整合GEO与CTD数据库的脑出血外周血环境暴露相关关键基因识别及生物信息学分析

Identification and bioinformatics analysis of environmental exposure-related key genes in peripheral blood of intracerebral hemorrhage patients based on integrated GEO and CTD databases

摘要

旨在探讨整合基因表达汇编数据库（GEO）与比较毒理基因组学数据库（CTD）识别脑出血（ICH）患者外周血环境暴露相关候选基因的可行性，并分析其动态表达特征及与免疫通路的关联.下载并预处理GEO数据集GSE296792，获取脑出血患者不同时间点（0 d、72 h、7 d）外周血mRNA及miRNA表达矩阵，采用limma筛选差异表达基因，结合CTD中重金属暴露、氧化应激及外源化合物反应基因集识别环境暴露相关候选基因，并通过基因本体富集、Spearman相关分析、miRNA-mRNA预测、一致性聚类及单样本基因集富集分析评估候选基因的功能关联、表达异质性及其与免疫通路的关系.主成分分析显示72 h组与0 d组在转录水平上存在明显分离，7 d组分布趋于集中（P<0.05）.差异分析识别出LRRN1、IER5、IKBKE、SREBF2等持续上调的基因.环境暴露整合分析筛选出SLC39A4与TNFAIP8L1两种候选基因，其表达水平均在脑出血后呈上升趋势（P<0.05）.功能注释提示SLC39A4与金属离子稳态相关，TNFAIP8L1与细胞应激反应相关.两基因在多种免疫刺激背景下呈一定共表达关系，并与部分免疫通路得分存在正相关，其中包括中性粒细胞脱颗粒通路（P<0.05）.一致性聚类分析显示，基于候选基因表达可将样本区分为两个亚型，并与不同时间阶段的分布呈一定对应关系.miRNA–mRNA分析提示两基因可能受到多种miRNA的潜在调控.综上，SLC39A4与TNFAIP8L1可作为脑出血后与环境暴露相关的候选基因，呈现随病程变化的动态表达特征，并与免疫通路活化存在关联，为探索脑出血继发性损伤的分子变化提供新的转录组学线索.

Abstract

This study aimed to investigate the feasibility of integrating the Gene Expression Omnibus （GEO） and Comparative Toxicogenomics Database （CTD） to identify environmental exposure-related candidate genes in the peripheral blood of Intracerebral Hemorrhage （ICH） patients and to analyze their dynamic expression characteristics as well as their associations with immune pathways. The GEO dataset GSE296792 was downloaded and preprocessed to obtain peripheral blood mRNA and miRNA expression matrices from ICH patients at different time points （0 d， 72 h， and 7 d）. Differentially expressed genes were screened by employing the limma package， and environmental exposure-related candidate genes were screened by integrating gene sets associated with metal exposure， oxidative stress， and xenobiotic metabolism from CTD. Gene Ontology enrichment， Spearman correlation analysis， miRNA-mRNA prediction， consensus clustering， and single-sample gene set enrichment analysis were applied to evaluate the functional relevance and expression heterogeneity of candidate genes， and their associations with immune pathways. Principal component analysis demonstrated a clear separation between the 72 h group and the 0 d group in terms of the transcriptional level， while samples from the 7 d group showed a more concentrated distribution （P<0.05）. Differential expression analysis identified persistently upregulated genes， including LRRN1， IER5， IKBKE， and SREBF2. Integrated environmental exposure analysis identified SLC39A4 and TNFAIP8L1 as candidate genes， both of which exhibited increased expression levels after ICH （P<0.05）. Functional annotation suggested that SLC39A4 was associated with metal ion homeostasis， whereas TNFAIP8L1 was related to cellular stress responses. The two genes showed a certain degree of co-expression in multiple immune stimulation conditions and positively correlated with some immune pathway scores， including the neutrophil degranulation pathway （P<0.05）. Consensus clustering analysis indicated that samples could be classified into two subtypes based on candidate gene expressions， which showed partial correspondence with the distribution of different disease stages. miRNA-mRNA analysis suggested that both genes might be potentially regulated by multiple miRNAs. In summary， SLC39A4 and TNFAIP8L1 might serve as environmental exposure-related candidate genes after ICH， exhibiting dynamic expression characteristics along the disease course and associations with immune pathway activation， thereby providing novel transcriptomic clues for investigating the molecular alterations in secondary brain injury after ICH.

