牛磺酸对牦牛颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的影响

Effect of taurine on the proliferation， apoptosis and steroid hormone secretion of yak granulosa cells

摘要

旨在探究牛磺酸对牦牛颗粒细胞的增殖、凋亡以及类固醇激素分泌的影响.在体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞中添加不同浓度的牛磺酸，利用CCK-8法检测其对细胞活力的影响，筛选其最佳作用浓度；利用实时荧光定量PCR技术检测牛磺酸对细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成相关基因表达的影响；通过ELISA法分析牛磺酸对牦牛颗粒细胞类固醇激素分泌的影响.结果显示，牛磺酸能够有效促进细胞增殖，且250 μM为最佳作用浓度；该浓度下，牛磺酸可显著上调增殖相关基因PCNA、CCND1与CCNB1的表达水平（P<0.05），同时上调抗凋亡基因BCL2的表达（P<0.01），并下调促凋亡基因BAX和CASP3的表达（P<0.05）；相较于对照组，牛磺酸处理组中类固醇激素合成相关基因STAR、CYP11A1和HSD3B1的相对表达水平显著提高（P<0.05），雌二醇（Estradiol， E₂）含量显著下降（P<0.05），而孕酮（Progesterone， P₄）含量显著上升（P<0.05）.结果表明，牛磺酸添加在体外培养体系中可调节牦牛颗粒细胞的增殖、凋亡以及类固醇激素分泌.此结果为进一步研究牛磺酸对牦牛颗粒细胞的作用提供理论基础.

Abstract

This study aimed to investigate the effects of taurine （Tau） on the proliferation， apoptosis， and steroid hormone secretion of granulosa cells （GCs） in yaks. Yak ovarian granulosa cells were cultured in vitro and treated with various concentrations of taurine. The cell viability was assessed using the Cell Counting Kit-8 （CCK-8） assay to screen for the optimal concentration. Subsequently， the expression levels of genes related to proliferation （PCNA， CCND1， CCNB1）， apoptosis （BCL2， BAX， CASP3）， and steroidogenesis （STAR， CYP11A1， HSD3B1） were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The secretion of steroid hormones， estradiol （E₂） and progesterone （P₄）， was analyzed using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that taurine effectively promoted granulosa cell proliferation， with 250 μM identified as the optimal concentration. At this concentration， taurine significantly up-regulated the expression of proliferation-related genes PCNA， CCND1， and CCNB1 （P<0.05）. Concurrently， the expression of the anti-apoptotic gene BCL2 was up-regulated （P<0.05）， while the expressions of the pro-apoptotic genes BAX and CASP3 were down-regulated （P<0.05）. Furthermore， taurine treatment significantly increased the expression of steroidogenic genes STAR， CYP11A1， and HSD3B1 （P<0.05）. Compared with the control group， the secretion of estradiol （E₂） was significantly decreased， whereas that of progesterone （P₄） was significantly increased （P<0.05）. In conclusion， taurine regulated the proliferation， apoptosis， and steroid hormone secretion of yak granulosa cells， providing a theoretical basis for further research on its role in yak granulosa cells.

