C/ebpα和C/ebpβ基因在小鼠卵巢及颗粒细胞中的表达定位研究

Expression and localization pattern of C/ebpα and C/ebpβ genes in mouse ovaries and granulosa cells

摘要

卵巢是哺乳动物重要的生殖器官，深入探究调控生殖的关键基因对动物繁殖育种有重要的意义.试验以雌性小鼠为试验对象，旨在探讨C/EBPα/β在小鼠卵巢和颗粒细胞中的表达及定位.采集8~9周龄雌性小鼠的心、肝、脾、肺，肾、卵巢、输卵管、子宫、脂肪、肌肉的组织样品，通过qPCR技术检测C/ebpα/β在不同组织中的表达量，发现C/ebpα/β在雌性小鼠各个组织中广泛表达，C/ebpα在肝中表达量最高.通过免疫组织化学染色，鉴定C/EBPα/β在卵巢中的定位，显示C/EBPα/β均在小鼠卵巢卵泡颗粒细胞中存在表达.分离培养4~5周龄小鼠卵巢颗粒细胞，免疫荧光染色，发现两种蛋白定位在颗粒细胞的细胞核中，进一步检测C/ebpα/β在体外培养颗粒细胞12、24、36、48、72 h的表达，发现两种基因表达量趋于稳定，没有显著差异.以上研究结果可为进一步探究C/ebpα/β在卵巢中的功能机制提供基础数据.

Abstract

The ovary is an important reproductive organ in mammals. In-depth exploration of key genes regulating reproduction is of great significance for animal breeding. In this experiment， female mice were used as the experimental subjects to investigate the expression and localization of C/EBPα/β in the ovaries and granulosa cells. Tissue samples of the heart， liver， spleen， lung， kidney， ovary， fallopian tube， uterus， fat， and muscle of 8-9 week old female mice were collected. The expression levels of C/ebpα/β in different tissues were detected by qPCR technology. It was found that C/ebpα/β were widely expressed in various tissues of female mice， with the highest expression level of C/ebpα in the liver. Immunohistochemically staining was used to identify the localization of C/EBPα/β in the ovary， and it was found that both proteins were expressed in granulosa cells of mouse ovarian follicles. Granulosa cells of 4-5 week old mice ovaries were isolated and cultured. It was found that both proteins were expressed in the nuclei of granulosa cells by immunofluorescence staining. Next， the expression of C/ebpα/β were assayed in granulosa cells cultured in vitro for 12， 24， 36， 48， and 72 h， it was found that the expression levels of the two genes tended to be stable and there was no significant difference during this period. The above results provided basic data for further exploration of the functional mechanism of C/ebpα/β in the ovary.