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神经系统最具破坏性的脑血管疾病之一，约占所有卒中的10%~15%，具有高致残率和高病死率^［1］.其病理过程复杂，除血肿形成和颅内压升高引起的原发性损伤外，继发性脑损伤（SBI）亦在病程中发挥关键作用^［2］.氧化应激与炎症反应被认为是驱动SBI的核心机制，其通过活性氧（ROS）积聚、血脑屏障破坏及免疫细胞浸润等环节，诱导神经元凋亡与胶质细胞活化，导致神经功能持续恶化^［3］.

近年来，环境暴露因素在脑血管疾病中的作用逐渐受到关注.流行病学证据显示，长期暴露于重金属及空气污染物可增加脑出血及其后遗神经损伤的风险^［4-5］.重金属离子尤其是Zn²⁺、Pb²⁺等能够通过干扰细胞金属离子稳态，引发氧化应激及炎症反应，从而放大脑损伤级联反应^［6］.然而，脑出血患者在不同暴露背景下的外周血分子应答特征尚缺乏系统性研究，相关暴露标志物仍未得到明确界定.

随着转录组学技术的发展，外周血转录谱已被证明能够反映脑损伤诱导的全身免疫与代谢应答变化，为研究SBI的动态分子过程提供了重要线索^［7］.既往研究报道，脑出血后早期外周血中多种炎症与金属离子转运相关基因上调，提示外源刺激可能通过影响基因表达网络参与病程演变^［3］.但目前缺乏针对脑出血环境暴露相关分子特征的整合性分析，尤其是在多时间点表达变化与免疫活化状态之间的关联尚未得到定量阐述.

本研究拟整合GEO数据库中的脑出血转录组数据（GSE296792）与比较毒理基因组学数据库（CTD）中已注释的环境暴露相关基因集，以在系统层面识别脑出血后可能与暴露因素相关的候选分子.通过差异表达分析、富集分析、共表达网络构建及免疫通路相关性评估，进一步描述候选基因的表达变化模式及其在免疫应答中的潜在作用.本研究旨在从外周血视角揭示脑出血后环境应激相关的分子变化，为理解SBI的复杂生物学过程提供新的研究依据，并为后续转化研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 数据来源与样本信息

本研究数据来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）下属的基因表达汇编数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）公开数据集GSE296792^［8］.该数据集基于Illumina平台，对脑出血患者外周血样本在不同时间点（0 d、出血后72h及7d）进行全转录组（mRNA）及miRNA测序.原始测序文件经GEOquery 在R环境中下载获得.共纳入77个样本，其中包括0 d组49例、72 h组26例、7 d组2例，均为人类外周血标本.

1.2 数据预处理与归一化

原始基因表达矩阵经log₂转换并进行四分位数标准化，以消除测序深度和技术偏差的影响.去除低表达基因（即在超过80%样本中表达值低于log₂（1）的基因），保留高质量基因用于后续分析.样本间关系通过主成分分析（PCA）进行质量控制，使用prcomp（）函数提取主成分并可视化分布特征，以评估脑出血不同时间点的全局转录变化趋势.

1.3 差异表达基因（DEGs）筛选

为识别脑出血不同阶段的动态转录特征，分别以0 d组为对照，对72 h组与7 d组进行差异分析.采用limma包构建线性模型并进行贝叶斯稳健校正.差异表达基因（DEGs）的筛选阈值设定为假发现率（FDR）<0.05，且|log₂倍数变化|>0.5.显著基因以火山图和聚类热图形式可视化.

1.4 环境暴露相关基因识别

为评估脑出血后转录响应中与环境暴露相关的分子特征，从比较毒理基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，https：//ctdbase.org/）下载三类环境暴露基因集：重金属暴露（metal exposure）、氧化应激（oxidative stress）及外源化合物反应（xenobiotic metabolism）相关基因列表.使用R语言中的intersect（）函数分别计算脑出血差异基因集与三类CTD基因集的交集.为避免过度筛选导致遗漏，阈值放宽至FDR<0.2且|log₂FC|>0.3后再次交叉验证.

