2时提取柚子皮中的总黄酮，最佳工艺条件下提取率可达2.19%，相比于使用超声辅助提取法提取柚子皮黄酮提取率提高了2.51倍.王娟科等^［17］利用超声辅助复合酶法提取益智果黄酮工艺，在纤维素酶与果胶酶配比为2∶1时提取率达到了1.2%，与单一乙醇提取法相比提高了23.9%.以上学者研究表明了超声辅助复合酶法相比于其他方法具有较高提取率与较短提取时间的潜在优势，此外该方法以水作为溶剂进行提取在酶解过程中无能耗且无需添加有机溶剂，可完全做到绿色环保、无毒无害.

目前针对苦荞黄酮提取的超声波与复合酶之间协同机制的研究相对较少.因此，该研究通过单因素实验与响应面实验优化超声辅助复合酶法提取苦荞麦总黄酮的最佳工艺.通过筛选最优大孔树脂纯化粗提物，并对苦荞麦黄酮纯化物抗氧化活性进行探究，为苦荞麦的资源开发以及新型天然抗氧化剂的研发提供数据参考.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

苦荞麦产于四川省凉山彝族自治州；大孔树脂均购自安徽三星树脂有限公司；所有用于分离、提取、纯化的试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

PL-30型电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；UV-1800 PC型紫外分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司；SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-1650型冷冻离心机购自四川蜀科仪器有限公司；D-37520型真空冷冻干燥机购自常州国华仪器制造有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 苦荞麦的预处理与溶液的配制

将苦荞麦放入105 ℃烘箱烘干过夜，取出适量烘干后的苦荞麦，进行粉碎处理并过80目筛.完成筛分后，将粉末装入自封袋中，4 ℃储存备用.分别称取6.675 g的AlCl₃与49.07 g的CH₃COOK溶解并定容至500 mL用于总黄酮的测定.

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

参考李欣等^［18］的方法并进行改进，称取芦丁标准品22.4 mg溶解后定容至100 mL.准确量取0 、0.5 、1、1.5 、2、2.5 、3、3.5 mL的芦丁标准品溶液，分别倒入8支容量为10 mL的比色管中.将2 mL的AlCl₃溶液以及3 mL的CH₃COOK溶液逐一添加至各比色管中，采用30%乙醇定容至10 mL，摇匀并静置30 min，于470 nm测定吸光度.以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，如图1所示，采用最小二乘法得到回归方程为y=0.1671x-0.0129，R²=0.999 2.

1.3.3 苦荞麦总黄酮的提取及总黄酮含量测定

参考张润红等^［19］的方法并加以改进，准确称取苦荞麦粉末1.0 g、复合酶共计0.06 g于100 mL烧杯中，调节pH值至5.0左右.在不同的单因素条件下，采用水提取法对苦荞麦总黄酮进行提取，冷却至室温后，以每分钟8 000 r转速离心10 min，参考1.3.2中的方法取3 mL上清液，并依据公式（1）得到提取率E.

E(\mathrm{\%})=(\frac{C\times V_{\mathrm{2}}}{V_{\mathrm{1}}\times m\times \mathrm{1000}})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}，（1）

式中：

C——利用超声辅助复合酶法从苦荞麦中提取到的总黄酮的质量浓度，mg/mL

V₁ ——测定所需样品的提取液的体积，mL

V₂ ——样品提取液的总体积，mL

m——苦荞麦样品与加入的复合酶的总重量，g

E——超声辅助复合酶法提取苦荞麦总黄酮提取率，%.

1.3.4 单因素实验设计

在控制pH值等常量不变的基础上，探究不同的酶配比（纤维素酶：果胶酶为3∶1、2∶1、1∶1、0∶0、1∶2、1∶3）；提取温度（30 ℃~80 ℃，每个梯度间隔10 ℃）；液料比（15~40 mL/g，每个梯度间隔5 mL/g）；提取时间（20~70 min，每个梯度间隔10 min）；超声功率（100~600 W，每个梯度间隔100 W）对苦荞总黄酮提取率的影响.

