山羊YWHAB基因克隆及生物信息学分析

Cloning and bioinformatics analysis of goat YWHAB gene

摘要

旨在克隆山羊YWHAB基因后结合生物信息学分析，为进一步探究该基因的功能奠定基础.试验采用Trizol法提取山羊鼻甲骨细胞总RNA并反转录为cDNA，作为模板成功克隆获得山羊YWHAB基因，并对测序鉴定正确的YWHAB基因序列进行生物信息学分析.结果显示，所获得的山羊YWHAB基因序列全长973 bp（GenBank登录号：PP453721.1），其中CDS区为741 bp，编码246个氨基酸；该蛋白分子量为28 082.40 Da，属于酸性不稳定亲水蛋白，无信号肽和跨膜区；修饰位点分析表明，该蛋白含有3个N-糖基化位点、31个O-糖基化位点及42个磷酸化位点；二级结构预测显示，α-螺旋占比68.70%，无规则卷曲为21.95%，延伸链和β-转角分别占8.54%和0.81%；亚细胞定位预测表明，该蛋白主要分布于细胞质（约占72%），细胞核和线粒体分别约占17%和11%；蛋白互作预测提示，YWHAB可能与FOXO3、TFEB、YAP1等10个蛋白存在相互作用；基于YWHAB基因序列构建的系统进化树显示，与山羊亲缘关系最近的物种为绵羊，其次依次为牛、鹿、羊驼和猪.本研究成功克隆了山羊YWHAB基因并进行生物信息学分析，为后续研究YWHAB基因在山羊鼻甲骨细胞中的调控机制及功能提供参考.

Abstract

This study aimed to clone the goat YWHAB gene and conduct bioinformatics analysis， so as to provide a foundation for further functional studies. Total RNA was extracted from goat turbinate cells using the Trizol reagent and reverse-transcribed into cDNA， which was used as a template to successfully clone the goat YWHAB gene. Bioinformatics analysis was then performed on the YWHAB gene sequence that was correctly identified by sequencing. The results showed that the obtained sequence was 973 bp in length （GenBank accession No. PP453721.1）， containing a 741 bp coding sequence （CDS） that encoded 246 amino acids. The encoded protein， with a molecular weight of 28 082.40 Da， was acidic， unstable， and hydrophilic， and lacked a signal peptide and transmembrane domains. Modification site analysis revealed three N-glycosylation sites， 31 O-glycosylation sites， and 42 phosphorylation sites. Secondary structure prediction showed that α-helices accounted for 68.70%， random coils for 21.95%， extended strands for 8.54%， and β-turns for 0.81%. Subcellular localization prediction indicated that the protein was mainly distributed in the cytoplasm （approximately 72%）， which was followed by the nucleus （17%） and mitochondria （11%）. Protein-protein interaction prediction suggested that YWHAB might interact with ten proteins， including FOXO3， TFEB， and YAP1. Phylogenetic analysis based on the YWHAB gene sequence showed that sheep was the species having the closest relationship with goat， followed by cattle， deer， alpaca， and pig. In conclusion， the goat YWHAB gene was successfully cloned and bioinformatically analyzed， providing a reference for future studies on its regulatory mechanisms and functions in goat turbinate cells.

Graphical abstract

关键词

山羊 / YWHAB / 基因克隆 / 生物信息学分析

Key words

goat / YWHAB / gene cloning / bioinformatics analysis

羊传染性脓疱（俗称“羊口疮”，Orf）是由羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）感染引起的一种重要人兽共患病，在山羊和绵羊中传播迅速、分布广泛^［1］.目前该病主要依靠疫苗接种防控，但仍存在“返毒”现象^［2］.因此，深入解析ORFV与宿主相互作用的分子机制，是突破其“难防难治”困境的关键.病毒的生命周期高度依赖于劫持宿主的细胞因子和信号通路，有研究表明ORFV编码的蛋白通过与宿主蛋白发生相互作用^［3］，在病毒入侵、复制及免疫逃逸中发挥关键作用.然而， ORFV如何调控宿主细胞的核心信号网络，仍是当前研究的薄弱环节.

