毛肋杜鹃与爆杖花质量标准及体外活性研究

Quality standard and in vitro activity of Rhododendron augustinii Hemsl. and Rhododendron spinuliferum Franch.

摘要

通过对比毛肋杜鹃与爆杖花的原植物形态、性状特征（包括花色、花冠形态和叶质地）、显微结构（如韧皮纤维排列和木栓层结构）以及常规检查指标（水分、灰分、浸出物等），进一步采用DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS（2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）自由基清除法评估抗氧化活性，同时以铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌为指标菌测定抗菌活性，综合评价二者质量差异及其作为山踯躅药材基原植物的可行性.结果表明，毛肋杜鹃与爆杖花在基原特征和质量指标上存在显著差异，其中毛肋杜鹃在0.25 mg·mL^-1浓度下对ABTS自由基的清除率显著高于爆杖花，且其正丁醇和水提取物对表皮葡萄球菌表现出抑制作用（MIC分别为154.1 μg·mL^-1和308.2 μg·mL^-1），而爆杖花未显示显著抗菌活性.基于上述差异，研究认为爆杖花不宜作为山踯躅药材的基原植物使用，建议在临床应用时严格区分二者，以确保用药的安全性和有效性.

Abstract

This study compared the original plant morphology， trait characteristics （including flower color， corolla architecture， and foliar texture）， microscopic structures （such as phloem fiber patterns and cork layer configuration）， and routine inspection indexes （moisture， ash content， and extractives） of Rhododendron augustinii Hemsl. and Rhododendron spinuliferum Franch. The antioxidant activity was assessed by adopting DPPH （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） and ABTS （2，2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt） free radical scavenging assays， while antibacterial activity was tested against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis as indicator bacteria. Additionally， the quality distinctions between the two plant species were comprehensively compared， with their feasibility as original medicinal plants of Rhododendron simsii herbal medicine evaluated. The results revealed significant distinctions between the two species： R. augustinii Hemsl. exhibited significantly stronger ABTS free radical scavenging capacity at the concentration of 0.25 mg·mL^-1 than R. spinuliferum Franch.， and its n-butanol and aqueous extracts exhibited inhibitory effects against Staphylococcus epidermidis， with MIC values of 154.1 μg·mL^-1， and 308.2 μg·mL^-1， respectively， whereas R. spinuliferum Franch. showed no significant antibacterial activity. Based on the above distinctions， it was concluded that R. spinuliferum Franch. was not suitable to be employed as the original plant of R. simsii medicinal material. It was recommended to strictly distinguish the two species in clinical applications to ensure the safety and efficacy of medication.

Graphical abstract

关键词

毛肋杜鹃 / 爆杖花 / 质量标准 / 抗氧化 / 抗菌

Key words

R. augustinii Hemsl. / R. spinuliferum Franch. / quality standard / antioxidant activity / antibacterial activity

山踯躅药用历史悠久，在《名医别录》《晶珠本草》《本草纲目》《中国民族药辞典》《羌族医药》等均有记载，具有止咳平喘、祛痰开窍的功效，临床用于治疗慢性气管炎及骨科疾病^［1-3］.现代药理研究表明，杜鹃属植物富含黄酮类、生物碱等活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、祛痰、止咳、平喘等多种药理作用^［4-8］，并且在止咳平喘方面应用广泛，已开发出消咳喘糖浆、咳喘平糖浆等代表性制剂^［9-10］.然而，历版《中国药典》和地方标准中均未收载山踯躅药材的质量标准；在制定四川省民族药材标准调研中，发现杜鹃花科毛肋杜鹃（Rhododendron augustinii Hemsl.）与爆杖花（R.spinuliferum Franch.）的干燥带叶及花的茎枝在临床实践中常被混用作“山踯躅”.两种植物是否可以作为山踯躅药材多基原同等入药，亟需开展系统研究，以确保临床用药的安全、有效、稳定、可控.

近年来，关于山踯躅的药效物质基础研究仍较为有限，现有研究多基于杜鹃属植物的共性成分进行推测性分析.现有研究表明，杜鹃属植物普遍富含黄酮类、二萜类及挥发油等活性成分^{［7，11-12］}，这些成分在体外实验中显示出显著的抗炎、抗氧化，以及对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用^［13-15］，可能与其传统功效“止咳平喘、祛痰开窍”密切相关.其中，黄酮类成分可通过抑制气道炎症反应和支气管平滑肌痉挛发挥平喘作用^［16-17］；二萜类化合物则可能通过调控黏液分泌实现祛痰功效^［18］；而部分挥发性成分的胆碱能调控作用可能与其开窍醒神的传统功效相关联^［19］.