1.3.5 响应面实验设计

控制酶配比与超声功率因素为最佳值的情况下，利用Design-Expert 13软件响应面优化，实验因素表如表1所示.

1.3.6 苦荞麦总黄酮抗氧化活性探究

（1） 大孔树脂的筛选与苦荞麦总黄酮粗提物的纯化

参考晏俊玲等^［20］的实验方法并稍作修改，按照最佳工艺条件提取黄酮，使用不同类型大孔吸附树脂对苦荞麦黄酮粗提液进行分离纯化，实验所用6种大孔树脂型号与物理性能如表2所示.

具体方法如下：首先对树脂进行预处理，随后将树脂湿法装于层析柱中，苦荞粗黄酮上样质量浓度约为（1.51±0.07）mg/mL，上样流速设置为40，上样量4 BV（1 BV=30 mL），收集纯化的液体.苦荞粗黄酮提取液经大孔吸附树脂纯化后除去乙醇溶剂，冷冻干燥48 h后可获得苦荞总黄酮纯品.取20 mg纯品粉末加入5 mL甲醇充分溶解，参考1.3.2中的方法，依据公式（2）计算苦荞总黄酮纯度.

\mathrm{纯度}(\mathrm{\%})=(\frac{C\times V}{m})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}，（2）

式中：

C——样品溶液中总黄酮的质量浓度，mg/mL

V——定容体积，mL

m——冷冻干燥后样品粉末质量，mg.

（2） DPPH自由基与ABTS⁺·的清除作用

参考杨永涛^［21］的实验方法并加以改进，制备质量浓度为0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1.0、1.2 mg/mL的粗黄酮提取物样品溶液、纯化物样品溶液与维生素C溶液.分别量取2 mL样品与2 mL 3×10^-4 mol/L DPPH自由基溶液于比色管中，摇匀后静置30 min左右，在517 nm处测定吸光度，并将该吸光度值记作A₀.

分别准确量取无水乙醇与DPPH自由基溶液各2 mL；无水乙醇与样品溶液各2 mL于两个比色管中摇匀混合，在517 nm处测定吸光度记为A（无水乙醇为A₁、DPPH为A₂）.以Vc溶液作为对照，根据公式（3）计算清除率Y.

Y(\mathrm{\%})=[\mathrm{1}-\frac{(A_{\mathrm{0}}-A)}{m}]\times \mathrm{100}\mathrm{\%}，（3）

式中：

A₀ ——DPPH自由基与样品发生化学反应后测定的吸光度

A——样品或DPPH自由基的吸光度

Y——DPPH自由基清除率，%.

另取20 mL 7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L K₂S₂O₈溶液，混合均匀，避光静置12 h.在734 nm处测量吸光度并添加无水乙醇调零（吸光度为0.7左右），得到ABTS工作溶液.

取一比色管并加入4 mL ABTS工作溶液，随后向其中加入0.4 mL样品并充分混合，静置5 min.调零后，在734 nm处测定吸光度，记为B₁；另取一个比色管加入0.4 mL蒸馏水，重复上述操作测得吸光度B₀.以Vc溶液作为对照，根据公式（4）计算清除率Z.

Z(\mathrm{\%})=(\mathrm{1}-\frac{B_{\mathrm{1}}}{B_{\mathrm{0}}})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}，（4）

式中：

B₀ ——ABTS工作溶液与无水乙醇发生反应后测定的吸光度

B₁ ——ABTS工作溶液与样品溶液发生反应后测定的吸光度

Z——ABTS⁺·自由基清除率，%.

1.4 数据处理

使用Origin 2022软件绘制散点图与点线图，利用SPSS软件进行显著性分析与IC₅₀值的计算，通过Design-Expert 13软件进行响应面分析确定超声波复合酶法提取苦荞麦黄酮的最优条件.

