miR-363-3p通过下调甲硫氨酸亚砜还原酶诱导子宫内膜间质细胞凋亡

miR-363-3p down-regulates MsrB3 expression and induces endometrial stromal cell apoptosis

摘要

背景 子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)严重危害女性健康，其发病机制尚未阐明。miR-363-3p是近年在多种癌症中发现的肿瘤抑制因子，可能参与EMs发病。 目的 分析miR-363-3p对子宫内膜间质细胞(endometrial stroma cells，EnSCs)增殖及凋亡的影响及其可能机制。 方法 体外培养EMs患者在位内膜EnSCs，采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p与甲硫氨酸亚砜还原酶B3(methionine sulfoxide reductase B3，MsrB3)结合能力。采用脂质体转染法构建miR-363-3p过表达模型，分为miR-363-3p过表达组、miR-NC对照组及miR-363-3p+MsrB3双转染组，Western blot法检测3组细胞的MsrB3蛋白表达变化，CCK8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡能力。 结果 双荧光素酶报告基因实验证实miR-363-3p与MsrB3具有结合能力；过表达miR-363-3p显著抑制MsrB3蛋白的表达水平(P＜0.001)，而对MsrB3 mRNA的表达无明显影响(P＞0.05)；miR-363-3p过表达使EnSCs增殖力下降(P＜0.01)及凋亡率升高(P＜0.01)，过表达MsrB3可逆转miR-363-3p所致细胞增殖力下降(P＜0.01)及凋亡率升高(P＜0.01)。 结论 MsrB3是miR-363-3p的靶基因，miR-363-3p可能通过调控MsrB3基因的表达降低子宫内膜间质细胞的活力。

Abstract

Background Endometriosis (EMs) seriously affects women's health, and its pathogenesis is still unknow. miR-363-3p is a recently identified tumor suppressor in a variety of cancers, and its effect on EMs pathogenesis has not been elucidated. Objective To analyze the effects of miR-363-3p on the proliferation and apoptosis of endometrial stromal cells (EnSCs) and to explore its possible underlying mechanisms. Methods In vitro culture of EnSCs derived from the eutopic endometrium of EMs patients was conducted. The binding ability between miR-363-3p and methionine sulfoxide reductase B3 (MsrB3) was detected using luciferase reporter assay. A miR-363-3p overexpression model was constructed via liposome transfection, and the cells were divided into miR-363-3p overexpression group, miR-NC control group, and miR-363-3p + MsrB3 co-transfection group. Changes in MsrB3 protein expression among the three groups were examined by Western blot. The proliferation and apoptosis capabilities of the three groups were assessed using CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. Results The dual-luciferase reporter assay confirmed that miR-363-3p could bind to MsrB3 (P＜0.001). Overexpression of miR-363-3p suppressed the protein expression level of MsrB3, but showed no significant effect on the mRNA expression of MsrB3 (P＞0.05). Overexpression of miR-363-3p resulted in decreased proliferative capacity (P＜0.01) and increased apoptotic rate (P＜0.01) of EnSCs. Furthermore, overexpression of MsrB3 reversed the miR-363-3p-induced reduction in cell proliferation (P＜0.01) and elevation in apoptosis rate (P＜0.01). Conclusion MsrB3 is a target gene of miR-363-3p, which may reduce the viability of endometrial stromal cells by downregulating MsrB3 expression.

Graphical abstract

关键词

子宫内膜异位症 / microRNA / miR-363-3p / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 甲硫氨酸亚砜还原酶B3 / 微小RNA靶向治疗

Key words

endometriosis / microRNA / microRNA-363-3p / cell proliferation / cell apoptosis / MsrB3 / miRNA targeted therapy

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)，也称内异症，是指子宫内膜腺体和间质在宫腔外生长、黏附和迁移，引起周期性出血。EMs是一种慢性系统性疾病，育龄期女性发病率为10% ~ 15%^[1]，影响全球约1.9亿妇女的健康^[2]。EMs的确切病因尚无定论^[3]。研究表明，多种微小RNA(microRNAs，miRNA)在EMs发病的多个环节中起重要作用^[4-5]。has-miR-363-3p是最近在多种癌症中发现的肿瘤抑制因子^[6]。前期研究通过高通量测序技术发现，与在位子宫内膜(eutopic endometria，Eu)相比，miR-363-3p在卵巢子宫内膜异位症中表达下调，而甲硫氨酸亚砜还原酶B3(methionine sulfoxide reductase B3，MsrB3)表达上调。TargetScan提示MsrB3是miR-363-3p的预测靶点，但miR-363-3p在子宫内膜异位症发病机制中的作用尚不明确。本研究的目的是验证miR-363-3p潜在靶基因MsrB3，探索miR-363-3p参与EMs发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 子宫内膜异位症患者子宫内膜间质细胞的分离、培养及鉴定