目前，毛肋杜鹃已被《四川省中药材标准》（2022年版）收载^［20］，而爆杖花缺乏规范的质量标准和药效学依据.鉴于药材基原、药用部位及生产工艺等因素会显著影响其化学成分组成与质量^［21-23］，亟需对这两种植物开展系统的对比研究，因此，本研究通过对比原植物特征、性状、显微结构、常规质量指标（水分、灰分、浸出物等）及药理活性（抗氧化、抗菌），旨在明确其异同，为基原鉴别、质量评价及临床合理应用提供科学依据，以保障民族药的安全性与有效性.

1 仪器与试药

1.1 仪器

Axioscope 5正置光学显微镜及成像系统（德国蔡司公司）；SP-30E型全自动薄层色谱点样仪（上海科哲生化科技有限公司）；Goodlook-1000型薄层色谱成像系统V3.1（上海科哲生化科技有限公司）；Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters科技公司）；ME55E/02十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）.

1.2 试药

DPPH（纯度≥99%，批号：2010289，成都康邦生物科技有限公司）；ABTS（纯度≥98%，批号：20112801，成都康邦生物科技有限公司）；L-抗坏血酸（纯度≥99%，批号：B21293，成都市科隆化学品有限公司）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，批号：BNCC220524）；肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，编号：BNCC278691）；PAO1铜绿假单胞菌（PAO1 Pseudomonas aeruginosa，编号：BNCC360090，北纳联创生物科技有限公司）；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，编号：BNCC335516，北纳联创生物科技有限公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯.

1.3 样品

样品采自四川省阿坝藏族羌族自治州和凉山彝族自治州.经西南民族大学青藏高原研究院刘圆教授和药学与食品学院李莹副教授鉴定为杜鹃花科杜鹃花属毛肋杜鹃（R.augustinii Hemsl.）和爆杖花（R.spinuliferum Franch.）的干燥带叶及花的茎枝.共收集药材27批，其中毛肋杜鹃基原植物的药材22批，爆杖花基原植物的药材5批，具体药材信息见表1.

2 方法与结果

2.1 毛肋杜鹃和爆杖花基原鉴别的比较

分别取毛肋杜鹃和爆杖花的原植物进行观察和描述，选择植株各部位进行拍摄（图1、图2）.毛肋杜鹃花色为淡紫色，花冠宽漏斗状，叶片近革质，沿中脉密被黄白色柔毛；而爆杖花花色为鲜红色至橙红色，花冠筒状，叶片坚纸质，下面密被灰白色柔毛和鳞片.二者在花色、花冠形态及叶片质地上差异显著.毛肋杜鹃株高1~5 m，叶片长3~7 cm，宽1~3.5 cm，伞形花序顶生，具2~6花；爆杖花株高0.5~3 m，叶片长3~11 cm，宽1.8~3.2 cm，花数4朵.毛肋杜鹃的叶片长度和宽度均值分别为爆杖花的0.8倍和1.1倍，而花序花数显著多于爆杖花.基于上述特征，编制毛肋杜鹃与爆杖花基原检索表（见表2）.

2.2 毛肋杜鹃和爆杖花药材的性状鉴别比较

取毛肋杜鹃和爆杖花药材进行观察和描述（图3~4），结果见表3.结果表明，毛肋杜鹃与爆杖花在茎的质地、叶的形态及表面特征、花的形态以及气味等方面存在显著差异.毛肋杜鹃的茎质硬，叶革质且反卷，花冠宽漏斗状，气味苦涩；而爆杖花的茎质脆，叶纸质且平展，花冠筒状，气味淡.

2.3 毛肋杜鹃和爆杖花药材显微特征的比较

按照《中国药典》2020年版四部通则2001显微鉴别法，对毛肋杜鹃和爆杖花的茎、叶及粉末进行显微观察（图5~图10），比较二者的茎横切面、叶横切面及粉末显微特征（表4）.结果表明，毛肋杜鹃与爆杖花在显微特征上存在显著差异.毛肋杜鹃的韧皮纤维为1列，具有明显的木栓层，皮层中未见导管分布，表皮无乳状凸起，且韧皮部与木质部宽度相近；而爆杖花的韧皮纤维为2~3列，无木栓层结构，皮层中散在分布导管，表皮具有乳状凸起特征，韧皮部与木质部的宽度比例不均.这些显微特征的差异为两种药材的鉴别提供了可靠的依据.