14-3-3蛋白家族是一种广泛存在于真核细胞中的酸性蛋白，最初被认为是一种激活神经递质合成的信号分子^［4］，在哺乳动物大脑中含量丰富，对细胞信号传导、细胞生长和细胞凋亡等多种生物学功能具有重要作用^［5］.已知的哺乳动物14-3-3蛋白有7种（β、γ、ε、η、ζ、σ和τ/θ）异构体，这些异构体有较高的同源性，是一类较为保守的蛋白家族^［6］. YWHAB编码的14-3-3β是14-3-3家族中重要成员之一，在蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络起到了关键作用^［7］，是重要的信号转导因子，可以与一系列蛋白激酶、磷酸酶和其他信号蛋白相互作用，还可以与DNA相互作用调节DNA复制的起始^［8］，其参与细胞周期、凋亡调控等多种生物学过程，并与恶性肿瘤的增殖和活力相关^［9］.2013年，Yang Zhang等提出YWHAB可能参与了肝癌转移^［10］，同年，Chengshan Xu等发现，肺癌患者血清中YWHAB表达上调，YWHAB作为microRNA-129-5p（MiR-129-5p）的下游靶点，二者表达呈显著负相关，MiR-129-5p被认为在调节肺癌细胞的增殖和迁移中有重要作用，其过表达引起YWHAB表达量降低，从而促进肺癌细胞凋亡^［11］，2023年，Kellie Gallo等发现，敲低YWHAB表达可以显著抑制胶质母细胞瘤增殖，这可能是由于14-3-3β的缺失引起肿瘤抑制因子P27表达增加造成的^［12］.PI3K调控亚基2（PIK3R2）是PI3K/AKT信号通路的激活子，在多种癌细胞中调控细胞增殖和凋亡，2023年，Xin Zhou等提出，YWHAB可以通过与PIK3R2结合影响结肠癌细胞的增殖、周期与凋亡，抑制YWHAB表达可以抑制结肠癌细胞的增殖，促进该细胞的凋亡并使细胞周期阻滞于G0/G1期^［13］.2021年，Linlin Ji等发现YWHAB在体内外调节葡萄糖代谢中起到关键作用，YWHAB通过对FOXO1的调节参与胰高血糖素受体（Glucagon receptor，GCGR）激活通路，从而抑制肝细胞进行糖异生^［14］.值得注意的是，YWHAB在病毒感染过程中亦扮演重要角色.2019年，侯玉凤指出，YWHAB可抑制PCV2感染引起的细胞凋亡、自噬和内质网应激等反应^［15］，2020年，Kangkang Guo研究发现YWHAB抑制PCV2的复制^［16］.本实验室前期研究显示，ORFV129蛋白可与宿主蛋白C1QBP相互作用，而C1QBP本身也能与YWHAB结合，并可在一定程度上抑制ORFV复制^［17］.这提示我们，作为其互作蛋白的YWHAB，也可能作为ORFV与宿主互作网络中的关键节点，参与了病毒感染过程.此外，目前尚无关于山羊YWHAB基因功能的相关报道.因此，本研究以山羊鼻甲骨细胞为材料，成功克隆获得山羊YWHAB基因序列，并对其进行系统的生物信息学分析，旨在为后续揭示YWHAB在ORFV感染过程中的分子机制，以及解析该基因在山羊中的生物学功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 山羊鼻甲骨细胞的复苏及培养

在四川省简阳市大哥大牧业有限公司随机选购一只健康的2日龄雄性羔羊，于接回次日对羔羊实施安乐死，并无菌采集其鼻甲骨组织，随后采用组织块法培养，成功获得原代山羊鼻甲骨细胞^［18］.所有操作遵循实验动物伦理规范并获批准.