本研究通过解放军总医院第一医学中心医学伦理委员会审查并批准(编号：20140098)，所有患者均签署知情同意书。新鲜的子宫内膜标本存放于0.9%氯化钠溶液中，于30 min内带回实验室。磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，去除杂质。眼科剪将标本剪成小块(1 mm³)，磷酸盐缓冲液及培养液各洗涤1次，内膜组织转移至离心管中。加入3倍体积的Ⅲ型胶原酶，轻轻吹打，37℃摇床中孵育1 h。孵育完毕后，离心，弃上清，加入培养液重悬细胞。用200目滤器过滤，将滤液1 000 rpm，离心10 min，弃上清液。加入含10% FBS的培养液1 ~ 2 mL(视细胞量)，血球计数板计数，将细胞调整到1×10⁵/mL左右，转移至细胞培养瓶，37℃，5% CO₂培养箱中培养。第2天，子宫内膜间质细胞贴壁，进行换液，去除没有贴壁的杂质。1∶3比例传代培养，一般2 ~ 4 d后形成单层细胞，可供实验使用。采用Vimentin进行子宫内膜间质细胞(endometrial stroma cells，EnSCs)的免疫荧光纯度鉴定，经鉴定，细胞纯度达90%以上，可用于下一步体外实验。

1.2 EnSCs细胞转染实验分组

按照Lipofectamine 2000说明书添加适当比例转染试剂及核酸。实验分组：实验组在EnSCs细胞中加入miR-363-3p类似物(mimics)和Lipofectamine 2000；对照组加入阴性对照miR-NC(microRNA-negative control)和Lipofectamine 2000；空白对照组只加入Lipofectamine 2000；共转染组加入miR-363-3p类似物及pcDNA3.1-MsrB3。

1.3 双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p与MsrB3结合能力

通过生物信息学预测MsrB3 3’UTR(untranslated regions，UTR)与miR-363-3p的结合位点(MsrB3-Wt)并设计MsrB3 3’UTR的突变序列(MsrB3-Mut)，将合成的基因片段克隆入双荧光素酶报告基因载体pmirGLO，酶切及测序鉴定证实合成质粒基因序列正确。质粒转染24h后，使用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒(E1910)进行双报告基因检测。具体操作步骤参照Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书。

1.4 荧光实时定量PCR检测miR-363-3p及MsrB3 mRNA的表达水平

Trizol提取各组EnSCs总RNA，检测其纯度、浓度及完整性为合格样品，合成microRNA cDNA第一链，采用特异性茎环引物法，miR-363-3p第一链合成引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACTACAGAT。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(2×)试剂，miR-363-3p以U6为内参，MsrB3 mRNA以GAPDH为内参，行荧光实时定量PCR，每个样本实验重复3次。实时定量PCR引物序列见表1。

1.5 蛋白印迹检测MsrB3蛋白表达水平

用含PMSF的裂解液裂解30 min，提取贴壁细胞蛋白，考马斯亮蓝(Bradford)标准曲线检测蛋白含量，将等量蛋白加载到10%SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，孵育一抗：MsrB3(1∶1 000)；β-actin(1∶2 000)，4℃孵育过夜，孵育二抗：山羊抗小鼠(1∶2 000)；山羊抗兔(1∶2 000)，室温下50 min，发光，显影，将胶片进行拍照分析。

1.6 CCK-8法检测细胞增殖能力

将转染24 h后的细胞消化接种于96孔板，实验分组如下：转染miR-363-3p mimics组、转染miR-NC组和共转染miR-363-3p及pcDNA3.1-MsrB3组，每组设3个平行孔，0 h、24 h、48 h及72 h后，加入10 uL CCK-8试剂，用酶标仪测量细胞450 nm处吸光度。

1.7 流式细胞凋亡术检测EnSCs凋亡

实验分组同CCK-8实验部分，制成的细胞悬液依次加入5 μL Annexin V-FITC(避光轻摇30 min)、5 μL碘化丙啶，上机检测，实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布者以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，以P＜0.05(双侧检验)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-363-3p与MsrB3特异性结合