1.5 功能富集分析

为探讨暴露相关基因的生物学功能，利用clusterProfiler包进行基因本体（GO）富集分析^［9］.分析范围限定为“生物过程”（BP）类别，显著性标准为FDR<0.05.富集结果通过ggplot2包可视化为条形图或气泡图.

1.6 共表达与miRNA调控分析

为评估暴露相关基因间的协同关系，采用Spearman相关系数计算SLC39A4与TNFAIP8L1在整体转录组中的共表达模式.相关系数阈值设定为|r|>0.7，P<0.05，以确保网络的生物学可靠性.miRNA-mRNA调控网络基于GSE296792 miRNA表达矩阵及公开预测数据库整合结果构建.首先使用limma包对miRNA表达数据进行差异分析，筛选阈值设为FDR<0.05且|log₂FC|>1.随后，通过TargetScan（http：//www.targetscan.org/）与miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）预测SLC39A4与TNFAIP8L1的上游调控miRNA，并与差异miRNA结果取交集.最终构建miRNA-mRNA调控网络，使用igraph与ggraph可视化.

1.7 样本聚类与分型分析

为探索暴露响应基因在不同样本间的表达异质性，基于SLC39A4、TNFAIP8L1及与其显著共表达的前30个DEGs构建特征表达矩阵.使用ConsensusClusterPlus包进行无监督一致性聚类^［10］，参数设置为maxK=4、reps=1 000、pItem=0.8、pFeature=0.8、clusterAlg=“hc”、distance=“pearson”.最佳聚类数目K通过累计分布函数（CDF）曲线稳定性判断，最终确定K=2.进一步采用umap包进行降维可视化，以展示不同亚型在二维空间的分布特征.

1.8 免疫相关通路与暴露基因耦合分析

免疫信号通路基因集来源于分子特征数据库（MSigDB）^［11］中“免疫相关基因集”（C7.Immunologic Signatures）.利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估各样本的免疫通路富集得分.采用秩和计算（manual ssGSEA）算法对表达矩阵按列排名，并计算各通路对应基因集合的平均秩值作为富集分数.随后计算SLC39A4与TNFAIP8L1的表达水平与免疫通路得分的Spearman相关系数（|r|>0.4，P<0.05），以识别两基因与免疫活化（特别是中性粒细胞脱颗粒通路）的关联强度，并使用pheatmap包绘制相关性热图.

1.9 统计学分析

所有统计分析均在R（4.3.2版本）环境中完成.多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验.相关性分析使用Spearman相关系数.差异显著性以双侧检验P<0.05为标准，校正后的FDR用于控制多重比较错误率.所有可视化结果均通过ggplot2与ggpubr包完成.

2 结果

2.1 全局转录特征分析

脑出血不同时间点样本的主成分分析结果显示，主成分1与主成分2分别解释总体变异的41.4%与7.4%.样本0 d整体分布较为集中，而72 h组在PC1方向上出现明显偏移，提示脑出血早期转录谱已发生变化.样本7 d组分布部分与72 h组重叠但整体离散度减小，说明随着病程进展，转录特征逐渐趋于稳定（图1）.

2.2 差异表达基因筛选与聚类分析

差异表达分析结果显示，脑出血后不同时间点与0 d相比均出现显著的转录变化.图2A显示，在72 h与0 d比较中，上调基因数量明显多于下调基因，提示急性期炎症及应激相关信号通路被激活.图2B显示，7 d组与0 d比较时差异基因数量进一步增加，且多数基因呈上调趋势，表明脑出血后分子应答在恢复期仍持续存在.进一步对前30个显著差异表达基因进行聚类分析（图2C），结果显示各组样本在转录水平上形成清晰分层，其中LRRN1、IER5、IKBKE、SREBF2等基因在72 h与7 d阶段持续上调，提示其可能参与脑出血后的炎症反应与组织修复调控过程.

