鸡SIRT基因家族鉴定及其在胚胎时期的表达分析

Identification of SIRT gene family in Gallus gallus and expression analysis at embryonic stages

摘要

Sirtuin（SIRT）蛋白家族是一类属于Ⅲ类蛋白去乙酰化酶的保守蛋白，广泛存在于原核生物与真核生物中，在细胞生物学过程中发挥着多种重要作用，目前关于鸡SIRT基因家族功能的研究较少.为深入探究SIRT基因家族在鸡中的功能，本研究基于SIRT保守Pfam序列（SIR2，PF02146）在鸡全基因组筛选鉴定鸡SIRT基因家族成员，然后利用生物信息学对其理化性质、染色体定位、基因结构、系统进化树、保守结构域、共线性以及蛋白质互作网络展开分析，同时利用转录组数据对该家族成员在鸡胚胎不同发育时期的表达模式进行分析.结果表明，在鸡全基因组中鉴定出8个SIRT蛋白基因，属于7个SIRT基因家族成员，其中SIRT2a是SIRT2的可变剪切体，分布在鸡的7条染色体上；可编码氨基酸序列长度在309～756 aa之间，均为亲水性蛋白；不同物种系统进化树和保守结构域分析表明，SIRT基因家族分为7个分支，且各分支成员具有较高的保守性；共线性分析结果显示，鸡7个SIRT基因间无共线性关系，与人和小鼠基因组均有3对同源基因，与猪和牛则存在4对同源基因；蛋白质互作网络结果显示，14个功能基因被预测与7个SIRT基因具有潜在的相互作用；转录组数据表明，在大恒肉鸡和藏鸡鸡胚胎的不同发育时期，SIRT1、SIRT2、SIRT5、SIRT6和SIRT7基因的表达量随着胚胎的发育持续下调，SIRT3和SIRT4基因则呈现先下调后上调的趋势.研究结果可为后续鸡SIRT基因家族成员功能的研究奠定基础.

Abstract

The Sirtuin （SIRT） protein family is a group of conserved proteins belonging to the class Ⅲ histone deacetylase， which widely exists in prokaryotes and eukaryotes， and plays multiple important roles in cell biology. Currently， there is relatively little research on the function of the SIRT gene family in Gallus gallus. To deeply explore the function of the SIRT gene family in G. gallus， this study screened and identified members of the SIRT gene family in G. gallus based on the conserved Pfam sequences of SIRT （SIR2， PF02146） in the G. gallus genome， and then analyzed their physicochemical properties， chromosomal locations， gene structures， phylogenetic trees， conserved domains， collinearity， and protein interaction networks by adopting bioinformatics. Meanwhile， the expression patterns of this family’s members at different developmental stages of G. gallus embryos were analyzed by utilizing transcriptome data. The results showed that eight SIRT protein genes were identified in the G. gallus genome， belonging to seven SIRT gene family members. Among them， SIRT2a was the alternative splice variant of SIRT2， distributed on seven G. gallus chromosomes. The encoded amino acid sequences ranged from 309 to 756 aa in length， and all of them were hydrophilic proteins. Analysis of the phylogenetic trees and conserved domains of different species showed that the SIRT gene family was divided into seven branches， and members in each branch had high conservation. Collinearity analysis showed that there was no collinearity relationship among the seven SIRT genes in G. gallus， while there were three pairs of homologous genes in H. sapiens and M. musculus genomes， and four pairs of homologous genes in S. scrofa and B. taurus genomes. The protein interaction network analysis showed that 14 functional genes were predicted to have potential interactions with the seven SIRT genes. Transcriptome data showed that at different developmental stages of embryos in the Daheng broiler （DH） and Tibetan chicken （TC）， the expression levels of SIRT1， SIRT2， SIRT5， SIRT6， and SIRT7 genes were continuously down-regulated with the development of the embryos， while the expression levels of SIRT3 and SIRT4 genes were down-regulated and then up-regulated. These results provided a foundation for further studies on the function of SIRT gene family members in G. gallus.