2.4 薄层色谱鉴别

按照《中国药典》2020年版四部通则0502薄层色谱法实验，考察不同提取方式、提取溶剂、提取时间、料液比、不同展开剂和不同薄层板，建立以槲皮苷为对照品的毛肋杜鹃与爆杖花的薄层色谱鉴别方法.

2.4.1 供试品溶液制备

分别取毛肋杜鹃和爆杖花粉末各1 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，加入25 mL乙醇，超声处理30 min，过滤，即得.

2.4.2 对照品溶液制备

精密称定槲皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液.

2.4.3 色谱条件

薄层板：聚酰胺薄膜.

点样量：供试品溶液和对照品溶液各5 µL.

展开剂：甲醇-甲酸-水（18∶1∶1）.

显色剂：三氯化铝试液.

2.4.4 测定结果

10批毛肋杜鹃和5批爆杖花药材的薄层色谱图中（图11），10批毛肋杜鹃中有5批在与槲皮苷对照品相应的位置显清晰的黄色荧光斑点，分离度良好；而5批爆杖花中有4批在相同位置也观察到相似的荧光斑点，但斑点颜色较浅或大小略异.

2.5 水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物的测定

分别参照《中国药典》2020年版四部通则0832水分测定法、2302灰分测定法、2201浸出物测定法，对27批毛肋杜鹃和爆杖花样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物含量进行测定，结果见表5.结果表明，毛肋杜鹃与爆杖花在水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物含量上存在一定差异.毛肋杜鹃的水分含量为7.90%~11.82%（均值为9.43%），爆杖花的水分含量为8.16%~10.75%（均值为9.43%），P=0.682，差异无统计学意义（P>0.05），表明两者水分含量相近；毛肋杜鹃总灰分为2.50%~5.78%（均值为3.90%），酸不溶性灰分为0.90%~2.43%（均值为1.30%），醇溶性浸出物为11.00%~29.05%（均值为20.14%）；而爆杖花的总灰分为3.26%~4.24%（均值为3.83%），酸不溶性灰分为0.53%~1.50%（均值为1.23%），醇溶性浸出物为20.26%~33.73%（均值为26.60%）.爆杖花在醇溶性浸出物含量上显著优于毛肋杜鹃（P<0.001），毛肋杜鹃的总灰分和酸不溶性灰分个别批次偏高，需关注其无机杂质控制.本研究为两种药材的质量标准制定提供了数据支持，为两种药材的质量控制提供了重要依据.

2.6 体外抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH自由基清除率的测定

将毛肋杜鹃和爆杖花的醇提取液分别配制成7.81×10^-4 mg·mL^-1、1.56×10^-3 mg·mL^⁻1、3.13×10^⁻³ mg·mL⁻¹、6.25×10⁻³ mg·mL^⁻1、1.25×10⁻² mg·mL^⁻1的样品溶液，精密移取各溶液100 μL于孔板中，每个样品浓度设置3个重复孔，加入100 μL 0.2 mmol·L⁻¹ DPPH甲醇溶液，混匀后避光反应30 min.以甲醇为空白对照，517 nm波长下测定吸光度（A）.同时以抗坏血酸（VC）为阳性对照（浓度梯度：7.81×10^-4~1.25×10⁻² mg·mL^-1）. DPPH自由基清除率按公式（1）计算：

清除率=-⁃\left(\mathrm{1}-\frac{Ad-Ax}{Ac}\right)×100%.（1）

结果表明，毛肋杜鹃和爆杖花对DPPH自由基的清除能力呈剂量依赖性.当浓度达到0.062 5 mg·mL^-1 时，两者清除率均超过90%，与VC（0.025 mg·mL^-1）相当（图12）.

2.6.2 ABTS自由基清除率的测定

取不同浓度样品溶液（0.025、0.05、0.1、0.25 mg·mL^-1）25 μL，加入175 μL ABTS工作液，混匀后避光反应10 min，734 nm波长下测定吸光度，以VC（0.000 781 25~0.25 mg·mL^-1）为阳性对照.清除率按公式（1）计算.结果显示，毛肋杜鹃在0.25 mg·mL^-1时的清除率为95.2%，显著高于爆杖花的87.6%（P<0.05），与VC（0.025 mg·mL^-1）相当（图13）.