2.3 环境暴露相关基因筛选

环境暴露相关基因的整合分析结果如图3所示.图3A显示，不同环境暴露类型（重金属、氧化应激、外源化合物）对应的候选基因交集较少，仅在重金属与氧化应激类别中各识别出1个关键基因.图3B结果显示，重金属相关基因为SLC39A4，氧化应激相关基因为TNFAIP8L1，提示两者可能在脑出血后的环境应激应答中发挥核心作用.进一步分析发现，SLC39A4与TNFAIP8L1在脑出血72 h及7 d阶段均呈逐步上调趋势（图3C），提示其表达变化与脑出血进展过程密切相关.

2.4 功能注释与蛋白互作分析

功能富集分析结果显示，SLC39A4与TNFAIP8L1在金属离子稳态及氧化应激相关通路中具有显著的生物学关联.图4A显示，SLC39A4主要富集于细胞内锌离子稳态、锌离子跨膜转运及细胞内阳离子稳态等过程；图4B结果显示，TNFAIP8L1主要参与细胞凋亡调控及TOR信号通路负向调节，提示两者在脑出血后可能通过不同途径介导细胞损伤与修复过程.进一步的蛋白互作分析结果如图5所示，SLC39A4位于互作网络的中心位置，与CHADL、FBXL15、CCDC85B、ANP32MT及FLYWCH1等蛋白形成紧密连接，表明其在金属离子转运及应激反应调控中处于关键节点.

2.5 共表达与协同调控分析

基因共表达分析结果显示，SLC39A4与TNFAIP8L1在多种炎症及免疫刺激条件下呈一致的表达趋势（图6）.图6中可见，两者在LPS、IL-17及TLR配体刺激后均表现出上调模式，且整体相关性较高，说明两基因在脑出血后的免疫与氧化应激反应中可能存在协同调控关系.进一步的miRNA-mRNA互作网络分析结果如图7所示，SLC39A4与TNFAIP8L1分别受到多种miRNA的潜在负向调控.图7A显示，SLC39A4可被hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-423-5p等靶向；图7B显示，TNFAIP8L1可能受hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-3135b及hsa-miR-484等调控.该结果提示，miRNA介导的转录后调控可能参与SLC39A4与TNFAIP8L1表达调节过程.

2.6 聚类特征与样本分型分析

联合表达与聚类分析结果如图8所示.图8A显示，基于核心差异基因表达模式可将脑出血样本分为两个主要分型.分型1样本主要来源于72 h阶段，分型2样本则以7 d阶段为主.SLC39A4与TNFAIP8L1在分型1中均呈高表达状态，提示其在脑出血早期阶段的转录活性更为显著.图8B进一步的二维散点聚类结果显示，两类样本间分界清晰，72 h组样本主要集中分布于分型1，而7 d组样本分布更为分散，说明随着病程进展，基因表达特征逐步转变，形成时相依赖的转录分型模式.

2.7 基因表达趋势及与免疫活化的关系分析

SLC39A4与TNFAIP8L1在不同时间点的表达变化及其与中性粒细胞脱颗粒活化的关系如图9所示.图9A和图9B显示，两基因在脑出血后均呈总体上升趋势，其中TNFAIP8L1在72 h至7 d阶段升高更为明显，提示其参与病程进展中的炎症应答.图9C和图9D结果显示，SLC39A4与TNFAIP8L1的表达水平均与中性粒细胞脱颗粒评分呈正向变化趋势，说明两基因可能与脑出血后的免疫细胞活化密切相关.整体结果表明，SLC39A4和TNFAIP8L1在脑出血后表现出动态上调特征，并可能通过影响免疫细胞功能参与病理过程调控.

3 讨论

本研究整合GEO转录组数据与CTD环境暴露基因集，对脑出血不同时间阶段的分子响应特征进行了系统分析，筛选出SLC39A4与TNFAIP8L1两种与环境暴露相关的候选基因，并对其表达特征及功能关联进行了分析.结果提示，脑出血后的病理过程除内源性损伤机制外，还可能受到外源性环境应激因素的影响，从而为理解继发性损伤相关的分子变化提供新的研究视角.