IC₅₀值计算：利用SPSS对0.2~1.2 mg/mL的数据回归拟合，取清除率为50%的浓度.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 复合酶配比的确定

如图2所示，当复合酶配比为1∶1时，苦荞麦总黄酮提取率最高，为8.17%.当酶配比为2∶1与3∶1时的苦荞麦总黄酮提取率显著高于酶配比为1∶2与1∶3时的提取率，这可能是因为纤维素酶对苦荞麦细胞壁的破壁效率高于果胶酶，因此纤维素酶含量占比较大的样品其苦荞麦总黄酮提取率优于果胶酶的样品^［22］.同时，添加复合酶后的苦荞麦样品总黄酮的提取率明显高于未添加复合酶的样品，这可能与苦荞麦的细胞壁组成以及两种酶复配后酶活力相互作用有关，两种酶在1∶1比例复配后对苦荞麦细胞壁组织的破坏力最强，对苦荞麦总黄酮的溶出影响最大^［23］，这与张润红等^［19］得到的结论一致，综上所述，最佳复合酶配比应选取1∶1.

2.1.2 提取温度的确定

如图3所示，提取率随着温度升高先上升后下降.在30 ℃到40 ℃之间，苦荞麦总黄酮的提取率持续增加，从8.92%上升至9.55%.在40 ℃时达到复合酶酶解的最适温度，提取率达到峰值.继续升高温度，复合酶由于温度过高使得酶活性失活影响提取效率，提取率显著下降（P<0.05），从9.55%下降至6.71%.这是因为温度过高易对黄酮分子结构造成破坏，进而加速其分解进程^［24］，且高温环境会对纤维素酶与果胶酶的活性产生不良影响，严重时可导致酶失活^［25］.此外，当温度过高时，超声过程中产生的气泡内部压力会增大.在气泡闭合瞬间，由于压力增大会增强缓冲效应，进而使空化作用的效果减弱.由于空化作用的减弱，总黄酮的提取效率降低，总黄酮的得率也随之下降^［26］，综上，选择30 ℃ 、40 ℃、50 ℃ 3个参数进行响应面实验.

2.1.3 提取时间的确定

如图4所示，提取率随着时间延长先上升后下降，当提取时间为40 min时提取率最高为9.54%.提取时间过短会由于酶解反应不完全导致苦荞麦总黄酮未完全溶出；提取时间过长由于酶的活性会逐渐降低，进而影响黄酮的析出效率.此外色素等杂质的大幅度溶解导致总黄酮提取率较低.因此选择30、40、50 min进行响应面实验.

2.1.4 液料比的确定

如图5所示，当液料比在15∶1~25∶1时，苦荞麦总黄酮提取率随着液料比的增加显著增大（P<0.05），由1.43%上升到8.66%.随后继续增加，提取率逐渐减小，由8.66%下降到6.34%.这可能是由于随着液料比的增大促使两种酶与底物苦荞麦总黄酮的质量浓度降低，酶解速率下降使得提取率减小.王广慧等^［27］使用超声辅助醇提法提取杏鲍菇总黄酮，液料比单因素曲线所呈现出的趋势与该实验得出的结果相似，此外孙亚利等^［28］利用超声辅助醇提法提取苦荞黄酮同样得出相同的趋势，且最佳液料比为30∶1与本实验相似.液料比过大可能会在酶的催化作用下促使样品溶液中其他可溶性物质的溶出，干扰实验结果^［29］.因此，应选择20∶1、25∶1、30∶1进行响应面实验.

2.1.5 超声功率的确定

如图6所示，超声波通过高频振动产生空化气泡，释放的机械能可破坏细胞壁结构，促进黄酮释放.苦荞麦总黄酮的提取率随着超声功率的增加呈现出先增大后减小的趋势.超声功率过低不利于苦荞麦细胞的解体，黄酮较难析出.继续增大超声功率超声波对细胞破碎作用增强，有利于黄酮的提取^［30］，功率稳定在400 W时，提取率最高为9.33%.功率过高会破坏黄酮结构，导致提取率较低，这与薛天乐等^［31］得出的曲线趋势相似.故最佳超声功率应选择400 W.