Graphical abstract

关键词

牛磺酸 / 牦牛 / 颗粒细胞 / 类固醇激素 / 凋亡

Key words

taurine / yak / granulosa cell / steroid hormone / apoptosis

牦牛（Bos grunniens）作为青藏高原特有的重要经济畜种，是当地牧民赖以生存的生产和生活资料，其繁殖性能直接影响高原牧区的生产效益与可持续发展，对高寒草原生态系统的稳定与区域经济发展具有不可替代的作用^［1］.胚胎体外生产（In Vitro Production， IVP）技术是现代加速良种扩繁、提升养殖效益的核心技术，是突破牦牛繁殖瓶颈、加速良种扩繁和遗传改良的关键手段^［2］.在卵巢中，颗粒细胞（Granulosa Cells， GCs）作为卵泡发育的核心功能细胞，不仅参与卵母细胞营养支持，还通过调控自身增殖与凋亡维持卵泡稳态，并主导雌激素（E₂）、孕酮（P₄）等类固醇激素的合成与分泌^［3-4］.然而，相较于普通黄牛，牦牛GCs的体外培养面临更大挑战，这主要源于其长期适应高原极端环境（如低氧、低温、强紫外线）所形成的独特生理机制.研究显示，牦牛GCs存在生长缓慢、贴壁效率低、传代后形态不稳定等问题^［5］；其低氧适应相关的分子特征（如HIF-1α高表达）导致细胞在常氧培养下易发生代谢紊乱与凋亡^［6］；同时，牦牛GCs的激素分泌调控机制特殊，对培养环境的变化（如氧浓度）极为敏感，E₂与P₄的分泌易出现波动或功能障碍.体外培养过程中，卵丘-卵母细胞复合体会因为氧化应激、营养供应不足、凋亡信号激活等一系列不利因素，导致颗粒细胞功能受损、凋亡率上升，并最终影响卵母细胞的核质成熟质量^［7-8］.因此，在基础培养体系中添加适宜的活性物质，模拟体内环境、缓解氧化应激、支持颗粒细胞等功能，已成为提高体外胚胎生产效率的重要策略^［9-11］.而牦牛GCs对此敏感性更高，因此，针对牦牛GCs的培养难点，在基础体系中添加能有效缓解氧化应激、模拟体内微环境并稳定细胞功能的活性物质，对建立高效的牦牛体外胚胎生产体系具有至关重要的意义.

牛磺酸（Taurine）是一种β-含硫氨基酸，在动物组织中广泛分布^［12-13］.它不仅参与渗透压调节、胆汁酸结合和抗氧化防御，近年研究发现其在哺乳动物生殖系统中也具有重要调控功能^［14-16］.研究表明，牛磺酸作为内源性抗氧化剂，可通过清除活性氧（ROS）、增强抗氧化酶活性（如SOD、GSH-Px），保护颗粒细胞免受氧化损伤，维持其正常生理功能^［17-18］.Chen FL研究发现，牛磺酸通过抑制猪卵巢颗粒瘤细胞中的氧化应激，防止硅纳米颗粒诱发的凋亡和炎症反应^［19］.在小鼠研究中，牛磺酸可通过促进血管生成、减轻氧化应激和凋亡，显著改善移植卵巢的卵泡存活和功能^［20］. Zhang FL则发现，牛磺酸可通过TBK1相关的线粒体自噬改善小鼠和猪排卵后卵母细胞衰老过程中的卵母细胞质量^［21］.但其对牦牛颗粒细胞的作用机制尚未系统阐明.此外，牛磺酸是否通过调节凋亡相关基因（如BCL2、BAX、CASP3）及类固醇合成关键基因（如STAR、CYP19A1、3β-HSD）表达影响牦牛颗粒细胞功能，仍需深入研究.

颗粒细胞的功能状态是影响牦牛卵母细胞体外成熟（In Vitro Maturation， IVM）的关键因素之一^［8］.然而，与奶牛等家畜相比，牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力仍处于较低水平，其体外培养体系仍有待优化和完善.目前尚未有关于牛磺酸对于牦牛颗粒细胞影响的相关报道，因此本研究以牦牛卵巢颗粒细胞为模型，探讨不同浓度牛磺酸对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素（E₂、P₄）分泌的影响.本研究结果为优化牦牛胚胎体外培养体系提供一定的理论依据和初步实验数据.结果表明，牛磺酸有望作为一种高效、安全的外源添加剂应用于牦牛体外胚胎生产体系，对推动牦牛繁殖技术进步和产业发展具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TransZol购于北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒与2×ChanQ SYBR qPCR Master Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司；青霉素-链霉素溶液、CCK-8试剂盒、牛雌二醇ELISA试剂盒及DMSO购于北京索莱宝科技有限公司；DMEM/F-12培养基、胰蛋白酶-EDTA消化液和胎牛血清购于赛默飞世尔科技有限公司；Anti-FSHR兔多克隆抗体购于江苏亲科生物有限公司；牛孕酮ELISA试剂盒购于上海酶联生物有限公司；免疫染色固定液及其他免疫染色试剂购于碧云天生物技术有限公司；牛磺酸粉末（优级纯）购于MCE公司.