Graphical abstract

关键词

鸡 / SIRT基因家族 / 生物信息学 / 系统进化 / 基因表达

Key words

G. gallus / SIRT gene family / bioinformatics / phylogenetic evolution / gene expression

Sirtuin（SIRT）蛋白家族是一类属于Ⅲ类蛋白去乙酰化酶（Class Ⅲ Histone Deacetylase，HDACs Ⅲ）的保守蛋白，一般由7个成员组成，分别命名为SIRT1-SIRT7^［1］.SIRT蛋白都有一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）结合的催化结构域，可根据其所参与的不同生物学过程作用于不同的底物^［2］.SIRT蛋白广泛存在于原核生物与真核生物中，在细胞生物学过程中发挥着多种重要作用，如炎症、细胞代谢、氧化应激、DNA修复、线粒体功能和细胞凋亡等^［3-5］.研究发现，SIRT蛋白在真核生物中可被分为4类，SIRT1、SIRT2和SIRT3属于Ⅰ类，SIRT4和SIRT5分别属于Ⅱ类和Ⅲ类，SIRT6和SIRT7属于Ⅳ类^［6］.

目前，国内外学者已针对SIRT蛋白的功能开展了系统研究，SIRT蛋白的功能也在多种真核生物中得到验证.在哺乳动物中，SIRT1、SIRT6和SIRT7主要定位于细胞核（其中SIRT1当需要作用于细胞质中的靶标时，也可穿梭至细胞质^［7］），SIRT2定位于细胞质，SIRT3、SIRT4和SIRT5定位于线粒体^［8-9］.研究表明，限制能量可诱导SIRT表达，从而刺激转录辅激活因子PGC-1α诱导糖异生基因的表达，并降低PGC-1α对糖酵解基因的抑制，最终增加肝糖原输出^［10］；SIRT1也可通过激活PPAR-α增加脂肪酸氧化^［11］.SIRT1可调节肌肉细胞中的线粒体代谢^［12］.肌肉特异性敲除SIRT1小鼠实验表明，PGC-1α仍然可以正常去乙酰化，线粒体生物发生也可在运动的诱导下正常进行^［13］.在脂肪细胞中，SIRT1可通过抑制PPAR-γ的活性抑制脂肪生成并增加脂肪分解^［14］.SIRT6敲除的细胞中葡萄糖摄取和糖酵解增加，线粒体呼吸减少^［15］.SIRT6蛋白的缺乏会导致小鼠出现严重低血糖和早期死亡^［16］.SIRT7可与核糖体RNA基因结合组蛋白相互作用，同时与RNA聚合酶Ⅰ相互关联，促进转录^［17］.小鼠缺乏SIRT7会导致p53过度乙酰化、细胞凋亡增加、氧化应激抵抗能力降低，引起炎症性心肌病、心脏肥大、心脏纤维化、胶原Ⅲ积累增加等症状^［18］.SIRT2对FOXO1^［19］和FOXO3^［20］蛋白均具有去乙酰化作用，表明其参与这些关键转录因子调控过程.在肝细胞中，SIRT2可通过去乙酰化激活糖异生，增加PEPCK的稳定性^［21］.营养缺乏时，SIRT2可通过对FOXO1乙酰化作用促进脂肪分解和抑制脂肪合成^［22］.作为线粒体去乙酰化酶，SIRT3、SIRT4和SIRT5能够帮助细胞适应能量消耗的减少^［23］.SIRT3可以调节代谢酶如乙酰辅酶A合成酶2的乙酰化状态及其活性^［23］.长期禁食时，肝和棕色脂肪组织中SIRT3表达的上调可激活参与脂肪酸氧化和尿素循环的长链酰基脱氢酶和鸟氨酸转氨甲酰酶^［24-25］，而SIRT3的缺失则会加剧饮食引起的肥胖^［26］.限制能量时，SIRT4在肝中的表达下降，增加了谷氨酰胺在分解代谢中的可用性，以及肝中葡萄糖的产生.肝细胞和肌管中SIRT4的缺失会引起线粒体和脂肪酸代谢酶的增加，调节脂肪酸氧化.SIRT5可激活尿素循环中的限速酶^［27-28］，当氨基酸被用来提供能量时，有利于能量限制期间氨的处理.