Graphical abstract

关键词

C/ebpα / C/ebpβ / 卵巢 / 颗粒细胞

Key words

C/ebpα / C/ebpβ / ovary / granulosa cells

卵巢是调控卵母细胞成熟的重要场所，哺乳动物从出生到发情期，卵巢发生持续生长、分化过程，性成熟后卵巢发生周期性排卵^［1］.卵泡是卵巢的结构和功能单位，主要功能是产生生殖细胞以及分泌类固醇激素，卵巢内卵泡的数目和发育状态是反映卵巢内分泌功能和生殖能力的重要标志^［2］.卵巢颗粒细胞是组成卵泡的重要体细胞，主要参与调控卵泡生长发育繁殖、类固醇激素生成等重要生理过程^［3］.研究表明，颗粒细胞能为卵母细胞生长提供特异性因子，且能调节生长中卵母细胞的特异性蛋白合成水平和蛋白质的磷酸化^［4］.增强子结合蛋白（CCAAT/Enhancer binding protein alpha，C/EBPα）因其与启动子CCAAT区及多种病毒增强子相结合而命名，目前已发现6种CEBP家族成员^［5］，其中C/EBPα是碱性亮氨酸拉链蛋白家族中的一个亚家族中最早被发现的成员^［6］.早期研究表明，C/EBPα基因在骨髓组织细胞分化和机体免疫等过程中发挥重要作用^［7］.增强子结合蛋白β（CCAAT/Enhancer binding protein beta，C/EBPβ）是多种细胞、组织增殖和分化的关键调节因子，在大多数组织中表达.C/EBPα和C/EBPβ是排卵前黄体生成素（LH）峰诱导的转录因子，对成功排卵和颗粒细胞黄体化至关重要，在颗粒细胞中完全敲除C/EBPα和C/EBPβ会导致完全不排卵，而在排卵前晚期阶段选择性缺失C/EBPα或C/EBPβ会导致排卵率降低，表明C/EBPα和C/EBPβ在整个排卵前阶段持续表达才能促使成功排卵^［8］.然而，截至目前的研究多聚焦于基因缺失后的整体表型，对于C/EBPα/β在不同阶段卵泡和黄体中的表达水平及定位尚不清楚，在不同培养时间的卵巢颗粒细胞中的时空表达模式也尚未明确，这种基础表达谱的缺失，一定程度上限制了对二者后续分子机制的分析.因此，本实验旨在填补相关基础信息的空白，通过分析C/ebpα/β在雌性小鼠不同组织以及生殖性腺中的表达情况，进一步确定C/ebpα/β在小鼠卵巢和颗粒细胞中的定位特征及组织特异性、时序变化的表达模式，为C/ebpα/β在雌性动物卵巢中的时空表达模式及对不同阶段卵泡和黄体的研究提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验选用C57BL/6雌性小鼠作为试验对象，小鼠为无特定病原体（SPF）级，购自成都达硕实验动物有限公司.饲养环境保持在23 ℃~26 ℃，保证12 h光照与12 h黑夜交替的环境，保证小鼠可以自由进食、饮水.饲养全程每日通风换气，保证鼠房干净，降低外界因素的干扰.

1.2 颗粒细胞的分离培养

选取3只4~5周龄雌性小鼠，腹腔注射8 IU孕马血清激素（PMSG），促进卵泡发育，便于后续卵巢颗粒细胞分离.46~48 h后颈椎脱臼法处死，通过手术法获取卵巢，将卵巢置于含有37 ℃预平衡好的PBS的35 mm培养皿中，用PBS清洗3次，转入含有操作液的35 mm的培养皿中.用1 mL的注射器针头刺破卵巢上卵泡，使得颗粒细胞释放出来，加入完全培养液：10%FBS（35-179-CV，CORNING），1%青霉素-链霉素（BL505A，biosharp）和89%DMEM/F12（A4192002，GIBCO），重悬，之后按照5×10⁵/mL细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔接种2 mL，混匀，放置在5%CO₂、37 ℃培养箱中培养12、24、36、48和72 h后，观察细胞贴壁生长情况.

1.3 qPCR技术

随机选取6只8~9周龄卵泡期雌性小鼠，采集其心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、卵巢、子宫、输卵管等组织置于2 mL离心管中，快速放置于液氮溶液中，随后置于实验室-80 °C低温保存.取50~100 mg的各个组织和不同时间段收集的6孔板培养的颗粒细胞，使用Trizol试剂法（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）提取总RNA，并参照江苏南京诺威赞生物科技有限公司（Vazyme Biotech Co.， Ltd）HiScript IQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆转录试剂盒（货号：R233-01）标准操作流程反转录为cDNA.每个反应使用100 ng cDNA为模板，采用2× SYBR Green qPCR Mixture试剂混匀加样后，设置荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，该循环温度及时间适用于本实验所有片段扩增.以Gapdh为内参，采用2 ^{- ΔΔCt} 法计算基因表达量，引物序列见表1，引物由成都擎科生物技术有限公司合成.所有引物在使用前均通过常规PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，确保为单一条带；并通过qPCR溶解曲线分析确认产物单一峰，表明引物特异性良好.

1.4 苏木精和曙红（H&E）染色

取小鼠卵巢组织，对样品进行制片、固定和H＆E染色.H＆E染色过程按照苏木精曙红（H&E）染色试剂盒（Cat.No.G1120，北京太阳能生物科技有限公司，北京，中国）标准操作.树脂封片后使用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM 900，德国）拍摄图像.