将miR-363-3p与pmicroGLO-MsrB3-野生组、pmicroGLO-MsrB3-突变组共转染EnSCs，利用双荧光素酶报告基因系统检测荧光信号变化来判断两者结合能力。结果表明miR-363-3p与pmicroGLO-MsrB3-Wt共转染组的荧光活性下降(P＜0.05)，而其余各组的荧光活性无明显变化，提示miR-363-3p能与MsrB3 mRNA 3’UTR特异性结合，从而抑制荧光素酶的表达(图1)。

2.2 miR-363-3p抑制MsrB3蛋白的表达

转染miR-363-3p mimics后，mimics组miR-363-3p的表达约为NC组的150倍，组间差异有统计学意义(P＜0.05)(图2)。转染miR-363-3p mimics后，用qRT-PCR法检测细胞中MsrB3 mRNA的表达变化，采用Western blot检测MsrB3蛋白表达的变化。结果表明miR-363-3p过表达后，MsrB3 mRNA的表达无显著变化(P＜0.05)(图3)，而MsrB3蛋白的表达显著下降(P＜0.001)；空白对照组与miR-NC组相比，MsrB3蛋白的表达无明显变化(图4)。

2.3 上调MsrB3后EnSCs增殖能力增强

上述结果表明在子宫内膜异位症中miR-363-3p可以特异性调控MsrB3的表达，MsrB3是miR-363-3p的靶基因。为了进一步验证miR-363-3p可能通过调节MsrB3的表达而发挥其抑制EnSCs增殖和促进EnSCs凋亡的作用。将miR-363-3p与MsrB3过表达质粒(pcDNA3.1-MsrB3)共转染EnSCs后，采用Western blot检测EnSCs中MsrB3蛋白的表达，采用CCK-8检测细胞增殖率，用流式凋亡实验检测细胞凋亡率。实验结果表明与NC组相比，仅转染miR-363-3p后，MsrB3蛋白含量下降，而miR-363-3p+MsrB3组细胞中MsrB3蛋白的表达升高(图5)，增高的MsrB3蛋白含量可使EnSCs的增殖及凋亡能力发生逆转，呈现出细胞增殖上调(P＜0.01)(图6)，细胞凋亡下调(P＜0.01)(图7)。上述结果表明EnSCs细胞增殖及凋亡能力与MsrB3蛋白含量相关，miR-363-3p可能通过调节MsrB3表达发挥其抑制EnSCs增殖和促进EnSCs凋亡的作用。

3 讨论

微小RNA(microRNAs，miRNA)是一类内源性非编码RNA，广泛存在于真核细胞中，参与调节多种生理及病理过程^[7-8]。miRNA主要通过与靶基因的3’非编码区结合，在转录后水平调控基因表达，从而参与许多重要的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、代谢和免疫应答^[9]。

子宫内膜异位症是妇科常见病，严重危害育龄期女性的健康，已有相关文献报道miRNAs在子宫内膜异位症发病的多个环节发挥重要作用^[10]。已有证据表明，大量miRNA在EMs中异常表达，参与调节下游基因的表达并影响内异症发病过程中多个生物学过程^[8]。例如，子宫内膜异位症中miR-331、miR-335、miR-891、miR-548、miR-124、miR-148、miR-215、miR-192、miR-337、miR-153、miR-155、miR-144、miR-221和miR-3688存在表达失调，可能与后续恶变为卵巢癌相关^[11]。在子宫内膜异位症中，miRNA-1229-5p通过STMN1/p38 MAPK轴促进子宫内膜细胞的迁移和侵袭，抑制细胞凋亡^[12]。据报道，miR-363-3p通过靶向抑制PTEN降低乳腺癌细胞对他莫昔芬的反应性，其机制与PI3K-Akt通路相关^[13]。Ghafouri-Fard等^[14]的研究表明miR-363-3可以与lncRNA OIP5-AS1相互作用从不同途径影响肿瘤的发生。Huang等^[15]的研究发现LINC01550/miR-363-3p调控网络在子宫内膜异位症细胞的细胞质中显著上调，通过靶向沉默LINC01550或过表达miR-363-3p显著减弱内异症细胞增殖和迁移，同时诱导细胞凋亡。