2.7 体外抗菌活性测定

将毛肋杜鹃和爆杖花的不同极性部位（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）提取物用DMSO溶解，LB液体培养基稀释成0.192 6~6.163 2 mg·mL^-1的样品溶液.取10 μL样品溶液加入96孔板，加入190 μL菌悬液（铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌），每个浓度设置3个重复孔，37 ℃培养12 h后观察抑菌效果.结果显示，毛肋杜鹃正丁醇部位（154.1 mg·mL^-1）和水部位（308.2 mg·mL^-1）对表皮葡萄球菌具有抑菌活性，其余部位及爆杖花各部位均未表现出显著抗菌活性.

3 讨论与结论

本研究通过系统对比毛肋杜鹃与爆杖花的原植物及显微特征，发现二者存在显著差异.毛肋杜鹃花色为紫色，花冠宽漏斗状，叶片近革质且沿中脉密被黄白色柔毛；而爆杖花花色为红色，花冠筒状，叶片坚纸质且下面密被灰白色柔毛和鳞片.显微特征上，鳞片大小（毛肋杜鹃的鳞片大，直径500~750 μm，爆杖花的鳞片小，直径92~215 μm），茎的木栓层（爆杖花有明显木栓层，毛肋杜鹃仅残存表皮），上表皮结构（爆杖花为复表皮且角质层厚，毛肋杜鹃为单层细胞），存在显著差异.理化性质分析结果显示，毛肋杜鹃与爆杖花的水分含量（P=0.682）、总灰分（P=0.451）和酸不溶性灰分（P=0.437）均无统计学差异（P>0.05）.然而值得注意的是，毛肋杜鹃的灰分波动范围更大，且部分批次酸不溶性灰分较高（如S9达2.43%），提示可能存在更多无机杂质^［24］.在醇溶性浸出物含量方面，二者差异极显著（P<0.001），爆杖花的含量显著高于毛肋杜鹃，提示其可能含有更多可溶性活性成分^［25］.

课题组前期采用HPLC分析了山踯躅中有抗菌活性的黄酮类成分且含量较高的几种成分（绿原酸、木犀草苷和槲皮苷），其中槲皮苷的含量相对最高.薄层色谱（TLC）考察表明，槲皮苷的斑点最清晰、稳定，可见性与重现性最佳，因此选择槲皮苷作为质控指标.在5批爆杖花中4批在相同位置观察到荧光斑点，但颜色较毛肋杜鹃的斑点浅且小，故槲皮苷不宜作为区分两种药材的特征性成分^［26］，可进一步针对二者的TLC鉴别考察其他成分^［27］，提升鉴别的准确性和特异性.薄层板考察过程中，比较了薄层色谱硅胶G板、H板和聚酰胺薄膜板的耐用性情况，结果表明不同厂家的聚酰胺薄膜板的效果均良好.

在药理活性方面，毛肋杜鹃表现出更优的抗氧化和抗菌活性.其在0.25 mg·mL^-1浓度时对DPPH和ABTS自由基的清除率显著高于爆杖花；其正丁醇和水部位对表皮葡萄球菌的MIC分别为154.1 μg·mL^-1和308.2 μg·mL^-1，而爆杖花各部位均无显著抗菌效果.这些结果表明毛肋杜鹃在药理活性上更具优势，可能与其含有更高含量的活性成分相关^［28］.本研究表明，尽管爆杖花的醇（70%乙醇）溶性浸出物含量显著高于毛肋杜鹃，但其体外抗菌活性却明显低于后者.这说明抗菌活性并非与醇溶性浸出物总量正相关，而更取决于活性成分的极性分布^［29］；爆杖花虽产出较多浸出物，却缺乏显著抑菌作用.因此，成分的极性特征是决定两种药材抗菌效力的关键因素^［30］.

综上，毛肋杜鹃与爆杖花在原植物性状、显微特征、含量测定及药理活性方面均存在显著差异，两者不宜作为同一基原药材使用，临床应用中应严格区分，以保障用药安全与疗效.基于上述证据，毛肋杜鹃被确定为山踯躅的唯一正品基原，并已收录于《四川省中药材标准》（2022年版）中^［20］.后续研究可进一步分离鉴定两者的活性成分^［31］，并通过体内实验验证其药效差异^［32］，为民族药的规范化应用提供更全面的科学依据^［33］.

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基金资助

四川省药品监督管理局中药（民族药）标准提升项目(510201202102305)

西南民族大学“双一流”项目(CX2023050)