1.1.2 主要试剂与仪器

T4 DNA连接酶购自北京宝日医生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自北京天根生化公司；克隆载体pMD19-T、2×T5 Super PCR Mix（Colony）和DH5α感受态细胞购自擎科生物成都分公司；总RNA提取试剂Trizol、反转录试剂盒及PCR仪购自赛默飞世尔科技公司；DNA分子量标准（DL2000）与筛选用氨苄青霉素购自兰杰柯科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 山羊原代鼻甲骨细胞总RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取山羊原代鼻甲骨细胞的总RNA，并检测其浓度与纯度.要求RNA浓度不低于200 ng/μL，且OD260/OD280比值介于1.8~2.0之间.测定RNA浓度后，取4 ng RNA按以下步骤进行反转录：第一步：将4 ng RNA、1 μLOligo （dt）18 Primer，超纯水补至11 μL后，充分混匀，PCR仪65 ℃孵育5 min，第二步：向上一步产物加入4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL RiboLock^TM、2 μL 10 mM dNTP，最后加入1 μL Revert Aid^TM充分混匀，PCR仪42 ℃孵育1 h，再70 ℃孵育5 min.反应结束后，产物cDNA存于-20 ℃冰箱，以供后续扩增试验使用.

1.2.2 山羊YWHAB基因扩增以及产物回收

以GenBank中山羊YWHAB基因预测序列（XM_018057913.1）作为参考，通过Primer Premier 5.0软件设计特异性引物一对PMD19-YWHAB-F：TGCTCGCAAGGTTC；PMD19-YWHAB-R：TGCCGTGGCATTTA，由成都生工生物工程有限公司合成.以1.2.1中保存的cDNA为模板进行PCR扩增反应，PCR反应体系如下：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL，最后加超纯水补至25 μL.扩增步骤：第一步进行3 min的预变性（95 ℃）；第二步共计循环35次，包括变性、退火、延伸（95 ℃ 30 s， 47 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min）；最后进行5 min的终延伸（72 ℃），4 ℃保存反应产物.扩增结束后，取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，使用胶回收试剂盒对目的条带进行纯化回收，分光光度计测定其浓度.

1.2.3 pMD19-YWHAB的连接及转化

取1.2.2获得的胶回收产物，与pMD19-T载体进行连接，连接反应体系如下：pMD19-T 0.5 μL（约25 ng）、胶回收产物4.5 μL、Solution Ⅰ 5 μL轻柔混匀，置于金属浴中16 ℃连接12 h.将上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中，随后挑取单菌落在加入5 μL超纯水的PCR管中进行稀释，取1 μL稀释菌液作为模板，使用1.2.2所述的引物与PCR反应程序进行扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行初步鉴定，将鉴定为阳性的3个单菌落扩大培养，同步送至成都生工生物公司进行双向测序.将测序对比正确的菌落命名为pMD19-YWHAB，并与等体积的50%甘油溶液混合，于-80 ℃保存.

1.2.4 山羊YWHAB基因的生物信息学分析

对山羊YWHAB蛋白进行全面的生物信息学特征分析，以系统了解其结构特征与潜在功能.首先，利用ExPASy的ProtParam工具对YWHAB蛋白的基本理化参数（分子量、等电点、氨基酸组成及半衰期）进行评估.通过ProtScale程序系统分析该蛋白的亲疏水特性，识别其潜在疏水区域.同时，使用EBI检测其蛋白信号肽是否存在.采用TMHMM Server v.2.0预测跨膜结构，分析其是否为跨膜蛋白.通过NetPhos 3.1预测丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点，分析其潜在的修饰调控机制.应用NetNGlyc 1.0和YinOYang 1.2工具分别预测N-连接与O-连接糖基化修饰位点.对于蛋白质高级结构，采用SOPMA解析二级结构组成（α-螺旋、β-折叠和无规卷曲），并通过SWISS-MODEL构建三维空间结构模型.采用MEGA 5软件构建系统发育树，评估其在进化过程中与绵羊（XM_027 977 229.3）、牛（NM_174 794.2）、猪（XM_005 672 961.3）、鹿（XM_043 882 906.1）和羊驼（XM_072 944 287.1）的保守性与亲缘关系.最后，利用STRING数据库挖掘山羊YWHAB蛋白的相互作用网络，探寻其可能的功能伙伴与参与的信号通路.