1.2 牦牛颗粒细胞的分离培养与传代

采样地点为红原县某屠宰场，共采集9头健康且体况相近的3~5岁家养牦牛的卵巢.牦牛屠宰后，使用无菌剪刀剪取卵巢组织，并去除周围的结缔组织和脂肪，用无菌生理盐水冲洗后，将其迅速放入装有37 ℃生理盐水和青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）的保温壶中，2 h内运输至实验室.再次用含有青霉素、链霉素的37 ℃生理盐水冲洗卵巢，待卵巢表面无污渍且水清澈后，将其转入超净台.用5 mL无菌注射器抽取卵巢表面2~5 mm卵泡中的卵泡液，收集于15 mL离心管中，以1 800 r/min的转速，离心5 min后弃上清，收集底部沉淀细胞即为颗粒细胞.使用DMEM/F12培养基重悬后离心去除上清，重复3次.随后用含10%血清的完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中常规培养.待到细胞生长至80%~90%融合时，进行细胞传代.吸弃旧的培养液，颗粒细胞的传代采用胰酶消化法，步骤参照唐紫雯等的方法并稍作修改^［22］，具体为使用胰蛋白酶消化并接种至一个新的细胞培养皿中，每隔24 h进行清洗，换液，继续培养.

1.3 牦牛颗粒细胞的鉴定

将生长状态良好的颗粒细胞接种到6孔板中，置于培养箱中培养48 h，待细胞融合度达到80%后进行后续实验.用PBS洗去培养液及其他杂质后，加入500 μL免疫染色固定液室温固定20 min，再用PBS清洗3次.加入500 μL 0.5%Triton X-100通透液室温通透15 min，接着用PBS清洗3次.加入500 μL免疫染色封闭液，室温封闭1 h，结束后用移液枪吸弃.每孔加入500 μL 1∶200的Anti-FSHR 兔多克隆抗体，于4 ℃冰箱中孵育过夜.之后用PBS清洗3次，每次2 min，加入500 μL荧光二抗FITC-Goat Anti Rabbit IgG，室温避光孵育1 h，用DAPI染色封片后在荧光显微镜下观察细胞染色情况并拍照.

1.4 牛磺酸对牦牛颗粒细胞活力的影响

采用CCK-8法评估不同浓度牛磺酸对细胞活力的影响，以确定最适浓度.将状态良好的颗粒细胞按每孔5 000个接种于96孔板，贴壁后分别加入0、50、100、150、200、250、300 μM牛磺酸处理48 h.之后弃去培养基，PBS洗涤，更换新鲜基础培养基.向每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在相同条件下培养2 h，测定OD 450 nm并记录结果，根据说明书所示公式计算细胞活力，进行结果分析.

1.5 牦牛颗粒细胞 RNA的提取和反转录

去除旧的培养基，用PBS清洗3次，6孔板中每孔加入1 mL的Transzol，用细胞刮剥离细胞，用移液枪收集至1.5 mL RNase free 的离心管中，每管加入0.2 mL RNA Extraction Agent，用移液枪反复吹打直至裂解液中无明显沉淀.后续实验按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒的使用说明书进行操作.