1.5 免疫组织化学染色

将小鼠卵巢固定在4%多聚甲醛中48 h，随后对样品进行脱水、石蜡包埋和切片.将切片依次放入梯度二甲苯和酒精，最后进入蒸馏水进行脱蜡和水化.将清洗好的切片进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶/碱性磷酸酶后，用3%BSA室温封闭45 min，与用PBS稀释的C/EBPα一抗（ab32358，abcam，英国，1∶200）、C/EBPβ一抗（ab32358，abcam，英国，1∶200）共孵育，4 ℃过夜.洗去未结合的一抗，用PBS洗涤3次，每次5 min，然后与HRP标记的羊抗鼠二抗（31430，Thermo Fisher，美国，1∶1 000）共孵育，室温50 min，用DAB显色3~5 min后，用流水冲洗，终止染色.再用苏木素复染和苏木素返蓝液，中性树脂封片后，用荧光显微镜（Zeiss，德国）拍摄图像.

1.6 免疫荧光技术

将培养24 h的24孔板中的颗粒细胞吸去培养基，PBS清洗后，加入4%多聚甲醛，固定20 min，随后依次加入100 mM 甘氨酸溶液和封闭液，清洗后加入FSHR一抗（1∶200）或C/EBPα/β一抗（1∶200）孵育，4 ℃过夜之后，清洗掉未结合的一抗，加入羊抗兔二抗（Thermo Fisher）（1∶1 000），同时加入DAPI溶液，37 ℃孵育45 min，孵育后清洗，用荧光显微镜（Zeiss，德国）拍摄图像.

1.7 数据统计分析

应用GraphPad Prism 8 分析软件中的 ANOVA 程序进行单因素方差分析，组间差异用Tukey法进行多重比较，最终结果以平均值（Mean）±标准误（SEM）表示.组织表达结果以C/ebpα在心脏中的表达水平为参照，时序表达结果以C/ebpα在12 h培养时间的表达水平为参照.每项试验至少3次重复，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著.

2 结果与分析

2.1 C/ebpα/β基因在小鼠不同组织的表达模式

以C57BL/6雌性小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、卵巢、子宫、输卵管cDNA为模板，Gapdh基因为内参，通过实时荧光定量PCR技术检测C/ebpα和C/ebpβ基因在小鼠不同组织中的mRNA表达水平.结果表明，C/ebpα基因在小鼠各个组织中均有表达，其在肝脏中表达极显著（P<0.01）；C/ebpβ基因在小鼠各个组织中广泛表达，差异不显著（P>0.05）（图1）.

2.2 C/EBPα/β蛋白在小鼠卵巢中的定位

8至9周龄黄体期雌性小鼠卵巢（图2-A）皮质上存在大量卵泡和黄体，类型分别为原始卵泡（图2-B）、初级卵泡（图2-C）、次级卵泡（图2-D）、成熟卵泡（图2-E）和黄体（图2-F）.其中，原始卵泡数量最多、分布最广.随后利用免疫组化检测C/EBPα/β在卵巢中的定位及表达.结果表明在不同发育阶段的卵泡中均有C/EBPα和C/EBPβ蛋白表达，主要表达在卵泡中的颗粒细胞中，卵母细胞中未见表达（图2-G、H）.C/EBPα和C/EBPβ蛋白在卵巢颗粒细胞和黄体细胞中均有表达且表达在细胞核中，同时也在卵巢周围脂肪组织（图2-G、H）存在表达.

2.3 小鼠颗粒细胞的分离鉴定及培养结果

从小鼠卵巢组织中分离得到的颗粒细胞进行体外培养，观察细胞形态的变化.12 h小鼠颗粒细胞贴壁后，部分细胞可见明显的胞体延伸，形成长短不一的树突状或星状突起，胞体呈梭形或多角形（图3-A）；24 h颗粒细胞开始增殖变多（图3-B），36 h小鼠颗粒细胞形态发生变化，细胞开始出现接触抑制，此时细胞密度达到80%∽90%（图3-C）；48 h时细胞长满整个培养皿，接触抑制，部分细胞由于代谢失衡，开始出现死亡（图3-D）；分化72 h时死亡细胞数逐渐增多（图3-E）.结果表明体外培养颗粒细胞状态良好，可以进行后续实验.