2.2 响应面试验结果

在控制其他变量于最优状态的前提下，依据单变量实验所得数据，针对3个对苦荞麦黄酮提取率影响显著的因素采用三因素三水平的响应面设计，进一步的优化苦荞麦总黄酮的提取工艺，实验结果如表3所示.拟合分析可得线性回归方程为：E=9.27-0.28A+0.52B+0.055C+1.16AB-0.01AC-0.225BC-1.44A²-1.57B²-1.31C²

方差分析数据如表4所示，P<0.001表明该回归模型极显著；模型失拟项的P=0.533 6>0.05，表明失拟项不显著；决定系数R²=0.998 3，模型具备统计学意义.通过P值可知液料比与提取温度影响极为显著（P<0.01），根据F值可知影响程度为提取温度（B）>液料比（A）>提取时间（C）.

不同影响因素之间的交互作用对总黄酮提取率的影响如下图所示，在两种因素的交互作用下总黄酮提取率均呈现出抛物面分布，若保持其中一种因素恒定不变，提取率随着另一种因素的增加呈现出先升高再降低的趋势.

如图7与图9所示，等高线呈现出椭圆形态，说明两种因素之间的相互作用对于黄酮提取率具有显著的促进作用（P<0.05）；而图8中等高线大致呈圆形分布，表明两种因素的交互对提取率的影响不显著（P>0.05）.图7中在液料比方向上，等高线呈现趋近态势，同时，液料比所形成的曲面波动较为剧烈，由此可推断，液料比对苦荞麦总黄酮提取效率的影响权重高于提取温度的作用.同理可得，图9中提取温度对苦荞麦总黄酮提取率的影响程度大于提取时间.综上所述，图7~图9可得到三种因素的最佳工艺组合分别为液料比24∶1~26∶1、提取温度35 ℃~40 ℃、提取时间为35~40 min.

综合响应曲面分析的结果加以分析确定了利用超声辅助复合酶法提取苦荞麦总黄酮的最优工艺条件：液料比为24.815∶1，提取温度控制在41.507 ℃，以及提取时间设定为40.079 min.在此工艺条件下，苦荞麦的总黄酮提取率预计将达到9.317%.结合实际的可行性确定使最优工艺条件为：液料比为25∶1，提取温度控制在42 ℃，以及提取时间设定为40 min.在此条件下进行3组平行实验，结果显示苦荞麦中总黄酮的提取率为9.42%.

闫斐艳^［32］等比较不同提取方法发现超声辅助复合酶法在60 ℃下仅需30~40 min即可完成提取，且能耗低于微波法.李静舒^［33］比较使用热水提取法与乙醇提取法在80 ℃提取5 h的提取率分别为0.3%、1.3%左右，耗时长且效率低；使用超声波辅助提取法超声80 min，提取率为1.5%左右；使用微波辅助提取法在360 W、5 min下提取率达到2%左右，虽然时间较短但能耗较高.张英强等^［34］利用超声提取法对苦荞黄酮提取工艺进行正交优化，在85 ℃提取2 h，最终提取率为3.85%.综上，超声辅助复合酶法利用水作为溶剂进行提取做到了零有机溶剂添加，且耗时较短，提取率相对较高.以上证明了响应面法来优化超声辅助复合酶法用于苦荞麦黄酮提取的可行性.

2.3 大孔树脂的筛选

从图10中可以看出，不同型号树脂对苦荞麦总黄酮的吸附率从高到低依次为：HPD-100>AB-8>X-5>S-8>NKA-9>D101.其中，HPD-100型树脂在苦荞麦总黄酮的吸附上优势明显，不仅吸附率超过其他5种树脂，经其纯化后的产物纯度达到了78.08%.在影响树脂吸附能力的各项参数中，比表面积是最为核心的一项，通常情况下，树脂的比表面积与吸附容量呈正相关，由表2可知HPD-100型树脂的比表面积显著高于其他5种，这为其高效吸附苦荞麦总黄酮提供了结构上的支撑.另外，树脂孔径的选择需要与目标化合物的分子尺寸相适配.由于黄酮类化合物的分子质量较小，因此更适合采用孔径相对较小的大孔吸附树脂.在本次实验选用的6种树脂中HPD-100型树脂的孔径最小，能够实现对苦荞总黄酮的有效分离.