早先有研究采用高通量测序的方法建立了EMs中差异性miRNA和mRNA表达谱，再通过生物信息学方法建立了EMs特异性miRNA-TF-gene调控网络，筛选出一系列差异表达的miRNAs、转录因子(transcription factors，TF)及靶基因。测序结果显示has-miR-363-3p在异位病灶中显著下调，提示可能参与子宫内膜异位症的发病^[16]。目前所知，miR-363-3p在内异症中的作用机制未见报道，因此本研究选择miR-363-3p作为研究对象。前期有实验选取30例在位内膜组织，37例异位内膜组织，qRT-PCR结果表明miR-363-3p在异位内膜中的表达水平显著低于在位内膜，miR-363-3p过表达能显著增加EnSCs的凋亡率，削弱其增殖能力^[17]。本研究拟验证miR-363-3p可能的靶基因及对EnSCs产生的影响。前期生物信息学分析已经筛选出一系列miR-363-3p的潜在靶基因。其中，MsrB3是miR-363-3p的潜在靶基因之一，且高通量测序结果显示MsrB3在异位内膜中呈高表达^[16]。

MsrB3是一种蛋白修复酶，能够催化甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，从而发挥抗氧化作用，修复肿瘤介导的DNA损伤^[18]。NCBI基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)显示：与其他组织相比，MsrB3在子宫内膜组织中的表达最为丰富。有研究表明，MsrB3的抗氧化活性是维持内耳角质板结构和毛束完整性所必需的^[19]。Ge等^[20]发现过表达miR-874-3p可通过下调MsrB3来诱导HK-2细胞凋亡，而上调MsrB3可逆转这一作用，这一机制可能在急性肾损伤中发挥作用。MsrB3是近年来被发现的一种抗凋亡因子，缺乏MsrB3将导致肿瘤细胞凋亡，而过表达将刺激肿瘤细胞增殖^[21]。Kwak等^[22]报道MsrB3的缺乏使内源性线粒体凋亡途径激活，Bax/Bcl-2b比例上调，细胞色素C(cytochrome C)和caspase表达增加，导致肿瘤细胞凋亡。Ye等^[23]报道MsrB3通过调节内质网应激促进肾透明细胞癌的发展。以上证据均表明MsrB3可能在子宫内膜异位症细胞凋亡中起到一定的作用。众所周知，内异症作为一种妇科良性疾病，又被称为“不死的癌症”，具有浸润生长、极易复发、转移等生物学特点，但尚无细胞的异质性^[24]。2017年发表在《自然·医学》上的一篇文献表明，MsrB3可以通过提高干细胞基因组的稳定性而抑制正常细胞向肿瘤细胞转化^[25]。由此推测，高表达的MsrB3抑制内膜细胞的凋亡，同时抑制其向肿瘤细胞转化。

在本实验中，双荧光素酶报告实验表明miR-363-3p能与MsrB3特异性结合，这与前期生物信息学预测结果一致。在植物中，miRNA主要通过切割降解mRNA来调控基因的表达，而在动物中，miRNA主要通过抑制mRNA的翻译发挥作用^[26]。本实验中，在EnSCs中上调miR-363-3p的表达能够抑制MsrB3蛋白的表达，但对MsrB3 mRNA的表达无明显影响，表明miR-363-3p通过抑制MsrB3 mRNA的翻译发挥作用。本实验从结合能力、功能分析两方面验证了MsrB3是miR-363-3p的直接靶基因，miR-363-3p能够与MsrB3特异性结合并调节其蛋白的表达。此外，MsrB3的过表达能逆转miR-363-3p引起的细胞凋亡增加、增殖减少，更进一步说明了miR-363-3p通过调节MsrB3的表达使细胞增殖能力减弱、凋亡增加。MsrB3作为一种抗凋亡因子已被证实在肿瘤细胞中发挥作用，但其在内异症中的作用还鲜有报道，本研究提示MsrB3过表达与EnSCs增殖异常相关，具体机制尚待进一步验证。

本研究仅围绕体外细胞模型开展机制与功能验证，未进一步通过动物实验进行体内验证。体外细胞培养体系无法模拟体内复杂的微环境，导致研究结论在体内相关性与临床转化价值有待进一步确认，需后续通过动物实验补充验证。

综上，miR-363-3p通过调节MsrB3表达而抑制EnSCs增殖，促进EnSCs凋亡，从而在子宫内膜异位症的发病中发挥作用。目前，关于miRNA在子宫内膜异位症中的作用研究众多，但仍无法整合这些作用，从而全面揭示miRNA的调控网络^[27]。因此，期待在生物信息学及实验技术等多学科的联合发展下，早日揭开子宫内膜异位症病因学的神秘面纱。

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