选择时序24 h的卵巢颗粒细胞进行鉴定.通过免疫荧光染色技术，对颗粒细胞进行特异性抗体FSHR标记.发现FSHR表达在卵巢颗粒细胞的细胞质中（图3-F），并且显示FSHR阳性染色率达到95%以上，说明颗粒细胞纯度高，表明成功分离到了卵巢颗粒细胞.

2.4 C/ebpα和C/ebpβ在培养不同时间的卵泡颗粒细胞中的表达情况

C/ebpα和C/ebpβ基因在小鼠卵巢颗粒细胞分化中的表达情况的时序表达谱.结果显示，在体外培养到24 h时，C/ebpα基因表达量上升，但无显著差异（P>0.05）；在72 h时，C/ebpβ基因表达量上升，但也无显著差异（P>0.05）（图4），表明C/ebpα/β在体外培养过程中表达趋于稳定.

2.5 C/EBPα/β蛋白在小鼠卵泡颗粒细胞中的定位

选择时序24 h的小鼠卵巢颗粒细胞进行定位.通过免疫荧光染色，发现C/EBPα和C/EBPβ蛋白均定位在卵巢颗粒细胞的细胞核中（图5）.

3 讨论

在哺乳动物卵巢中，卵泡发育始于原始卵泡.初情期后，每个发情周期都有一批原始卵泡被激活，经历一系列成长阶段最终发育为成熟卵泡并排卵.排卵后，卵泡壁的颗粒细胞迅速增殖并黄体化，形成黄体.黄体作为临时的内分泌腺体，是排卵后分泌孕激素和雌激素的主要来源^［9］.C/EBPα/β是转录因子家族的重要成员，在多种生理过程中发挥关键作用.本试验通过实时荧光定量PCR技术检测C/ebpα/β基因在小鼠10个不同组织中的表达的差异，发现在各个组织中均有广泛表达；其中C/ebpα在肝脏组织中表达最高；C/ebpβ在各个组织中表达无显著差异.C/ebpα在肝细胞中参与调控糖代谢平衡^［10］，与转录因子SPI1，FLI1等组合，参与诱导细胞分化^［11］.C/ebpβ可以参与脂质代谢，作为脂质生成因子，减弱其表达可以抑制其在分化细胞中的转录，减少肥胖相关的代谢紊乱^［12］.肝脏中C/EBPβ的激活可促进炎症因子释放，在库普弗细胞中，C/EBPβ上调VCAM1表达，驱动肝脏炎症^［13］.在脂肪组织中，其调控的促炎基因可能导致胰岛素抵抗^［14］.多囊卵巢综合征（PCOS）患者存在慢性低度炎症状态，且C反应蛋白（CRP）水平升高与代谢综合征（MetS）风险相关^［15］.因此，肝脏中C/EBPβ可能通过促进炎症因子释放从而加剧PCOS患者的代谢和生殖内分泌失调.C/ebpα/β基因在小鼠生殖相关组织中均有表达，表明二者在雌性生殖过程中可能会存在协同或互补的作用.C/ebpα在脂肪形成过程中，受到C/ebpβ的调控^［16］.在胃癌细胞中，C/ebpα调节cyclin D1表达和细胞周期^［17］.C/ebpβ在细胞分化早期被诱导，然后激活C/ebpα和PPARγ等下游因子^［18］，推测C/ebpα可能在卵巢中与C/ebpβ共同调控黄体化的过程.