2.4 抗氧化活性研究结果

如图11所示，对不同质量浓度的Vc、苦荞粗提物及纯化物开展DPPH自由基清除率实验.在0.2~1.2 mg/mL的范围内，Vc、粗提物和纯化物随样品质量浓度增加，DPPH的清除能力均上升.当质量浓度为1.2 mg/mL时，粗提物样品与纯化物样品的DPPH清除率达到峰值，分别为61.21%和93.33%.其中，纯化物在该质量浓度下的清除率（93.33%）与Vc（92.92%）较为接近，显著高于粗提物的清除效果（P<0.05）.粗提物与纯化物的IC₅₀值分别为0.622 和0.199 mg/mL.

如图12所示，在0.2~1.2 mg/mL的范围内，ABTS⁺·的清除能力都随着Vc、苦荞粗提物和纯化物的质量浓度而逐渐增加，且当质量浓度为1.2 mg/mL时达到峰值，分别为粗提物达到了72.21%，纯化物达到了91.69%.其中，纯化物在该质量浓度下的清除率（91.69%）与Vc（98.97%）较为接近（P<0.05），粗提物与纯化物的IC₅₀值分别为0.299 mg/mL和0.094 mg/mL.

通过对上述两种自由基清除效果的综合分析可知苦荞麦中的黄酮类化合物抗氧化性显著，3种样品对DPPH自由基的清除能力排序为Vc≈纯化物>粗提物.粗提物与纯化物自由基清除能力差异较大，这可能是由于杂质含量多导致的粗提物中黄酮纯度较低.苦荞麦粗提物中含有大量极性大分子物质如蛋白质、多糖等；此外还含有小分子亲水性物质如游离酚酸、有机酸等，这些杂质不仅会影响提取物的稳定性，而且会使提取到的黄酮类物质无法充分发挥抗氧化功效.大孔树脂吸附纯化技术通过物理吸附与分子筛分作用可有效去除杂质，显著提升黄酮类化合物的纯度与生物活性，进而提升自由基清除效率^［35-36］.此外，粗提物与纯化物清除率之间的差异也可能与不同纯度的黄酮类化合物在反应过程中参与化学反应的成分含量与生物活性，以及两类自由基的反应机理及反应条件存在关联.此外，苦荞麦黄酮纯化物的抗氧化能力与Vc基本相当，表明苦荞麦黄酮具备替代Vc开发天然抗氧化剂的潜力，其抗氧化的潜在机制可能与其通过螯合金属离子，清除具有强氧化性的自由基^［37］，中断链式氧化反应^［38］，去除羰基化合物^［39］，从而有效抑制氧化过程的发生与发展相关.

3 结论

该实验通过单因素实验与响应面实验确定了超声辅助复合酶法提取苦荞麦总黄酮的最优工艺为：纤维素酶：果胶酶为1∶1、提取温度42 ℃、提取时间40 min、液料比25∶1，超声功率400 W，提取率为9.42%；对粗提物利用最佳吸附性能的HPD-100型树脂进行纯化，纯度达到了78.08%；通过对粗提物与纯化物进行抗氧化实验显示相同黄酮浓度下纯化物的两种自由基清除率显著高于粗提物（P<0.05），且黄酮浓度为1.2 mg/mL时自由基清除率最高，与Vc的清除率差异较小.综上所述，超声辅助复合酶法凭借绿色环保等优势，且提取物纯化后具有良好抗氧化性能，为苦荞麦的资源开发以及新型天然抗氧化剂的研发提供提供了可行路径.

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基金资助

西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金资助(ZYN2023036)