鸡是目前地球上饲养量最大的家养动物，中国年产鸡蛋约2 600万吨，占世界总产量的近4成，居世界第一.研究发现，SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT6和SIRT7在鸡肝脏中的表达量随着其性成熟而显著升高^［29］.SIRT2和SIRT6在快速型肉鸡和慢速型肉鸡的胸肌中差异表达^［30］.尽管SIRT蛋白的功能在哺乳动物中已较为清晰，但目前在鸡中尚未有关于SIRT基因家族的系统研究.因此，本研究对鸡SIRT基因家族进行了鉴定，分析了该家族基因的染色体定位、结构、系统进化树、保守结构域和蛋白质互作网络，及其在鸡胚胎不同发育时期的表达模式，以期为后续鸡SIRT基因家族的功能研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验以培育品种大恒肉鸡（DH）和地方品种藏鸡（TC）为试验对象，DH和TC的种蛋分别采自四川大恒家禽育种有限公司（国家肉鸡核心育种场）和阿坝州九顶原生态畜禽养殖有限责任公司.分别在种蛋孵育第10、14和18 d挑选3个发育正常的雄性胚胎，快速采集腿肌组织并装入无RNA酶的冻存管中，标记后迅速置于液氮中保存备用.相关过程符合动物保护和动物福利的要求.

1.2 方法

1.2.1 鸡SIRT基因家族的全基因组鉴定和序列比对分析

鸡（Gallus gallus）基因组及其注释数据来自NCBI数据库（https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/016/699/485/GCF_016699485.2_bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b/）.利用Batch CD-search Tool和Pfam查找、筛选并获得具有SIRT蛋白特征性结构域（SIR2，PF02146）的基因，最终确定鸡SIRT基因家族成员.利用TBtools软件分析SIRT基因家族成员的理化性质.

1.2.2 鸡SIRT基因家族成员的染色体定位和基因结构分析

在NCBI数据库下载鸡的基因组注释gff文件，确定鸡SIRT基因家族成员在染色体上的分布情况及其外显子和内含子位置信息，最后利用TBtools软件对鸡SIRT基因家族的染色体位置和基因结构进行可视化分析.

1.2.3 不同物种SIRT基因家族成员的序列比对分析和系统发育树构建

在NCBI数据库下载人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）以及猪（Sus scrofa）的SIRT基因家族的蛋白序列，利用MEGA11.0软件对鸡以及上述SIRT蛋白序列进行多重序列比对，并利用Neighbor-joining方法（Bootstrap参数为1 000）构建系统发育树.

1.2.4 SIRT基因家族的保守结构域分析

利用MEME在线软件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析人、小鼠、牛、猪和鸡SIRT蛋白的保守模体（Motif），最大模体数设置为15，最后使用TBtools软件对结果进行可视化分析.

1.2.5 SIRT基因家族的共线性分析

利用人、小鼠、牛、猪以及鸡的基因注释文件和基因组序列文件通过TBtools软件中的MCScanX插件对人、小鼠、牛、猪和鸡SIRT基因家族成员进行物种间共线性分析，并对鸡SIRT基因家族成员进行物种内共线性分析.

1.2.6 鸡SIRT基因家族成员的互作网络分析

利用STRING数据库预测鸡SIRT基因的互作网络，然后使用Cytoscape软件对互作网络进行可视化分析.

1.2.7 鸡SIRT基因家族成员的转录组表达分析

按照Trizol试剂盒（Invitrogen）说明书提取藏鸡和大恒肉鸡腿肌组织的总RNA，构建文库后进行转录组测序，对SIRT基因家族成员在藏鸡和大恒肉鸡腿肌组织中的表达情况进行分析.

2 结果

2.1 鸡SIRT基因家族成员的鉴定及理化性质分析

通过NCBI和Pfam对鸡SIRT基因家族成员进行鉴定，最终获得8个鸡SIRT基因家族成员（表1）.对8个鸡SIRT基因进行理化性质分析（表2），结果表明鸡SIRT家族成员蛋白序列长度在309～756 aa之间，分子量在33 956.02～82 716.11 kD之间，等电点介于4.69～9.75之间，其中Gga-SIRT1、Gga-SIRT2a和Gga-SIRT2蛋白呈酸性（pI<7.0），其余家族成员蛋白呈碱性（pI>7.0），不稳定系数在35.89～73.15之间，脂肪指数在70.26～87.66之间，亲水性平均系数均为负值，表明SIRT蛋白均为亲水性蛋白.