1.6 引物设计与合成

参考 NCBI 数据库中公布的牛（Bos taurus）增殖相关基因（CCND1、CCNB1、PCNA）、凋亡相关基因（BAX、BCL2、CASP3）、类固醇激素合成相关基因（STAR、CYP11A1、HSD3B1）及内参基因 β-Actin 的mRNA序列（登录号详见表1），通过Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR引物.由于牦牛（Bos grunniens）部分目标基因缺乏经过审校的 mRNA 序列，本研究参考近缘物种普通牛（Bos taurus）的 mRNA 序列（登录号见表 1）进行引物设计.为确保引物在牦牛颗粒细胞中的适用性，利用 NCBI BLAST 程序将引物序列与牦牛参考基因组组装版本（Assembly：BosGru3.1）及全基因组鸟枪法序列库（WGS）进行局部序列比对（Local Alignment）.比对重点核查引物结合区的序列一致性，确保引物3'端无碱基突变以保障扩增效率.序列同源性分析、引物产物大小等详见表1.

1.7 颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素生成相关基因的检测

利用RT-qPCR技术对颗粒细胞中的增殖、凋亡和类固醇激素生成相关基因进行相对表达量检测.RT-qPCR的实验程序具体步骤参照唐紫雯等的方法并稍作修改^［22］.重复执行该流程，保证每个样本重复3次. qPCR所得Ct值用2^-ΔΔCt法计算其相对表达，使用SPSS 21.0对定量结果进行方差分析.用2^-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量，使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行多重比较分析，统计学显著性水平设定为P<0.05.

1.8 牛磺酸对牦牛颗粒细胞 E₂和P₄分泌的影响

采用商品化ELISA试剂盒检测培养上清中E₂和P₄的浓度，严格按说明书操作.简要步骤包括：将标准品与样本加入板孔，孵育后洗涤，依次加入检测抗体、底物和终止液，于450 nm测定OD值.通过标准曲线计算样本激素浓度.

1.9 数据分析

所有实验数据均为至少独立重复实验3次，结果以均值±标准差表示.组间差异的统计学显著性通过单因素方差分析（ANOVA）进行检验，以P<0.05为具有统计学差异的标准.图表绘制与相关统计分析借助GraphPad Prism 5.0软件完成.

2 结果

2.1 牦牛颗粒细胞的鉴定

形态学观察显示，分离获得的颗粒细胞具有典型的多边形或纺锤状结构，细胞轮廓清晰，胞质饱满（图1）.免疫荧光结果显示，FSHR呈强阳性表达，表明所获得的细胞纯度较高，满足后续实验质量要求（图2）.

2.2 牛磺酸对牦牛颗粒细胞活力的影响

与不添加牛磺酸（0 μM，CON组）相比，牛磺酸处理组（Tau组）中牦牛颗粒细胞活力提高.结果显示，150、200、250、300 μM的牛磺酸浓度可以显著提高牦牛颗粒细胞的活力（P<0.05），其中250 μM牛磺酸对细胞活力的促进效果极显著（P<0.001）（图3）.因此后续的实验选用250 μM牛磺酸培养颗粒细胞.

2.3 牛磺酸对牦牛颗粒细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响

结果显示（图4），牛磺酸处理显著上调了PCNA、CCND1和CCNB1等增殖相关基因的表达（P<0.05），同时提高抗凋亡基因BCL2表达（P<0.01），并抑制促凋亡基因BAX和CASP3表达（P<0.05）.PCNA和CCND1的mRNA相对表达量分别显著升高至对照组的1.60倍和1.59倍（P<0.05），CCNB1表达量亦显著增加了10%（P<0.05）.此外，牛磺酸处理有效调节了凋亡相关基因的转录，其中抗凋亡基因 BCL2的表达量极显著提高至对照组的1.20倍（P<0.01），而促凋亡基因BAX和CASP3的表达量则分别显著降低了15%和10%（P<0.05）.

2.4 牛磺酸对牦牛颗粒细胞类固醇激素合成相关基因表达的影响

结果显示，250 μM牛磺酸处理显著促进了牦牛颗粒细胞中孕酮合成相关基因的转录（图5）.与对照组相比，Tau组CYP11A1、STAR及HSD3B1的相对表达水平分别显著上调了1.40倍（P<0.01）、1.38倍和1.20倍（P<0.05）.