2 结果

2.1 山羊YWHAB基因的克隆及鉴定

试验成功获得连接转化后的阳性克隆，经PCR及凝胶电泳验证，其扩增产物与山羊YWHAB基因的目的片段大小相符（图1）.测序分析表明，所获得的YWHAB基因序列全长为973 bp，其中编码区（CDS）长度为741 bp.该CDS序列经比对确认无误，已提交至NCBI GenBank数据库，并获收录（登录号：PP453721.1）.

2.2 山羊YWHAB生物信息学分析

2.2.1 山羊YWHAB蛋白理化性质分析及氨基酸组成

ProtParam工具分析结果显示，YWHAB蛋白的理论等电点（pI）为4.76，分子量为28 082.40 Da，脂肪指数为75.41.半衰期评估结果表明，该蛋白在不同生物系统中表现出良好的稳定性：在哺乳动物网织红细胞体外系统中约为30 h，在酵母体内环境中大于20 h，而在大肠杆菌体内环境中也可维持在10 h以上.对该蛋白的稳定性评估结果显示，其不稳定指数（Ⅱ）为47.27，根据标准可判定其为不稳定蛋白.氨基酸组成分析显示，该蛋白含246个氨基酸，其中谷氨酸（Glu）含量最高（12.2%），而色氨酸（Trp）含量最低（表1）.与预测的YWHAB基因序列（XM_018 057 913.1）对比分析发现，存在三个核苷酸差异，差异均位于密码子第3位，由于遗传密码的简并性，氨基酸并未改变，最终二者的蛋白序列完全一致.

2.2.2 山羊YWHAB蛋白结构和位点预测

采用ProtScale分析山羊YWHAB蛋白的亲疏水特性，结果显示其平均亲水性系数（GRAVY）为-0.729，表明该蛋白为亲水性蛋白（图2A），通过SignalP（EBI server）预测表明，山羊YWHAB蛋白不存在信号肽结构（图2B），在结构域方面，利用TMHMM Server v.2.0进行跨膜结构预测，结果显示该蛋白不包含跨膜结构域，表明其为非跨膜蛋白（图2B），通过Sig⁃nalP预测表明，山羊 YWHAB 蛋白不存在信号肽结构（图3A），进一步使用NetPhos 3.1对该蛋白的磷酸化位点进行系统预测，共识别出42个潜在位点，包括19个丝氨酸、12个苏氨酸和11个酪氨酸位点（图3B）.上述结果表明，山羊YWHAB蛋白含有丰富的磷酸化位点，具备作为多种激酶底物并参与复杂细胞信号调控的潜力.

采用NovoPro分析山羊YWHAB蛋白的二级结构，结果显示其组成如下：α-螺旋占68.70%，无规则卷曲占21.95%，延伸链与β-转角分别占8.54%与0.81%（图4A）.利用SWISS-MODEL构建的三级结构模型，其构象与二级结构预测结果相符（图4B）.利用YinOYang 1.2预测发现，该蛋白存在31个潜在的O-糖基化位点（图5A），NetNGlyc 1.0预测结果显示，在第110、175和226位氨基酸处各有1个N-糖基化位点（图5B）.

2.2.3 山羊YWHAB亚细胞定位、系统进化树和互作蛋白预测分析

基于WoLF PSORT的亚细胞定位预测显示，山羊YWHAB蛋白主要分布于细胞质.进一步的定量分析表明，其在细胞质中的分布占比约为72%，而在细胞核和线粒体中分别约占17%和11%.结合TargetP与DeepLoc等工具的交叉验证支持，进一步确认了其胞质定位.基于MEGA 5构建的系统进化树分析表明，山羊YWHAB与绵羊的亲缘关系最近，与牛、鹿、羊驼和猪的亲缘关系依次递减（图6A）.通过STRING数据库进行的蛋白互作网络分析预测，YWHAB可能与FOXO3、TFEB、YAP1、WWTR1、YWHAZ、YWHAQ、BAD、RAF1、BRAF及ARAF等10个蛋白存在相互作用（图6B）.