2.2 鸡SIRT基因家族成员的染色体分布和基因结构分析

如图1所示，8个鸡SIRT基因家族成员分布在鸡的7条染色体上.Gga-SIRT1含有9个外显子，Gga-SIRT2a含有14个外显子，Gga-SIRT2含有13个外显子，Gga-SIRT3、Gga-SIRT5和Gga-SIRT6含有8个外显子，Gga-SIRT4含有4个外显子，Gga-SIRT7含有10个外显子.

2.3 不同物种SIRT基因家族系统发育树构建

由图2可知，有33个保守氨基酸存在于SIR2保守结构域中，其中氨基酸序列“GAGIST”“GIPDFR”和“TQNID”在人、小鼠、牛、猪以及鸡5个物种内保守性更强.此外，一些保守性强的氨基酸残基也在SIR2保守结构域中被检测到，表明他们对SIRT基因家族功能的重要性.

为进一步探究SIRT基因家族的起源和进化，基于人、小鼠、牛、猪以及鸡5个物种的SIRT基因蛋白序列，在多重序列比对的基础上构建系统进化树，结果将SIRT基因家族分为7个亚族（图3），不同物种的相同基因均分布于相同的亚族中，表明SIRT基因家族在不同的物种中具有较高的同源性.

2.4 SIRT基因家族的保守结构域分析

利用MEME数据库对SIRT基因家族成员的保守模体（Motif）进行分析，以15个Motif作为查询上限，结果如图4所示，亲缘关系近的SIRT基因家族成员模体结构相似程度更高，其中Motif 3、Motif 1、Motif 7、Motif 15、Motif 4和Motif 5在组成和顺序上保持一致，具有较高的保守性，共同构成SIRT基因家族的保守结构域.其余模体则在部分SIRT基因家族成员中有所缺失.

2.5 SIRT基因家族的共线性分析

对鸡染色体上的7个SIRT基因进行共线性分析，结果显示7个SIRT基因间无共线性关系.对人、小鼠、牛、猪和鸡SIRT基因家族成员进行物种间共线性分析（图5），其中鸡与人和小鼠基因组均有3对同源基因，与猪和牛则存在4对同源基因.

2.6 鸡SIRT基因家族成员的互作网络

为了更好地理解SIRT基因的生物学功能和调控网络，对SIRT基因的互作网络进行了预测（图6）.结果显示，14个功能基因被预测与7个SIRT基因具有潜在的相互作用.

2.7 鸡SIRT基因家族成员的表达分析

为比较鸡SIRT基因家族成员的表达模式，对藏鸡（TC）和大恒肉鸡（DH）胚胎不同发育时期的腿肌组织进行了转录组测序，并分析了SIRT基因的表达情况（图7）.结果显示，SIRT基因家族成员在不同发育时期的腿肌中均有表达，其中，SIRT1、SIRT2、SIRT5、SIRT6和SIRT7基因的表达量随着藏鸡胚胎的发育持续下调，SIRT3和SIRT4基因则呈现先下调后上调的趋势.SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT6和SIRT7基因在藏鸡胚胎发育第18 d（TC-E18）时的表达量要低于发育相同时间大恒肉鸡胚胎（DH-E18），SIRT3和SIRT5基因的表达量则在TC-E18中要高于DH-E18.

3 讨论

SIRT蛋白是一类进化保守的NAD⁺依赖性脱酰基酶家族，几乎在所有的物种中都能够检测到1种或多种SIRT蛋白的存在.本研究利用SIRT蛋白的核心结构域SIR2在鸡基因组中鉴定出8个SIRT基因，其中SIRT2a是SIRT2的可变剪切体.SIR2最初在啤酒酵母中被发现^［31］，后续的功能研究证实SIR2是一个古老但功能保守的基因，现在科学界统一将这类蛋白质命名为Sirtuin.从酵母中的SIR2蛋白质逐渐进化发展到鸡等哺乳动物的7个SIR2同源蛋白，是在保留SIR2生物学功能的同时，对其在生物体内功能的进一步扩展.