2.5 牛磺酸对牦牛颗粒细胞类固醇激素分泌的影响

根据ELISA试剂盒操作步骤，将样本的OD值代入标准曲线.结果如图6所示，牦牛颗粒细胞在添加牛磺酸培养48 h后，Tau组相较于对照组E₂含量显著下降，P₄含量显著上升（P<0.05）.

3 讨论

牛磺酸作为一种内源性活性分子，参与机体多项生理过程的调节.本研究通过探讨其对牦牛颗粒细胞功能的影响，不仅有助于揭示牦牛卵泡发育的内在机制，也为提升其繁殖性能提供了潜在的干预策略，兼具理论与应用价值.通过梯度添加牛磺酸至体外培养的颗粒细胞中，系统分析其对增殖、凋亡及类固醇激素分泌的影响.

通过在体外培养体系中梯度添加牛磺酸，结果表明，250 μM牛磺酸可显著提高牦牛颗粒细胞的增殖活力.既往研究表明，牛磺酸可通过p38/miR-7a/GLG1/CYP19A1信号通路促进小鼠卵巢颗粒细胞E₂的合成^［23］；还可通过激活Nrf2/HO-1通路抑制TLR4-MAPK/NF-κB通路和Caspase-3通路，从而减轻脂多糖诱导的牛子宫内膜上皮细胞中的氧化应激、炎症反应和线粒体凋亡^［24］.在其他组织中，牛磺酸同样被证实可增强细胞的抗氧化和抗凋亡能力，例如提高牛乳腺上皮细胞的抗氧化和抗凋亡能力，从而减轻热损伤对细胞造成的损害^［18］.基于上述研究结果，推测在牦牛卵母细胞体外成熟（IVM）或体外受精（IVF）后胚胎培养体系中添加牛磺酸，可能通过改善卵丘-颗粒细胞功能状态，间接提高卵母细胞成熟质量及胚胎发育潜能.

牛磺酸是体内稳态的基本调节因子，抗氧化能力是其最核心的生物学功能之一，通过多种作用发挥抗氧化应激的保护作用^［14］.体外培养环境会诱导细胞产生大量活性氧，导致氧化应激，进而造成细胞损伤，影响细胞发育和成熟并诱导细胞凋亡^［25］.已有多项研究表明，牛磺酸具有抑制细胞凋亡的作用^［26-28］.本研究通过向体外培养的牦牛颗粒细胞中添加不同浓度牛磺酸，结果显示，牛磺酸能够显著促进细胞增殖，抑制凋亡.在体外培养过程中，可能由于氧化应激造成颗粒细胞凋亡^［29］.而牛磺酸作为内源性的抗氧化剂，可以直接中和羟自由基等有害物质，同时通过调节抗氧化酶系统的活性，增强细胞的氧化应激耐受能力^［14］.已有研究表明牛磺酸对于颗粒细胞氧化应激的保护作用，并抑制其凋亡^［19］，其抗氧化特性为颗粒细胞体外增殖提供了良好的环境条件.

其次，牛磺酸具有稳定细胞内钙离子稳态和抑制线粒体介导的细胞凋亡作用.颗粒细胞的凋亡与细胞内钙超载及Caspase-3的激活密切相关.已有研究表明，牛磺酸可以作用于线粒体，通过作用于氯离子通道、防止钙过量内流，抑制钙蛋白酶激活，阻止BAX（促凋亡蛋白）易位至线粒体及细胞色素C释放^［30］.同时，牛磺酸可能通过上调BCL2（抗凋亡蛋白）的表达并下调BAX的表达，来抑制凋亡激活，最终降低细胞凋亡率^［30-31］.本研究发现，添加牛磺酸后能显著提高BCL2表达，降低BAX和CASP3表达.本研究结果与上述报道一致，牛磺酸处理后牦牛颗粒细胞中BCL2表达显著升高，而BAX与CASP3表达显著降低，进一步支持其抗凋亡作用.

