外泌体传递血管生成抑制蛋白-2参与乙肝后发生肝癌的机制

摘要

目的 分析肝细胞肝癌（HCC）患者血清中感染乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的HepG2(HepG2.2.15)细胞外泌体（Exo）微小RNA-200(miRNA-200)的表达情况，及HepG2.2.15细胞中血管生成抑制蛋白-2(VASH2)表达水平，探讨miRNA-200、VASH2在HepG2细胞侵袭、迁移中的作用。方法 选取HCC患者15例（研究组）和健康受试者15例（对照组），比较2组血清Exo miRNA-200表达水平。从HepG2.2.15细胞中分离出Exo，随后将其分为过表达组（转染miRNA-200 mimic）和阴性对照组（转染miRNA-NC），采用透射电镜、Westernblot和纳米颗粒跟踪进行Exo鉴定，采用qRT-PCR、Westernblot检测各组HepG2.2.15细胞中VASH2表达情况。在补充Exo的HepG2细胞中分析过表达Exo组（miRNA-200过表达组的Exo）和对照组（未转染组的Exo）细胞的增殖、迁移、侵袭及细胞周期情况。在转染后12、24、48、72 h采用CCK-8法评估HepG2细胞增殖率；在转染后24h采用Transwell法评估HepG2细胞迁移和侵袭数量；在转染后48 h采用流式细胞术分析细胞周期，采用Western blot检测VASH2蛋白表达水平。采用荧光素酶报告基因检测评估miRNA-200是否靶向VASH2。结果 与对照组相比，研究组血清Exo miRNA-200表达水平显著降低（P <0.01）。与阴性对照组相比，过表达组HepG2.2.15细胞的VASH2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P <0.01）。过表达Exo组与对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义（P> 0.05），过表达Exo组迁移细胞和侵袭细胞数量较对照组显著减少（P <0.01）,HepG2细胞在Exo过表达前后G1期、S期、G2期分布差异无统计学意义（P> 0.05），过表达Exo组VASH2蛋白的相对表达水平显著低于对照组（P <0.01）。与miR-NC+VASH2WT组相比，miRNA-200mimic+VASH2WT组的荧光素酶活性明显降低（P <0.01），而miRNA-200mimic+VASH2MUT组与miRNC+VASH2MUT组的荧光素酶活性比较差异无统计学意义（P> 0.05），表明miRNA-200靶向VASH2。结论 miRNA-200在HCC患者血清Exo中低表达，上调miRNA-200可抑制HepG2.2.15细胞VASH2表达，且过表达miRNA-200的HepG2.2.15细胞来源的Exo能够抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。

关键词

肝癌 / 乙肝病毒X蛋白 / 外泌体 / 微小RNA-200 / 血管生成抑制蛋白-2