本试验研究发现C/ebpα/β基因均在小鼠卵巢组织中存在表达，且通过蛋白定位发现C/EBPα/β在小鼠卵巢、黄体和不同时期的卵泡中均有表达，且定位在细胞核中.这个结果表明C/EBPα/β可能作为核转录因子参与卵泡发育和黄体生成，通过调控下游靶基因影响颗粒细胞的增殖和分化.核转位是生物大分子依赖核孔复合体、定位信号和运输蛋白进行的主动运输，通过调控分子的时空分布来控制基因表达与细胞功能.C/EBPβ的核转位受到其磷酸化水平的调控，与核纤层蛋白B1（Lamin B1）共同参与此过程^［19］.因此C/ebpα/β基因可能在调控卵泡发育及颗粒细胞黄体化过程中具有协同机制，调控下游靶基因网络，保证排卵和黄体形成过程的完整性.卵巢颗粒细胞是卵巢中表达FSHR的核心细胞^［20］，在时序24 h的小鼠卵巢颗粒细胞中进行鉴定，通过免疫荧光表达技术对颗粒细胞特异性抗体FSHR进行标记.发现FSHR表达在卵巢颗粒细胞的细胞质中，并且显示FSHR阳性染色率达到95%以上，表明本试验成功提取到了卵巢颗粒细胞.在体外培养过程中，24~36 h细胞生长迅速，在48 h后出现接触抑制，部分细胞死亡.不同培养时间节点的C/ebpα/β基因表达量整体没有显著差异，表明在体外培养条件下，C/ebpα/β仍然可以通过颗粒细胞内的机制调控来维持稳定的表达水平.

免疫荧光结果表明，C/EBPα/β均定位在颗粒细胞的细胞核中，有研究表明，C/EBPβ可以调控细胞自噬和凋亡，影响相关基因的表达水平^［21］.在鹅的卵泡颗粒细胞中，C/ebpα是促进OVR基因表达的关键转录因子，过表达C/ebpα和OVR显著刺激了培养基中的脂质向颗粒细胞细胞质的运输，表明其在卵巢脂质代谢中也可能发挥重要作用^［22］.C/EBPβ在原始卵泡形成过程中表达增加，敲低C/ebpβ会抑制其蛋白表达，导致原始卵泡形成受损，表明C/ebpβ是卵巢在胚胎形成原始卵泡过程的关键调控因子^［19］，而本研究中发现C/EBPβ在各个阶段的卵泡中均有表达，表明C/EBPβ可能在卵泡发育早期阶段就发挥作用.C/EBPβ通过提高靶基因启动子区域中H3K4me3水平，使染色质结构变得松散，增加颗粒细胞中Vegf基因的表达来支持颗粒细胞在排卵过程中的黄体化^［20］.通过基因检测，显示C/ebpα/β对排卵早期影响不大，但黄体化过程严重缺失，因此可以表明C/ebpα/β在小鼠卵泡发育排卵过程中起到重要的调控作用^［23］.C/ebpβ被证明是黄体形成过程的核心转录因子.其激活ERK通路，上调C/ebpβ表达，进而调控Cyp11a1的活性，促进孕酮的合成，调节颗粒细胞的黄体化.通过添加J14下调Srxn1会抑制C/ebpβ表达，并显著降低LH黄体化过程，造成脂滴减少，孕酮水平上升，导致黄体形成受阻^［24］.说明C/ebpβ是LH诱导颗粒细胞黄体化的下游效应分子.由于突变细胞中抑制了许多可能与血管发育相关的基因，因此C/ebpα/β似乎通过控制调节维持黄体细胞所需的广泛血管网络形成的基因来决定黄体生成过程^［8］.

本研究对小鼠体内C/ebpα/β的表达与定位进行了研究，意在对其表达图谱的绘制，但对其功能并未进行验证.未来可利用siRNA/shRNA在颗粒细胞中进行基因功能缺失/获得研究进一步验证C/ebpα/β在卵巢颗粒细胞中增殖分化及黄体化的机制，以及在猪、牛等雌性哺乳动物中的保守性研究等.

4 结论

C/ebpα/β基因在小鼠各个组织中广泛表达，且C/EBPα和C/EBPβ在卵巢颗粒细胞的细胞核中稳定表达，可能通过转录调控机制影响颗粒细胞的发育从而影响卵母细胞的成熟以及黄体的形成，表明C/ebpα/β可能在时空调节机制上对卵巢卵泡发育和黄体生成以及分泌激素具有联合调控作用.

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基金资助

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