系统进化树结果显示，鸡SIRT基因家族分为7个亚族，不同物种的相同基因均分布于相同的亚族中，说明SIRT基因家族在物种进化形成前就已形成.7个亚族基因聚成4个类群，SIRT1、SIRT2和SIRT3聚为一支，SIRT4和SIRT5分别聚为一支，SIRT6和SIRT7聚为一支，这与前人对真核生物中SIRT蛋白的分类保持一致^［6］.

SIRT蛋白互作网络显示，14个功能基因被预测与7个SIRT基因具有潜在的相互作用.FOXO1和FOXO3是叉头蛋白（forkhead box protein O，FOXO）转录因子大家族O亚家族的重要成员，广泛表达于多种器官组织^［32］.作为一类重要的自噬调控因子，FOXO的活性主要受到SIRT1的去乙酰化调节^［33］.SIRT1-FOXO自噬通路广泛存在于肝、脂肪、脑、心等多种器官组织^［34］.从SIRT蛋白互作网络图可以看出，除SIRT1外，SIRT基因家族其他成员也可能对FOXO自噬信号具有调控作用.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（Nicotinamide adenine dinucleotide kinase，NADK）催化NAD⁺磷酸化生成NADP⁺，NADP⁺进一步被还原生成NADP（H），而NAD⁺可以作为SIRT蛋白的供体和底物，在细胞氧化还原稳态和代谢过程中具有重要作用^［35］，因此，推测NADK可能通过直接调控NAD⁺的代谢水平，进而间接影响SIRT蛋白的活性.除NADK外，NADK2也被预测可与SIRT蛋白互作，有研究表明，NADK2是生物合成NADP（H）所必需的酶，动物线粒体中NADP（H）合成的独特调节是通过NADK2的结构适应实现的^［36］. CD38酶是一种多功能酶，能够合成第二信使cADPR、NAADP.研究表明，CD38可调节SIRT1酶的活性，在CD38敲除小鼠中，组织中NAD的水平显著升高，核提取物中SIRT1的内源性活性显著性上升^［37］，蛋白互作网络也预测CD38可与其他SIRT蛋白相互作用，这则有待于更深入的研究.

为探讨SIRT基因对鸡胚胎生长发育的调控作用，本研究利用转录组数据对鸡胚胎不同发育时期7个SIRT基因进行了分析.结果显示，7个SIRT基因在鸡胚胎发育的不同阶段均有表达，SIRT1、SIRT2、SIRT5、SIRT6和SIRT7基因的表达量随着鸡胚胎的发育持续下调，SIRT3和SIRT4基因则呈现先下调后上调的趋势.在胚胎发育阶段，Sirtuin基因家族成员在心脏、脊髓、背侧神经节中大量表达，这提示Sirtuin在各组织、器官和个体的发育中具有重要的作用^［38-41］，SIRT基因家族各成员在鸡胚胎早期阶段的高水平表达，推测其在鸡胚胎发育的早期阶段具有重要作用.黎镇晖等人利用快大型肉鸡和慢速型肉鸡的胸肌组织进行转录组测序，发现SIRT2和SIRT6基因在快大型肉鸡中显著上调^［30］，推测其在鸡肌肉发育的过程中具有重要功能.同时，也有人发现染料木素可通过激活SIRT1-AMPK信号通路抑制鸡肝细胞中的脂滴积累，从而减少肉鸡中过多的脂肪积累^［42］.

本研究的局限性主要在于分析结果基于生物信息学预测，尚未通过qPCR实验对SIRT基因的表达模式进行验证.同时，目前有关SIRT蛋白在鸡中的研究还比较少，因此，后续还需要进一步探讨SIRT蛋白家族各成员在鸡生长发育过程中的功能，以期为揭示SIRT蛋白对鸡生长发育的调控机制提供依据.

4 结论

本研究从鸡全基因组中鉴定出8个SIRT基因，其中SIRT2a是SIRT2的可变剪切体.生物信息学分析发现SIRT基因家族分布在鸡的7条染色体上，在结构上具有相似的蛋白基序，且均含有SIR2保守结构域.14个功能基因被预测与7个SIRT基因具有潜在的相互作用.通过转录组测序进一步明确SIRT基因家族各成员在鸡胚胎不同发育时期的表达模式，为后续对鸡SIRT基因家族成员结构和功能的研究奠定基础.

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基金资助

四川省科技计划项目(2021YFYZ0031)

西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(ZYN2022021)