在激素分泌方面，本研究发现牛磺酸显著促进了牦牛颗粒细胞孕酮（P₄）的分泌，但对雌二醇（E₂）的分泌无显著促进甚至有所下调.类固醇激素的高效合成是卵泡正常发育和排卵的关键^［32］.这一现象可能源于以下两方面机制：其一，牛磺酸促进颗粒细胞增殖，从而增加具有激素合成功能的细胞数量，间接提升培养体系整体的激素分泌水平；其二，牛磺酸可能直接调控类固醇合成关键酶的表达.类固醇激素的合成依赖于STAR蛋白（负责将胆固醇转运至线粒体内膜）以及一系列细胞色素P450酶（如CYP11A1，CYP19A1）的活性^［33］.本研究结果表明，牛磺酸显著上调STAR、HSD3B1和CYP11A1的表达，从而直接增强牦牛颗粒细胞的P₄合成能力.这可能是即使排除增殖因素后，单位细胞的激素分泌能力仍可能增强的原因.已有研究表明，饲粮中添加包被牛磺酸可改善热应激种公羊抗氧化能力和激素分泌水平，从而提高精液品质^［34］.还有研究牛磺酸还能促进体外培养颗粒细胞E₂和P₄的分泌^［35］.而本研究这一结果与牛磺酸促进小鼠颗粒细胞E₂合成的报道^［23］有所不同.这种差异可能与以下因素有关：首先，牦牛作为高原适应物种，其类固醇激素合成调控网络可能具有一定的物种特异性；其次，在本实验条件下，牛磺酸可能主要优化了P₄合成途径（STAR-CYP11A1-HSD3B1），而未充分激活FSH依赖的CYP19A1表达或活性；此外，单层颗粒细胞体外培养体系缺乏体内卵泡发育过程中复杂的FSH/LH梯度调控及卵泡壁细胞-颗粒细胞之间的旁分泌调节，也可能影响E₂合成的调控模式.

值得注意的是，本研究中抗凋亡基因（BCL2）上调、促凋亡基因（BAX、CASP3）下调与类固醇合成关键基因（STAR、CYP11A1、HSD3B1）上调呈现出一定的同步变化.结合既往研究，牛磺酸可能通过调节细胞氧化应激相关的上游信号通路（如Nrf2/HO-1），在维持细胞存活的同时间接影响类固醇合成能力.然而，本研究未对相关信号通路进行直接验证，上述推测仍需通过通路干预实验进一步证实.

综上所述，本研究初步证实牛磺酸作为一种安全有效的培养添加剂，可通过其抗氧化和抗凋亡特性，显著促进牦牛颗粒细胞的增殖、抑制凋亡并增强其类固醇激素分泌功能.未来可结合RNA-Seq等组学技术，系统解析牛磺酸调控颗粒细胞功能的分子网络，并在卵丘-卵母细胞复合体培养模型中进一步验证其对卵母细胞成熟率、胚胎卵裂率及囊胚形成率的影响；同时，探索牛磺酸与其他抗氧化剂（如褪黑素、维生素E）的协同作用，为构建更高效的牦牛胚胎体外培养体系提供理论依据.

4 结论

牛磺酸可浓度依赖性地提高牦牛颗粒细胞增殖活力，250 μM为最佳作用浓度.该浓度牛磺酸通过上调PCNA、CCND1等增殖基因表达，下调BAX、CASP3等凋亡基因表达，促进细胞增殖并抑制凋亡.同时，牛磺酸上调类固醇合成关键基因STAR与CYP11A1表达，促进孕酮（P₄）分泌，但降低雌二醇（E₂）水平.综上，牛磺酸在体外培养体系中可有效调控牦牛颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌.

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基金资助

浙江省“尖兵领雁+X”科技计划项目(2026C04017)

西南民族大学中央高校基本科研业务费专项项目(ZYN2026023)