本研究发现脑出血后外周血转录谱在不同时间点存在差异，72 h样本在主成分空间中明显偏离0 d组，而7 d样本的分布相对集中.该现象与既往多组学研究结果一致，即脑出血急性期以炎症和应激信号激活为主，随后逐渐向相对稳定状态转变^［12］.其中LRRN1、IER5、IKBKE和SREBF2等基因在早期阶段持续上调，提示脑出血后外周血转录应答可能与神经炎症及代谢调节相关.IKBKE可通过NF-κB通路增强炎症因子释放^［13］，而SREBF2参与脂质代谢和膜结构相关过程^［14］.需要指出的是，上述结果主要反映转录水平的变化特征，其在脑出血病理过程中的具体作用仍需进一步研究.

环境暴露相关分析结果显示，SLC39A4与TNFAIP8L1分别与重金属稳态及氧化应激相关通路存在关联.SLC39A4作为锌转运相关蛋白，参与细胞内Zn²⁺摄入，其表达变化可能影响金属离子稳态并与氧化应激状态相关^［15］.已有研究表明，Zn²⁺异常积聚可导致线粒体功能障碍和ROS生成增加，从而加重神经元损伤^［16］.本研究中观察到SLC39A4在脑出血后早期阶段表达上调，并与部分免疫相关通路评分存在相关性，该结果提示其可能与脑出血后应激及炎症相关反应有关.另一方面，TNFAIP8L1是一种应激诱导相关蛋白，既往研究提示其在细胞存活及免疫调控中可能发挥一定作用^［17］.本研究发现TNFAIP8L1在72 h和7 d阶段呈持续升高趋势，并与中性粒细胞脱颗粒得分存在相关性，但上述结果仅反映表达层面的相关性，尚不足以据此推断其具体功能.

此外，SLC39A4与TNFAIP8L1在本研究中呈现一定程度的共表达关系，并在多种免疫刺激条件下表现出相似的变化趋势.已有研究指出，金属离子稳态紊乱可能通过MAPK和NF-κB等信号通路影响TNFAIP8家族成员的转录活性^［18］.结合本研究结果，可以从转录相关性的角度提出假设，即脑出血相关的环境应激状态可能影响多种应激与免疫相关基因的协同变化，但该假设仍需进一步实验验证.

miRNA-mRNA互作分析显示，SLC39A4和TNFAIP8L1可能受到多种miRNA的潜在调控.已有研究报道，miR-15a-5p和miR-484分别与氧化应激及炎症反应相关^［19-20］.需要强调的是，本研究中的miRNA-mRNA关系主要基于生物信息学预测及相关性分析，缺乏miRNA表达水平和功能实验的直接证据.因此，相关结果仅用于提示可能存在的转录后调控线索，而不能作为机制性结论.

聚类分析结果显示，基于暴露相关基因表达特征可将脑出血样本划分为不同分子亚型，其中部分分型与时间点分布存在一定对应关系.考虑到7 d样本量有限，该分析结果主要用于描述性比较和假设生成.类似的时间依赖性免疫分型在急性脑损伤研究中亦有报道^［21］.相关结果提示，脑出血后的外周血转录应答可能具有一定的时间依赖特征，但其稳定性和临床意义仍需进一步验证.

总体而言，本研究从环境暴露视角对脑出血后外周血转录应答特征进行了系统分析，筛选出SLC39A4与TNFAIP8L1等与环境暴露相关的候选基因，并描述了其表达变化及功能关联特征.这些结果为理解脑出血后继发性损伤相关的免疫与应激反应提供了转录层面的线索.然而，本研究仍受样本量及单一数据集限制，尤其7 d样本较少可能影响结果稳定性，且缺乏蛋白质和细胞水平的实验证实.未来仍需结合临床样本及动物模型，对相关发现进行进一步验证.

参考文献

[1] O’CARROLL C B， BROWN B L， FREEMAN W D. Intracerebral hemorrhage a common yet disproportionately deadly stroke subtype［J］. Mayo Clinic Proceedings， 2021， 96（6）： 1639-1654.

[2] SHAO L Q， CHEN S C， MA L. Secondary brain injury by oxidative stress after cerebral hemorrhage： Recent advances［J］. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2022， 16： 853589.