3 讨论

YWHAB基因在人^{［9，13，19］}、鼠^{［10，14］}、猪^［16］和鸡^［20］上均有研究，但在山羊上暂无相关报道.本研究以简州大耳羊为研究对象，克隆得到山羊YWHAB基因CDS区741 bp，编码246个氨基酸残基.蛋白分子量为28 082.40 Da，为酸性不稳定亲水性蛋白，有42个磷酸化位点，涉及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；无信号肽、无跨膜区，推测该蛋白为非分泌性的胞内蛋白.二级结构结果显示该蛋白α螺旋占比较高，提示该蛋白的结构较稳定^［21］，STRING数据库预测YWHAB可能与FOXO3、TFEB、YAP1等10个蛋白存在相互作用，这些蛋白常被报道与信号通路调节、细胞凋亡的调控等相关.例如，宁紫帆^［20］研究发现，YWHAB作为miR-128-3p的关键功能靶点，通过互作使磷酸化的FoxO蛋白（如FoxO1/3/4）滞留于胞质，抑制其转录活性，从而促进鸡颗粒细胞的增殖；Xu Yang等^［22］研究结果显示，磷酸化的TFEB与14-3-3蛋白（如YWHAB）相互作用而被滞留于细胞质，干扰其互作会导致TFEB介导的下游靶基因及自噬活动异常激活；2025年，Lui Chang等^［23］研究发现，限制YWHAB介导的YAP细胞质保留是OCPM干性维持的关键机制，YAP将是抑制YWHAB限制引起的OCPM干性的治疗靶点；2023年，Thomas C Frost等^［24］在研究中提到，肿瘤细胞的神经内分泌特性与YAP1/WWTR1的活性呈负相关，激活YAP1或WWTR1可使其与TEAD形成复合物，该复合物能直接抑制大T抗原的表达，通过截断这一关键的促增殖信号，最终引发癌细胞周期停滞；2019年，王颖怡^［25］等研究表明，YWHAZ的下调可以抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖；2022年，朱海涛^［26］等发现，转染si-YWHAQ后，细胞迁移受到明显抑制，细胞凋亡率显著升高，14-3-3蛋白家族作为“分子胶水”，通过形成二聚体识别磷酸化蛋白，基于此特性，推测YWHAZ和YWHAQ等成员可能通过组建复合物来协同或竞争性地调控下游信号网络；2014年，姜浩^［27］等研究证实，YWHAB与RAF1存在直接相互作用，在胃癌模型中敲低YWHAB会导致磷酸化RAF1（P-Raf）水平下降，并抑制癌细胞增殖；尽管针对YWHAB与BRAF和ARAF直接互作的研究有限，但鉴于RAF家族成员与14-3-3蛋白结合机制的保守性，YWHAB很可能以类似方式调控BRAF和ARAF.综上所述，YWHAB不仅具有广泛的蛋白互作能力，还是多个关键信号通路的交汇点，充分体现了YWHAB在细胞信号转导中的核心地位.

YWHAB作为14-3-3蛋白家族中含量最高的成员，在抗病毒感染等过程中发挥重要作用.在抗病毒感染中，YWHAB通过与病毒的结构蛋白或非结构蛋白结合，显著影响病毒的复制和增殖^［28］.例如，YWHAB与PMV的5M蛋白相互作用抑制病毒粒子形成^［29］，与SVCV糖蛋白结合促进病毒侵入，与DENV非结构蛋白NS3竞争性结合阻断抗病毒信号传递，以及与PCV2的ORF5蛋白相互作用抑制病毒复制^［28］.以上研究提示YWHAB在多种病毒的复制过程中扮演重要角色.基于这些发现，我们推测YWHAB也可能参与调控ORFV的复制周期.

4 结论

本试验成功克隆山羊YWHAB基因（GenBank登录号：PP453721.1），CDS区全长为741 bp，共计编码246个氨基酸残基.山羊YWHAB基因与绵羊亲缘关系最近，其次为牛、鹿、羊驼、猪.YWHAB蛋白被预测与FOXO3、TFEB、YAP1、WWTR1、YWHAZ、YWHAQ、BAD、RAF1、BRAF、ARAF等10个蛋白有相互作用.

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基金资助

西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金-青年成长项目(ZYN2025036)