[3] CHEN S P， LI L Z， PENG C， et al. Targeting oxidative stress and inflammatory response for blood–brain barrier protection in intracerebral hemorrhage［J］. Antioxidants & Redox Signaling， 2022， 37（1-3）： 115-134.

[4] PAN Z W， GONG T Y， LIANG P. Heavy metal exposure and cardiovascular disease［J］. Circulation Research， 2024， 134（9）： 1160-1178.

[5] NIKMANESH Y， MOHAMMADI M J， YOUSEFI H， et al. The effect of long-term exposure to toxic air pollutants on the increased risk of malignant brain tumors［J］. Reviews on Environmental Health， 2023， 38（3）： 519-530.

[6] YANG X Q， LI W， DING M， et al. Contribution of zinc accumulation to ischemic brain injury and its mechanisms about oxidative stress， inflammation， and autophagy： An update［J］. Metallomics， 2024， 16（3）： mfae012.

[7] CARMONA-MORA P， KNEPP B， JICKLING G C， et al. Monocyte， neutrophil， and whole blood transcriptome dynamics following ischemic stroke［J］. BMC Medicine， 2023， 21（1）： 65.

[8] WALSH K B， MARION M C， LI D F， et al. Neutrophil degranulation is increased at seven days after human intracerebral hemorrhage， but not at 72 h， and correlates with decreased miR-3613 and miR-3690［J］. BMC Neurology， 2025， 25（1）： 388.

[9] WU T Z， HU E Q， XU S B， et al. clusterProfiler 4.0： A universal enrichment tool for interpreting omics data［J］. The Innovation， 2021， 2（3）： 100141.

[10] HORR C， BUECHLER S A. Breast Cancer Consensus Subtypes： A system for subtyping breast cancer tumors based on gene expression［J］. npj Breast Cancer， 2021， 7（1）： 136.

[11] CHEN Y， FENG Y Z， YAN F， et al. A novel immune-related gene signature to identify the tumor microenvironment and prognose disease among patients with oral squamous cell carcinoma patients using ssGSEA： A bioinformatics and biological validation study［J］. Frontiers in Immunology， 2022， 13： 922195.

[12] FENG X J， LI X， FENG J， et al. Intracranial hemorrhage management in the multi-omics era［J］. Heliyon， 2023， 9（3）： e14749.

[13] CUDA C M. I kappa B kinase epsilon may hold the key to treating NP-SLE［J］. Arthritis and Rheumatology. 2023； 75（3）： 349.

[14] ZHENG Q， HAN Y X， FAN M， et al. Potential role of TREM2 in high cholesterol-induced cell injury and metabolic dysfunction in SH-SY5Y cells［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2023， 25（5）： 205.

[15] WANG B Q， FANG T S， CHEN H P. Zinc and central nervous system disorders［J］. Nutrients， 2023， 15（9）： 2140.

[16] LI W， YANG X Q， DING M， et al. Zinc accumulation aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury by promoting inflammation［J］. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2023， 17： 1065873.

[17] MAYHUE S. The intersection of extracellular signaling and stress pathways［D］. Orono， USA： The University of Maine， 2021.

[18] DENG H D， ZHU S， YANG H R， et al. The dysregulation of inflammatory pathways triggered by copper exposure［J］. Biological Trace Element Research， 2023， 201（2）： 539-548.

[19] MA Z X， LIU Z， XIONG H H， et al. MicroRNAs： protective regulators for neuron growth and development［J］. Neural Regeneration Research. 2023； 18（4）： 734-745.

[20] LIU X D， WANG X， ZHANG L J， et al. By targeting apoptosis facilitator BCL2L13， microRNA miR-484 alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury-induced neuronal apoptosis in mice［J］. Bioengineered， 2021， 12（1）： 948-959.

[21] TANG Z Y， LIAO C L， ZHUANG Z R， et al. Trajectories of systemic immune inflammation index and mortality risk in patients with moderate-to-severe traumatic brain injury： A retrospective cohort study［J］. Frontiers in Neurology， 2025， 15： 1439318.